Name: 免疫荧光法Barrett食管细胞的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习免疫荧光染色法评估药物对Barrett食管细胞结构和蛋白质定位的影响。该方法通过荧光显微镜可视化细胞变化，为肿瘤学和细胞生物学研究提供可靠工具。

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本工作获得了圣约瑟夫基金会（AJF，LJI）和美国肺脏协会（RG-224607-N，LJI）资助。

1. 细胞系的维持
<ol>
	<li>通过稳定转染人端粒酶逆转录酶（TERT）蛋白，建立永生化的人类巴雷特食管高级别异型增生（CP-B、CP-C、CP-D）和化生（CP-A）细胞系11。</li>
	<li>将巴雷特食管细胞系培养于添加了牛垂体提取物（BPE）、表皮生长因子（EGF）、5% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）、青霉素-链霉素-新霉素（PSN）的角质形成细胞培养基中，并置于标准组织培养条件下（37 °C、5% CO2、98% 湿度）维持培养。</li>
</ol>
2. BE 细胞接种
<ol>
	<li>12孔板/盖玻片的准备。将18 mm盖玻片放入玻璃培养皿中，进行高压灭菌。使用连接真空管的无菌玻璃移液管，将灭菌后的18 mm玻璃盖玻片转移至12孔组织培养板中。用无菌PBS和培养基清洗盖玻片。</li>
	<li>消化并计数永生化BE细胞。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将细胞用培养基稀释至浓度为20,000–40,000 个细胞/mL。</li>
	<li>向每个含有盖玻片的孔中加入1 mL细胞悬液，使每孔总细胞数为20,000–40,000 个细胞。</li>
	<li>使用无菌移液枪头轻轻将盖玻片推至孔底，以确保细胞能够贴附于盖玻片表面。</li>
</ol>
3. BE 细胞的药物处理
<ol>
	<li>将选定的药物溶于预热（37 °C）的培养基中，配制成所需浓度，并通过反复倒置试管或使用涡旋混合器充分混匀。药物浓度需通过实验经验确定。在支气管上皮（BE）细胞接种后24小时开始处理，以确保细胞已贴附于盖玻片上。</li>
	<li>作为对照和比较，另取一组BE细胞盖玻片，用含0.1%溶剂（如二甲基亚砜[DMSO]或其他用于溶解化合物的试剂）的培养基处理。使用实验室记号笔标记培养板，以区分药物处理组和溶剂对照组。将细胞置于设定为37 °C、5% CO2、98%湿度的细胞培养箱中，孵育至预定时间点。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>在药物处理达到预期孵育时间后，吸除培养基，并在室温（RT，25 °C）下用1×磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤盖玻片。</li>
		<li>吸除 PBS，每孔加入 1 ml 含 4% PFA 的 PBS [4% PFA/PBS]，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>吸去4% PFA/PBS，用PBS在室温下洗涤盖玻片3次，每次5分钟。如需保存，可将盖玻片置于含0.1% PFA的PBS中，4 °C保存一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透化/封闭
	 透化经PFA固定的细胞，以使抗体能够进入细胞内靶标。对于细胞表面外在蛋白，执行后续所有步骤 无 将皂苷加入1x PBS/0.5% BSA溶液中。
	<ol>
		<li>通过用 50 mM NH₄Cl 孵育以减少背景4用 PBS 稀释的 Cl 在室温下孵育 10 分钟，然后用室温 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将BE细胞在含有0.1%皂苷和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的100–300 μl PBS中孵育30分钟。皂苷用去离子水配制成10%储备液，经滤膜除菌后于4 °C保存，使用时按需稀释。</li>
	</ol>
	注意：通过添加0.5% BSA封闭盖玻片，可防止抗体与细胞蛋白发生非特异性结合。也可用5%稀释的驴血清替代BSA，以减少抗体的非特异性结合。
	</li>
