Name: 二斑叶螨的应用二斑叶螨植物病虫害的相互作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习使用二斑叶螨快速收集与植物侵染技术，通过画笔或真空泵将雌螨接种到实验植物，并采用网格法量化叶片损伤面积。该方法可高效评估不同植物品系对螨害的敏感性差异，为植物病虫害互作研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本项目由加拿大政府通过基因组加拿大（Genome Canada）和安大略基因组研究所（OGI-046）以及安大略研究基金——基因组学与生命科学全球领导力计划 GL2-01-035（资助对象：M.G. 和 V.G.）资助。T.V.L. 是弗兰德斯科学研究基金（FWO）的博士后研究员。

1. 螨虫种群的维持
注意：蜘蛛螨在加州红芸豆（Phaseolus vulgaris）上进行培养。
<ol>
	<li>在接种前 2-3 周从种子开始培养菜豆植株。</li>
	<li>将这些植株与已感染的植株混合；成年螨虫会迅速定殖到新鲜的植物材料上。</li>
	<li>每 7-10 天移除一次旧的感染菜豆植株，&#160;并更换为新鲜植株。</li>
</ol>
2. 收集成年雌性螨虫
<ol>
	<li>采用洗涤法收集螨虫
	<ol>
		<li>为采集螨虫，在实验前1至2天将一株新鲜的豆科植物与已感染的植物接触。</li>
		<li>使用20至30株新鲜的豆类植株收集1,000至2,000只成年雌性螨虫。</li>
		<li>使用室温自来水配制0.001%的Tween 20溶液。</li>
		<li>用吐温20溶液清洗生虫的豆科植物，使用2&#160;至 3&#160;植物在某一阶段&#160;时间。</li>
		<li>每株植物清洗2-3次，以收集叶片上的全部螨虫。</li>
		<li>在10分钟内完成步骤2.1.4&#160;以避免螨虫死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过特定孔径筛网过滤悬浮液分离成年雌性螨虫
	<ol>
		<li>准备以下孔径的筛网：500 µm（用于去除杂质）和 300 µm（用于收集雌性成年螨虫）图&#160;1A).</li>
		<li>将悬液通过500 µm筛网过滤。</li>
		<li>将悬液再次通过300 µm筛网过滤，成年雌性螨虫将被截留。</li>
		<li>将带有成年雌性螨虫的300 µm筛子浸入干净的自来水中，以去除Tween 20。</li>
		<li>将螨虫在筛子底部平铺成单层。</li>
		<li>用纸巾擦去筛网和筛子侧面多余的水分。注意：这样做的目的是让螨类快速干燥，以便恢复。</li>
		<li>按图示准备组装装置 图&#160;1B；这将允许螨虫自由移动，但能防止其逃逸。</li>
		<li>将装有螨虫的筛子置于用作支撑的筛子上方。</li>
		<li>用清水包围底部筛网，以防止螨虫扩散。注意：螨虫约5分钟后开始恢复活动。约30分钟后，活动螨虫的数量已足够开始收集。图&#160;1D）。应在1小时内收集螨虫，因为它们会分泌丝状物，干扰收集过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 螨虫侵染植物
注意：一旦成年雌性螨虫恢复活力，即可用于植物接种。共有2种&#160;用于将成年雌性螨虫接种至实验植物的方法：a）使用细毛刷（方案第3.1节）和b）使用泵或真空管线（方案第3.2节）。
<ol>
	<li>使用毛刷进行螨虫接种 
	注意：使用毛刷接种螨虫适用于每株植物接种不超过30只螨虫的情况。
	<ol>
		<li>使用00号或更细的软毛圆形画笔。</li>
		<li>用室温自来水润湿毛刷。</li>
		<li>用刷尖轻轻从筛网上拾取螨虫，并将其转移至植物上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抽吸装置进行螨虫接种 
	注意：当接种螨虫数量超过30只时，可采用通过抽吸装置收集螨虫进行植物接种的方法。本方法可使用用于拾取微电子元件的真空泵或真空管线。保持气流稳定且强度足够（2–4 psi）至关重要。
	<ol>
		<li>使用底部被切开的1.5 ml&#160;离心管作为连接泵或真空管与吸头之间的适配器，将1 ml&#160;移液器吸头连接到与泵或真空管线相连的管子上。</li>
		<li>在移液器吸头与适配器（1.5 ml&#160;离心管）之间放置一小片纸巾。注意：此步骤的目的是在抽吸过程中将螨虫截留在移液器吸头内，同时降低气流强度（图&#160;1C）。</li>
		<li>直接使用移液器吸头从筛网上收集螨虫。</li>
		<li>或者，在体视显微镜下逐个从已感染的叶片上收集螨虫。</li>
		<li>收集到所需数量的螨虫后，将移液器吸头从管子上取下，注意确保吸头后端的纸巾保持原位不动。</li>
		<li>通过轻敲移液器吸头使螨虫聚集在一起，然后将其放置于叶片上；数秒内，螨虫即开始在叶片上扩散。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 记录与评估植物损伤
<ol>
	<li>记录植物损伤 
	注意：对于 A. thaliana，4天后评估植物损伤情况&#160;螨虫取食天数。损害记录为&#160;黄化斑点的总面积。为了测量损伤程度，将整株莲座叶切除并进行扫描。所述扫描参数适用于Epson V30扫描仪，但可作为其他类似平板扫描仪的良好起始设置。所有实验应保持扫描参数一致，以便不同实验运行之间进行比较。
	<ol>
		<li>用透明胶片覆盖扫描仪床面，以防止植物材料污染扫描仪表面。</li>
		<li>切割整株莲座叶，将其放置在扫描仪载物台上，使叶片的近轴面（上表面）朝向扫描仪的光源和感光元件。若莲座叶过于密集，导致无法在无重叠的情况下完整获取各叶片图像，可先用精细剪刀将莲座叶分解为单个叶片或互不重叠的叶片组，再置于扫描仪载物台上。可同时扫描多个莲座叶。</li>
		<li>用一张白纸覆盖莲座叶或叶片，以防止其粘附并污染扫描仪盖板。</li>