	<li>人眼前房的制备
	<ol>
		<li>用湿润的纸巾铺满方形生物测定皿的底部，并在上方覆盖一层Parafilm。</li>
		<li>使用镊子和注射器针头，将盖玻片（细胞面朝上）轻轻转移至Parafilm上。</li>
		<li>用记号笔在Parafilm上标记以识别盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用含有0.5% BSA和0.1%皂苷的PBS稀释一抗。</li>
		<li>轻轻用实验室纸巾吸去封闭液，加入100 μl一抗溶液。将一抗在BE细胞上于4 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液在室温下洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液稀释与荧光标记物偶联的二抗，该二抗需识别一抗所来源的物种。</li>
		<li>向每个盖玻片中加入100 μl稀释的抗体。室温下孵育二抗2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片的清洗与封片
	<ol>
		<li>用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。移除洗涤液后，向盖玻片加入 100–300 μl PBS。 
		注意：对于双重抗体染色，根据讨论部分所述信息，使用所需的另一种一抗和二抗重复步骤 4.4–4.5。</li>
		<li>用镊子轻轻抬起盖玻片，用实验室纸巾或餐巾纸吸去PBS。</li>
		<li>加入15 μl 含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的合适抗荧光淬灭封片剂至盖玻片上，将盖玻片细胞面朝下倒置贴附于玻璃显微镜载片上。</li>
		<li>将载玻片放入载玻片盒中，置于室温避光处孵育过夜，使硬固型抗荧光淬灭剂充分固化，具体操作按照生产商说明书进行。待抗荧光淬灭剂完全固化后，载玻片可保存于4 °C或-20 °C，直至进行显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 盖玻片的显微观察
染色后的细胞可通过共聚焦显微镜或具备免疫荧光成像能力的正置显微镜进行观察。尽管共聚焦显微镜可在特定焦平面上提供高分辨率图像，但正置显微镜能够更快地获得具有实用价值的图像。为简洁起见，本文介绍一种使用常规显微镜观察染色BE细胞的方法。通常情况下，观察异硫氰酸荧光素（FITC）或类似荧光染料（例如绿色荧光蛋白）、Texas Red 和 DAPI，需要配备能够区分这些荧光染料的滤光片的显微镜。在开始实验前应检查显微镜，以确定其兼容的荧光染料类型。
<ol>
	<li>在标准免疫荧光显微镜上成像
	<ol>
		<li>从 -20 °C 或 4 °C 取出保存的载玻片/盖玻片，使其升至室温。打开显微镜和汞弧灯电源。</li>
		<li>将盖玻片朝向物镜的显微镜载玻片放置于显微镜载物台上。若使用油浸物镜，需在盖玻片上滴加一滴浸油。</li>
		<li>选择 DAPI 滤光片并打开快门。</li>
		<li>通过目镜观察并调节物镜焦距，直至图像清晰。由于所有细胞均会被 DAPI 染色，细胞核应易于观察。</li>
		<li>使用相应的图像处理软件采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
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<li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Barret%27s+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin%3A+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li>
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<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
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<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