		<li>关闭扫描仪盖，按以下参数进行扫描：分辨率：1,200 dpi；色彩模式：Adobe RGB；亮度：+25；文件类型：最高质量 JPEG。</li>
		<li>保存图像文件以供后续损伤分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>植物损伤量化 
	注意：损伤面积使用 Photoshop 手动计算。由于植株叶片形状差异较大，且因螨类取食导致的症状颜色强度变化显著，自动计算方法不可靠。因此，采用网格法评估植物损伤程度：
	<ol>
		<li>使用 Photoshop 打开植物图像。</li>
		<li>新建一个图层，然后将扫描图像叠加到一个划分为 0.25 mm × 0.25 mm 网格的网格上（视图或显示 – 显示 – 网格，键盘快捷键 Ctrl + ‘）。</li>
		<li>在叠加图层上，使用点标记受损叶片区域（使用“铅笔工具”，键盘快捷键为 B）。对于下方网格中受损面积超过单个网格单元一半的区域，每个网格仅用一个点表示。点的大小以像素为单位定义。即， 每点 52 像素。</li>
		<li>当网格中所有显示植物损害面积至少覆盖网格单元一半的方格均已被标记点标记后，使用直方图工具（窗口 - 直方图）确定该图层上的总像素数。直方图工具可用于测量像素数量。由于每个标记点均由恒定且已知数量的像素表示，因此直方图工具所测得的总像素数即代表标记点的总数，进而表示已标记方格的总数。</li>
		<li>使用以下公式计算标记的“点”数量： 
		点的数量 = 总像素数 / 每点像素数。</li>
		<li>通过将图像上标记的点数乘以单个点的面积来计算损伤总面积&#160;网格的一个方格，因为一个点对应于网格的一个方格。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJeppson%2C+LR+%22Mites+injurious+to+economic+plants%22">Mites injurious to economic plants</a>. , University of California Press. (1975).</li>
<li>Migeon, A., Dorkeld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Mites+Web%3A+a+comprehensive+database+for+the+Tetranychidae%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.montpellier.inra.fr%2FCBGP%2Fspmweb%22%5BJournal%5D)">Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae.</a> http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).</li>
<li>Croft, B. A., Vandebaan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+and+Genetic-Factors+Influencing+Evolution+of+Pesticide+Resistance+in+Tetranychid+and+Phytoseiid+Mites%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites.</a> Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).</li>
<li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+heteroplasmy+and+the+evolution+of+insecticide+resistance%3A+Non-Mendelian+inheritance+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).</li>
<li>Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acaricide+resistance+mechanisms+in+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae+and+other+important+Acari%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review.</a> Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).</li>
<li>Dermauw, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+gene+family+of+Tetranychus+urticae%3A+Implications+for+acaricide+toxicology+and+a+novel+mutation+associated+with+abamectin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance.</a> Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).</li>
<li>Van Leeuwen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+bulk+segregant+mapping+uncovers+resistance+mutations+and+the+mode+of+action+of+a+chitin+synthesis+inhibitor+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).</li>