我们已概述了一种将BE细胞免疫荧光（IF）技术应用于阐明靶向治疗对这些细胞生理效应的方法。尽管本文描述的是该方法在BE细胞中的应用，但我们发现这些技术同样适用于多种不同类型的细胞13,17,18。此外，这些实验步骤可通过多种方式进行调整，以优化针对特定靶标的染色效果。
我们发现一个直接影响免疫荧光（IF）效果的关键参数是固定剂的选择。上述实验步骤中我们描述了使用4% PFA/PBS进行固定，但其他固定剂也可适用。用PBS洗涤后，采用冷甲醇（-20 °C）固定20分钟，适用于某些蛋白/抗体13。使用冷甲醇固定可避免后续细胞通透步骤。然而，固定剂（4% PFA/PBS或冷甲醇）的选择必须通过实验经验确定。
上述步骤描述了单一蛋白质的可视化方法；然而，该方法可轻松扩展用于另一靶标的鉴定13为实现两种蛋白质的最佳免疫荧光染色，应使用来自两种不同物种的初级抗体（例如，&#160;一种在兔体内制备，另一种在小鼠体内制备），并使用可特异性识别各物种且偶联不同荧光染料的二抗。偶...

Barrett食管（BE）是指食管正常的鳞状上皮发生化生性改变，通常由胃食管反流病（GERD）导致食管长期暴露于胃内容物所引起1。目前认为BE是机体对GERD的一种保护性反应，但BE的存在会显著增加食管腺癌（EAC）的发病风险，而EAC的生存率极低1。目前估计，高达5.6%的美国人口患有BE，但由于BE常无明显症状，多数病例可能尚未被诊断2。鉴于GERD和EAC的发病率持续上升3，深入理解BE向EAC进展过程中所涉及的分子机制显得尤为重要，因为这些信息有望为阻止BE向EAC进展提供潜在的治疗策略。
患者导向的研究确立了目前关于巴雷特食管-食管腺癌（BE-EAC）发病机制的范式1。长期暴露于胃内容物所导致的慢性炎症、损伤和基因毒性损害，对巴雷特食管病变施加了选择性压力，促进其向食管腺癌（EAC）的肿瘤性进展。在巴雷特食管向食管腺癌发展的过程中，已鉴定出多种遗传学改变。然而，尽管如此，人们对细胞信号传导的确切变化及其对细胞结构与功能的后续影响仍缺乏明确理解。
永生化 体外 细胞系是研究细胞信号传导效应的有用工具，尤其适用于研究靶向治疗化合物的作用。近年来，永生化BE细胞系的商业化供应使得此类研究成为可能。尽管高通量检测方法（如广泛使用的细胞活力检测）在评估靶向治疗对细胞增殖和存活的影响方面具有重要价值4-6然而，这些检测方法无法用于研究细胞信号传导对细胞形态的影响。免疫荧光染色（IF）是一种有效的技术，可用于研究靶向治疗对细胞形态学、生长特性、存活特征及相关蛋白的影响。本实验室已将这些方法应用于永生化BE细胞系，通过免疫荧光染色评估一种临床可用药物对BE细胞系的作用，旨在阐明潜在的化学预防治疗方案及药物治疗的生物标志物。7类似地，这些技术在食管腺癌（EAC）、巴雷特食管（BE）及永生化食管细胞系中的应用，已阐明了巴雷特食管向食管腺癌进展过程中的关键发现8-10我们发现，对经靶向治疗处理的BE细胞进行免疫荧光（IF）分析具有重要价值，可实现对细胞结构及蛋白质定位变化的表征。本文中，我们介绍了针对永生化BE细胞进行免疫荧光分析的方法，用于表征药物处理效应。

<table><tbody><tr><td>CP-A（化生细胞系）</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B（高级别异型增生细胞系）</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C（高级别异型增生细胞系）</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D（高级别异型增生细胞系）</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞-SFM（1倍，液体）</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1倍），含酚红&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>PSN 抗生素混合液</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲盐水</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Pro-long Gold 抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-连环蛋白一抗（兔源）</td><td>Cell Signaling</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（山羊抗兔）</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养处理的聚苯乙烯培养皿，无菌</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养处理的聚苯乙烯培养板，无菌</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 - 第五组分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606（博舒替尼）</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>方形生物测定培养皿&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管，燧石玻璃</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom Mini 细胞计数仪</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 细胞计数板</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于表征巴雷特食管细胞的免疫荧光方法

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

食管腺癌（EAC）的总体生存率低于17%，且在过去二十年中，EAC的发病率显著上升。EAC的主要风险因素之一是巴雷特食管（BE），这是一种因长期胃灼热导致正常鳞状上皮发生化生性改变的病变。尽管EAC与BE之间的关联已明确，但对其中的分子事件，特别是涉及BE向EAC进展的信号通路改变，仍知之甚少。这在很大程度上是由于缺乏适用于研究这些疾病的有效体外模型。近年来，永生化BE细胞系已实现商业化，使得对BE进行体外研究成为可能。本文介绍一种对永生化BE细胞系进行免疫荧光染色的方法，可用于在治疗性化合物处理后，对细胞信号传导和细胞结构进行体外表征。这些技术的应用将有助于深入理解BE向EAC进展的机制，并为EAC的治疗和预防提供潜在途径。

应用所述实验步骤所获得结果的一个示例如图1A-D所示。将含有CP-D和CP-C型BE细胞的盖玻片分别用1 μM Src家族抑制剂SKI-606或溶剂（DMSO）处理24小时，并按照上述方法对黏附连接和Wnt信号通路蛋白β-catenin进行染色。通过使用偶联绿色荧光染料的抗兔IgG抗体标记实现β-catenin的可视化，而细胞核则通过DAPI（蓝色）染色进行标记。盖玻片使用硬封固剂封片后，采用配备63X/1.4N平场复消色差物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。所选绿色荧光染料在488 nm激发，并通过505–525 nm发射滤光片进行检测；同样，DAPI在405 nm激发，发射光通过410–460 nm滤光片收集。酪氨酸激酶Src的活性在BE细胞中升高，尤其在高级别异型增生中更为显著12。与结直肠癌和前列腺癌细胞中的观察结果一致13-15，抑制Src活性可导致β-catenin从细胞质/细胞核（箭头，图1A、1C和1E）重新定位至细胞膜（箭头头，图1B、1D和...

目前迫切需要加强对巴雷特食管分子驱动因素的深入了解。免疫荧光染色是一种用于研究细胞信号传导对细胞形态影响的有效技术。本文介绍了一种简单而有效的实验方案，利用免疫荧光染色方法评估针对巴雷特食管细胞的治疗干预效果。

食管腺癌（EAC）的总体生存率低于17%，在过去二十年中，EAC的发病率显著上升。 one ...