<li>Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+pair-rule+gene+homologues+in+a+chelicerate%3A+early+patterning+of+the+two-spotted+spider+mite+Tetranychus+urticae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae.</a> Development. 129, 5461-5472 (2002).</li>
<li>Khila, A., Grbic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+the+spider+mite+Tetranychus+urticae%3A+dsRNA+and+siRNA+parental+silencing+of+the+Distal-less+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene.</a> Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).</li>
<li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mity+model%3A+Tetranychus+urticae%2C+a+candidate+for+chelicerate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).</li>
<li>Grbic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Tetranychus+urticae+reveals+herbivorous+pest+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations.</a> Nature. 479, 487-492 (2011).</li>
<li>Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+quantitative+trait+loci+controlling+glucosinolates%2C+myrosinase+and+insect+resistance+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 161, 325-332 (2002).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+jasmonate+in+response+and+tolerance+of+Arabidopsis+to+thrip+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding.</a> Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).</li>
<li>Whiteman, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plant-herbivore+interface+with+a+leafmining+Drosophila+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+ecology%22%5BJournal%5D)">Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis.</a> Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).</li>
<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+indole+glucosinolate+breakdown+products+with+antifeedant+effects+on+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid).</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Adio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+defensive+function+of+Ndelta-acetylornithine%2C+a+jasmonate-induced+Arabidopsis+metabolite%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite.</a> Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+homolog+of+CORONATINE-INSENSITIVE1+is+required+for+the+maternal+control+of+seed+maturation%2C+jasmonate-signaled+defense+responses%2C+and+glandular+trichome+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development.</a> Plant Cell. 16, 126-143 (2004).</li>
<li>Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+spider+mite-induced+direct+and+indirect+defenses+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants.</a> Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

本视频演示了用于分离并用大量成年雌性螨虫侵染植物的实验方案。尽管我们以拟南芥（A. thaliana）为例展示了该方案，但它适用于任何植物与叶螨的互作系统，目前也已成功应用于番茄和葡萄（Vitis vinifera）植株。该方案可获得可重复的实验结果，表明所收集的螨虫处于相似的生理状态（图&#160;3）。
尽管这些方案操作简单，但有几个关键步骤需要特别注意，因为它们会影响螨虫的回收率。从叶片上冲洗螨虫时，必须同时在最多三株豆科植物上进行，并且必须在10分钟内完成。&#160;使用室温水。此外，需将螨虫铺展在筛子上以实现快速干燥。若螨虫回收率不理想，重要的是检查是否使用了推荐量的Tween 20洗涤剂，并确认在冲洗步骤中是否已将洗涤剂彻底去除。
本方案存在两个主要局限性：a) 使用泵收集螨虫适用于收集30只以上的螨虫，但若需收集较少数量的螨虫，则必须使用毛刷，效率相对较低；然而，通过冲洗法收集并富集成年螨虫可显著提高其应用便利性；b) 通过评分褪绿斑表面损伤...

植物与害虫的相互作用是一个具有重要科学和经济意义的研究课题。历史上，该领域研究既使用农作物（如番茄），也使用模式植物A. thaliana。在这两类系统中，植物对植食性害虫的敏感性均可通过直接评估害虫取食后的植物表型，或间接评估害虫自身的表现来测定。
以往已采用多种方法对多种昆虫害虫种类的植物感病性进行直接测定。例如，鳞翅目幼虫的取食危害可通过肉眼借助方格网估算Plutella xylostella（小菜蛾）&#160;或Trichoplusia ni（甘蓝夜蛾）&#160;取食的植物组织比例来进行测量12。此外，也有利用叶片损伤的数字成像并结合后续定量图像分析的方法。此类方法已被用于研究A. thaliana与Frankliniella occidentalis（西方花蓟马）13、Scaptomyza flava（潜叶蝇）14以及T. ni15的相互作用。
植物感病性的间接测定方法在植物与害虫互作研究中被广泛使用。例如，通常通过分析害虫繁殖力以及植物互作后的整体形态变化来评估A. thaliana对桃蚜Myzus persicae取食的感病性16,17。另一个典型的A. thaliana对害虫感病性的间接指标是测定植食性昆虫的干重或鲜重。该参数常用于表征鳞翅目昆虫（如Pieris rapae（小菜蛾）、P. xylostella或T. ni）在幼虫或蛹期的取食情况15,17。
蜘蛛螨是细胞内含物取食者。螨害症状表现为一系列黄化斑点，颜色从白色至浅绿色不等。此前对植物宿主对蜘蛛螨取食的敏感性评估，主要通过间接方式，即分析接种螨虫数天后其种群表现来进行18,19或直接利用植株在被侵染数周后的整体形态学特征18 或对暴露于螨虫数天的叶片进行数字成像，随后进行自动图像分析19这些方法正在被开发并用于研究番茄植株之间的相互作用 T. urticae 和&#160;通常使用少量叶螨（每处理5-15头），从混合螨群中采集，并用软毛刷将其转移至叶片表面。然而，这些方法不适用于需要施用较大量螨的研究。此外，尽管可直接在图像分析软件（如Adobe Photoshop（San Jose, CA）或ImageJ）中处理叶片图像20 可用于番茄损伤分析，但这些方案需要修改后才能应用于表面反射率更高、颜色较浅且具明显腺毛的叶片例如,&#160;A. thaliana）会干扰自动识别标记植物损伤的黄化斑点。此外，先前方法可有效利用的螨虫发育阶段仅限于最常见且易于识别的成年雌螨，无法利用其他发育阶段。
实现植物与叶螨互作高通量分析的首要关键步骤是建立可重复、简单且稳健的实验方案，用于以叶螨侵染植物，并可靠地评估互作结果。
本视频介绍了一种快速高效收集大量成年雌性螨虫的简便方法，以及将其应用于实验植物寄主并评估因叶螨取食造成的植物损伤的实验方案。本方案可快速高效地收集数百个处于任何发育阶段（卵、幼虫、若虫、成年雄虫和雌虫）的个体，用于后续实验操作。此外，这些方法可适用于任何螨虫寄主植物，但本文以拟南芥（A. thaliana）为例进行具体演示。

<table><tbody><tr><td>植物材料：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加州红肾豆</td><td>Stokes, Thorold, ON, 加拿大</td><td></td><td>2周龄，使用前2至3天用叶螨充分侵染。其他品种的 &lt;em&gt;菜豆&lt;/em&gt; 可以使用。</td></tr><tr><td>化学品：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>1% 储备液的配制旨在简化分装操作</td></tr><tr><td>自来水</td><td></td><td></td><td>在室温下，热休克和冷休克影响螨类的存活率和生理表现</td></tr><tr><td>其他材料和设备：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀组</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛网组</td><td>自行生产</td><td></td><td>详细的说明可获取</td></tr><tr><td>细刷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td>0.2 和 1 ml</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>空气泵</td><td></td><td></td><td>水族箱型泵，带倒置气流。可使用真空管路。所需压降约为 2-4 psi</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>Epson</td><td>V30</td><td>任何能够对扫描质量进行必要控制的平板扫描仪。我们的实验使用 Epson V30。</td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td>兼容扫描仪硬件和 Adobe Photoshop 软件的 Windows 或 OS X 电脑。</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 软件</td><td>Adobe Systems Inc.，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td>各种</td><td>包含直方图工具的任意版本。</td></tr></tbody></table>