以下实验的总体目标是评估药物处理对 BE 细胞中细胞结构和蛋白质定位的影响。通过在标准细胞培养条件下，将生长在玻璃盖玻片上的 BE 细胞与选定药物共同孵育来实现该目标。第二步是将经药物处理的 BE 细胞与固定剂孵育，以保存蛋白质的结构和定位。接下来，将固定的细胞依次与一抗和荧光标记的二抗孵育，以通过荧光显微镜观察所选靶蛋白的变化。根据免疫荧光染色的可视化结果，可获得药物处理对细胞蛋白定位及细胞结构影响的信息。尽管该方法可用于研究巴雷特食管，但也适用于其他系统，包括癌细胞和正常细胞。开始实验前，先将18毫米的盖玻片放入玻璃培养皿中，并进行高压灭菌处理。然后使用连接真空管的无菌玻璃移液管，将高压灭菌的盖玻片转移至12孔组织培养板中。随后用无菌PBS和培养基洗涤盖玻片。接下来进行胰蛋白酶消化。使用自动细胞计数器或血细胞计数板对永生化细胞进行计数，随后将细胞用培养基稀释至每毫升含 20,000 至 40,000 个细胞的浓度。然后将 1 毫升细胞悬液加入每个含有盖玻片的孔中。每孔细胞总数为 20,000 至 40,000 个时，使用无菌移液器吸头轻轻将盖玻片推至孔底，以确保细胞贴附在盖玻片上。处理BE细胞时，将选定的药物用37摄氏度的培养基稀释至所需浓度，并通过反复倒置试管或使用涡旋振荡器充分混匀。在BE细胞初次接种后24小时开始处理，以确保细胞已贴附到盖玻片上。现在使用记号笔对预先标记的药物处理组和溶剂对照组样本板进行标注，以区分实验组与对照组。另取一张BE细胞盖玻片，用含0.1%溶剂的培养基进行处理。随后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳和98%湿度的细胞培养孵箱中。在完成所需时间的药物处理孵育后，吸除培养基，并用1倍PBS在室温下快速洗涤盖玻片。然后吸除PBS，向每个孔中加入1毫升含4%多聚甲醛（PFA）的PBS，室温孵育30分钟。接下来，吸去4% PFA。将盖玻片在室温下用PBS洗涤三次，每次五分钟。如有需要，可将盖玻片置于PBS和0.1% PFA中，于4°C保存一周。为了使抗体能够进入细胞内靶标，需对固定后的PFA细胞进行透化处理：将细胞与用PBS稀释的50毫摩尔氯化铵溶液在室温下孵育10分钟。然后用室温的PBS洗涤一次，每次5分钟。这将降低背景，防止抗体与细胞蛋白发生非特异性结合。在含有0.1%吐温-20和0.5%BSA的100至300微升PBS中孵育BE细胞30分钟。然后准备一个方形生物测定培养皿，先在培养室底部铺上湿润的纸巾，再在其上放置一层帕姆（parfum）。用记号笔在帕姆上做标记以识别盖玻片。使用镊子和注射器针头，将细胞面向上的盖玻片轻轻转移至帕姆上。现在将一抗用含有0.5% BSA和0.1%皂苷的PBS稀释，轻轻吸去封闭液。使用实验室用纸巾，加入100微升一抗溶液，并在4°C下孵育细胞过夜。第二天。用含有0.5% BSA和0.1%吐温的PBS洗涤载玻片三次，每次五分钟，室温下进行。然后将与荧光标记偶联的二抗用含有0.5% BSA和0.1%吐温的PBS稀释。向每张盖玻片加入100微升稀释后的抗体，并在室温下孵育细胞两小时。两小时后。用含有0.5% BSA和0.1%吐温的PBS洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗三次。移除洗涤液后，向盖玻片加入100至300微升PBS。用镊子轻轻夹起盖玻片，用实验室纸巾或餐巾纸吸去PBS。然后向盖玻片中加入 15 µL 含有 DPI 的合适抗荧光淬灭封片剂。将盖玻片倒置，使细胞面朝下，放置在玻璃显微镜载玻片上。随后将载玻片放入载玻片盒中，于室温下避光过夜，以使抗荧光淬灭封片剂充分固化。待抗ifa培养基凝固后，载玻片可保存在4摄氏度或负20摄氏度，直至进行显微观察。在此步骤中，将保存的载玻片从负20摄氏度或4摄氏度取出，使其升至室温。打开显微镜和汞弧灯。将一张盖玻片朝向物镜的载玻片放置在显微镜载物台上。接着，选择 DAPI 滤光片并打开快门。通过目镜观察，调节物镜焦距，直至图像清晰可见。由于所有细胞均已用 dpi 染色，细胞核应易于观察。使用适当的图像处理软件采集图像，本图中盖玻片上的 CPC 和 CPD 细胞经溶剂或 1 微摩尔的 SRC 抑制剂 SKI-606 处理 24 小时后，细胞被固定并染色。根据所述实验方案，使用特异性抗体及与LOR 488偶联的二抗对绿色显示的β-catenin进行可视化，细胞核则用蓝色显示的DPI染色。注意经SKI 606处理后，β-catenin从细胞核向细胞膜的定位变化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对巴雷特食管进行免疫荧光染色，以研究蛋白质定位或细胞结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

免疫荧光法Barrett食管细胞的表征

我们描述了一种用于解离结直肠癌（CRC）组织以获得可存活单细胞的方法，随后将这些单细胞捕获在定制的识别表面抗原的抗体微阵列上（DotScan CRC...

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一种基于免疫荧光的空肠冷冻切片中簇细胞可视化方法

来源：Ear, P. H., 等。小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征。J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小肠神经内分泌肿瘤类球体进行表征

活体染料增强荧光成像（VFI）是一种新型的 体内...

使用活体染料增强荧光成像诊断巴雷特食管中的肿瘤性病变

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从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

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三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

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石蜡包埋福尔马林固定人咽部鳞状细胞癌样本中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学检测

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内...

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立及其组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织向癌变组织转变过程中细胞形态、空间结构以及分子标志物表达模式的变化。...

建立模拟食管组织从正常向癌变进展的类器官模型及其组织学分析

本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。...

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

学习免疫荧光染色法评估药物对Barrett食管细胞结构和蛋白质定位的影响。该方法通过荧光显微镜可视化细胞变化，为肿瘤学和细胞生物学研究提供可靠工具。

一种用于表征巴雷特食管细胞的免疫荧光方法

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