二斑叶螨 tetranychus urticae 在植物-害虫互作研究中的应用

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

二斑叶螨， 二斑叶螨，是一种常见的多食性节肢动物植食者，能够取食种类极为广泛的植物，其中包括超过150种具有经济价值的作物。它是温室作物的重要害虫，尤其在 茄科 和 葫芦科 (例如番茄、茄子、辣椒、黄瓜、西葫芦）和温室观赏植物（例如玫瑰、菊花、康乃馨）、一年生大田作物（如玉米、棉花、大豆和甜菜）以及多年生作物（苜蓿、草莓、葡萄、柑橘和李子）1,2除了其极强的多食性使其成为重要的农业害虫外， T. urticae 容易对用于其防治的多种杀虫剂和杀螨剂产生抗性3-7.
T. urticae 是一种优秀的实验生物，因其生命周期短（在27°C下为7天），且可在实验室中以高密度轻松培养。检测基因表达的方法（包括 原位 杂交与抗体染色）以及利用RNA干扰技术失活植食螨内源基因表达的方法已被建立8-10. 近年来，全基因组序列 T. urticae 已有报道，这为将该害虫植食性昆虫发展为模式生物创造了机会，使其具备与其部分寄主植物中已有的基因组资源相当的条件（拟南芥 和&#160;番茄 Solanum lycopersicum)11. 综上所述，这些&#160;模式生物有助于揭示植物与害虫相互作用的分子基础。
本文介绍了一种高效、快速且简便的方法，用于大量采集成年雌性螨虫，将其应用于实验植物寄主，并评估由于叶螨取食造成的植物损伤。本方案可实现对各个发育阶段（卵、幼虫、若虫、成年雄螨和雌螨）数百个个体的快速高效采集，采集的螨虫可用于后续实验处理。

使用20至30株被侵染的豆科植物，可通过筛分法收集约2,000只成年雌性螨虫。若使用毛刷转移螨虫，将每株植物接种20只螨虫，接种10株植物所需时间约为15分钟。收集与施用方法的组合方式见图2。
本方案可产生可重复的植物损伤结果，表明所收集的螨虫具有相似的生理状态，适用于植物与蜘蛛螨互作研究（图3A）。为评估该方案的可重复性，采用冲洗法收集成年雌性螨虫，将20只螨虫用湿润的刷子转移至4周龄A. thaliana植株（生态型Col-0）的莲座叶上。处理后的植株在接种4天后进行扫描，并利用上述方法量化损伤面积。重复实验结果的比较采用方差分析（ANOVA）进行。
作为实验应用的一个示例，我们通过在每株植物上使用湿毛刷接种20只雌性蜘蛛螨，并在感染后4天记录植株受损情况，评估了3个A. thaliana生态型对蜘蛛螨取食危害的自然抗性变异。扫描图像中典型的损伤表型如图3B所示。随后，可将损伤数据以柱状...

为开展植物-害虫互作研究，已建立高效制备均一性二斑叶螨样本、实验植物接种及植物受害程度评估的实验方案。

二斑叶螨 Tetranychus urticae 在植物-害虫互作研究中的应用

二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种广泛分布的多食性节肢动物植食者，能够取食种类极为广泛的植物，包括……

本实验的总体目标是快速且可靠地收集处于特定发育阶段的蜘蛛螨。首先，将豆科植物作为螨虫的培养基质进行饲养。随后，根据需接种到单株植物上的螨虫数量，使用毛笔或喷雾泵将雌性螨虫接种到实验用植物上。最后一步是使用图形编辑软件中的网格法进行人工植物损伤量化。最终通过统计分析来展示不同植物品系或生态型对二斑叶螨的差异性敏感程度。该技术相较于现有方法的优势在于，它提供了一种高效的方法，可快速、简便地收集大量成年雌性螨虫，将其接种到实验植物寄主上，并评估由螨虫取食引起的植物损伤。本方案可实现对任意发育阶段的数百个个体进行快速高效地采集，采集的样本可用于后续实验操作。在接种前两到三周，先将加州红肾豆种子培育成植株，并将这些植株与已感染的植株混合。成年螨类会迅速定殖于新鲜的植物材料上。每隔 7 到 10 天移除一次受虫害的豆科植物，并更换为新鲜植株，以通过清洗法收集螨虫。在实验前 1 至 2 天，将一株新鲜豆科植物与受虫害植株接触。使用 20 至 30 株新鲜豆科植物收集 1000 至 2000 只成年雌性螨虫。在实验当天，剪取螨虫。将受侵染的菜豆植株基部浸入0.001%吐温20溶液中，每次清洗两到三株，以去除植株上的螨虫。每株植物需清洗两到三次，以收集叶片上所有的螨虫。在10分钟内完成操作，以避免螨虫死亡。接下来，准备一个500微米的筛网用于去除杂质，再准备一个300微米的筛网用于收集雌性成螨。先将悬浮液通过500微米筛网过滤，然后重新加入悬浮液并通过300微米筛网收集。若筛网上积聚过多泡沫，则雌性成螨会被截留。可用缓慢流动的室温自来水轻轻冲洗螨虫，将装有雌性成螨的300微米筛网在干净的自来水中浸洗，以去除Tween 20，然后将螨虫在筛网底部平铺成单层。用纸巾擦去筛网和筛子侧面多余的水分，以便螨虫能够快速干燥并恢复活力。接下来，将装有螨虫的筛子放在作为支撑的另一个筛子上方。在下方的筛子周围加水，以防止螨虫散失。这将使螨虫能够自由移动，同时防止其逃逸。使用毛刷进行叶螨接种时，每株植物可接种最多30只螨虫。应使用软毛、圆形、00号或更细的画笔。用室温自来水润湿毛刷，轻轻蘸取筛网上的螨虫，并用刷尖将其转移到植物上。当接种螨虫数量超过30只时，可使用泵抽真空装置收集的螨虫来完成植物接种。该方法中，使用一个1.5毫升离心管，将1毫升移液枪头连接至与泵或真空管路相连的管子上。在离心管底部进行切割，作为泵的真空管与移液枪头之间的接头，并在移液枪头与接头之间放置一小片纸巾。这样做的目的是在吸取过程中将螨虫截留在移液枪头内，同时减小气流，以便使用移液枪头直接从筛子中收集螨虫。或者，使用体视显微镜从受侵染的叶片上逐个收集螨虫。当收集到所需数量的螨虫后，将移液器吸头从离心管中取出，注意确保移液器吸头后端的滤纸片保持原位不动。通过轻敲移液器尖端使螨虫聚集在一起，收集螨虫。然后将其放置在叶片上。数秒内，螨虫将开始在叶片上分散。为记录植物损伤情况，使用透明薄膜覆盖扫描仪玻璃板，以防止植物材料污染扫描仪表面。剪下完整的莲座状叶片，并将其放置在扫描仪玻璃板上。因此，叶片的上表面应朝向扫描仪。光源和捕获元件可同时扫描多个莲座状叶丛。或者，若莲座状叶丛过于密集，导致无法在无重叠的情况下获取单个叶片，则可在将其放置于扫描仪前，使用精细的剪刀将莲座状叶丛解剖为单个叶片或无重叠的叶片组。用一张白纸覆盖苗床中的莲座叶或叶片，以防止其粘附并污染扫描仪盖板。关闭扫描仪盖板，以1,200 DPI的分辨率进行扫描，亮度设置为+25，文件类型设置为最高质量的jpeg格式。保存图像文件，用于后续的损伤分析。为了量化植物损伤，使用 Photoshop 打开植物图像。创建一个新图层，然后将扫描图像与点阵网格（25 毫米 × 25 毫米）叠加。在叠加图层上以25毫米为间隔进行划分。使用铅笔工具以点标记受损的叶片区域。对于网格中受损面积超过一半的每个方格，仅使用一个点进行标记。该尺寸以像素定义。当网格中所有显示植物损伤且覆盖至少一半网格单元的方格均被标记上点时，使用直方图工具确定代表点数图层上的像素数量，进而得出被标记方格的总数。通过将总像素数除以每个点的像素数来计算标记点的数量。将图像上标记点的数量乘以网格中方格的面积，得到损伤总面积，因为每个点对应网格中的一个方格。该图显示了在三周龄的AANA植株上测得的损伤面积。接种20只雌性叶螨后第4天。植物损伤结果具有可重复性，表明所采集的叶螨生理状态相似，适用于植物与叶螨互作研究。该图显示了在三周龄AANA植株上接种20只雌性叶螨后第4天测得的损伤面积。作为实验应用的一个示例，通过每株植物接种20只雌性红蜘蛛并使用湿毛刷涂抹，评估了三个aana品系在自然变异性和对红蜘蛛（orry）敏感性方面的差异，并在感染后四天记录植株受损情况。损伤数据的量化结果可用柱状图或箱形图表示，并采用适当的统计方法进行分析。在此示例中，不同品系对红蜘蛛或bry的敏感性存在显著差异。分离和接种步骤可在30分钟内完成，具体时间取决于样本数量和工作流程的选择。需要注意的是，螨虫在20溶液中浸泡时间不应超过10分钟。利用种子系统进行分离可用于获取处于不同发育阶段的螨虫组分，这些组分不仅可用于害虫与植物互作领域的实验，还可用于发育生理学和分子生物学等多方面的研究。

application-two-spotted-spider-mite-tetranychus-urticae-for-plant

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

二斑叶螨的应用<em&gt;二斑叶螨</em&gt;植物病虫害的相互作用研究

本文展示并讨论了用于调查节肢动物害虫对触杀型和内吸型杀虫剂的敏感性及检测其抗药性的技术。...

监测昆虫抗药性的生物测定方法

本视频讲解了寄主植物对草食性害虫的抗性机制，并演示了一种非选择性试验，用于评估抗生作用和耐受性在Brachiaria spp.

表征食草动物抗性机制：沫蝉在 Brachiaria 以 spp. 为例

本论文描述了一种多光谱光学传感器，该传感器能够有效检测人工接种了不同密度二斑叶螨种群的早季棉花所遭受的损害。...

温室棉花中二斑叶螨危害的遥感评估

本文报道了基于知识开发高效真菌杀虫剂所涉及的不同阶段，包括分离、鉴定、筛选和选择最适昆虫病原真菌——金龟子绿僵菌（Metarhizium...

发展 绿僵菌 作为一种真菌杀虫剂：从分离到田间表现

生命表可用于量化昆虫种群中死亡率的来源和速率，有助于理解、预测和调控农业生态系统中的种群动态。本文介绍了针对具有固着性未成熟发育阶段的昆虫，在田间开展和分析基于同生群的生命表的方法。...

以棉花中烟粉虱 Bemisia tabaci 为模型系统建立田间固着性昆虫生命表的方法学

本文介绍了一种在田间试验中，通过多个时间点测定作物中蓟马数量及其天敌小花蝽捕食性天敌数量的实验方案。同时展示了如何评估防治蓟马措施的效果，并分析小花蝽捕食作用所带来的生态效益。...

用于田间试验中估算Frankliniella属花蓟马与Orius属捕食性天敌种群的取样方法

微型计算机断层扫描（Micro-CT）是一种非破坏性工具，可用于三维分析植物结构。本实验方案描述了利用微型计算机断层扫描分析寄生植物结构与功能所需的样品制备方法。通过使用不同物种，展示了该方法在结合特定样品制备技术时的优势。...

利用微计算机断层扫描技术分析寄生植物与寄主的相互作用

本方案介绍了一种优化的离体叶片生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）对孤雌生殖昆虫芥菜蚜（Lipaphis erysimi...

评估昆虫病原真菌对孤雌生殖昆虫芥菜蚜虫 Lipaphis erysimi (Kalt.) 的杀蚜效果

本文介绍了一种利用聚乙烯薄膜和氨基酸溶液制备的人工寄主提取Trichogramma...

利用人工寄主从寄生蜂Trichogramma dendrolimi中提取毒液

建立了一种用于大规模饲养辣椒蓟马的离体叶片生物测定方案，该方法采用含琼脂玻璃容器中的改良离体叶片法，可确保高存活率和发育同步化。该系统能够高效筛选昆虫病原真菌对2nd龄幼虫的毒力，并为实验室、温室及田间评价提供稳定的蓟马种源。...

建立辣椒蓟马（Scirtothrips dorsalis Hood）人工饲养系统用于昆虫病原真菌毒力筛选

学习使用二斑叶螨快速收集与植物侵染技术，通过画笔或真空泵将雌螨接种到实验植物，并采用网格法量化叶片损伤面积。该方法可高效评估不同植物品系对螨害的敏感性差异，为植物病虫害互作研究提供可靠工具。

二斑叶螨 Tetranychus urticae 在植物-害虫互作研究中的应用

探索更多视频