一种用于表征巴雷特食管细胞的免疫荧光方法

以下实验的总体目标是评估药物处理对BE细胞结构及蛋白质定位的影响。该目标通过在标准细胞培养条件下，将生长于玻璃盖玻片上的BE细胞与选定药物共同孵育来实现。第二步是将经处理的BE细胞与固定剂孵育，以保存蛋白质的结构和定位。

接下来，将固定后的细胞依次与一抗和荧光标记的二抗孵育，以通过荧光显微镜观察所选靶蛋白的变化。获得的结果可显示药物处理对细胞后蛋白定位和细胞结构的影响，该影响基于免疫荧光染色的可视化分析。尽管该方法可用于研究巴雷特食管，也可应用于其他系统，包括癌细胞和正常细胞。开始实验前，先将18毫米的盖玻片放入玻璃培养皿中，并进行高压灭菌处理。

然后使用连接真空管的无菌玻璃移液管，将高压灭菌的盖玻片转移至12孔组织培养板中。随后用无菌PBS和培养基洗涤盖玻片。接下来进行胰蛋白酶消化。

使用自动细胞计数器或血细胞计数板对永生化细胞进行计数，随后将细胞用培养基稀释至每毫升20,000至40,000个细胞的浓度。然后将1毫升细胞悬液加入每个含有盖玻片的孔中。每孔总细胞数为20,000至40,000个时，使用无菌移液器吸头轻轻将盖玻片推至孔底，以确保细胞贴附在盖玻片上。

为了处理BE细胞，将选定的药物用37摄氏度的培养基稀释至所需浓度，并通过反复倒置试管或使用涡旋振荡器充分混匀。在BE细胞初次接种后24小时开始处理，以确保细胞已贴附到盖玻片上。现在使用记号笔对预先标记的药物处理组和溶剂对照组样本板进行标注，以区分实验组与对照组。另取一张BE细胞盖玻片，用含0.1%溶剂的培养基进行处理。

随后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳和98%湿度的细胞培养孵箱中。在完成所需时间的药物处理孵育后，吸除培养基，并用1倍PBS在室温下快速洗涤盖玻片。然后吸除PBS，向每个孔中加入1毫升含4%多聚甲醛（PFA）的PBS，室温孵育30分钟。

接下来，吸除4% PFA。将盖玻片在室温下用PBS洗涤三次，每次五分钟。如有需要，可将盖玻片置于PBS和0.1% PFA中，于4°C保存一周。为了使抗体能够进入细胞内靶标，需对固定后的PFA细胞进行透化处理：将细胞与用PBS稀释的50毫摩尔氯化铵溶液在室温下孵育10分钟。

然后用室温的PBS洗涤一次，每次5分钟。这将降低背景，防止抗体与细胞蛋白发生非特异性结合。在含有0.1%吐温-20和0.5%BSA的100至300微升PBS中孵育BE细胞30分钟。

然后准备一个方形生物测定皿，先在培养皿底部铺上湿润的纸巾，再在其上放置一层parfum。用记号笔在parfum上做标记，以识别盖玻片。使用镊子和注射器针头，将细胞面向上的盖玻片轻轻转移至parfum上。

现在将一抗用含有0.5% BSA和0.1%皂苷的PBS稀释，轻轻吸去封闭液。使用实验室用纸巾，每孔加入100 µL一抗溶液，并在4°C下孵育细胞过夜。第二天。

将载玻片用含有0.5% BSA和0.1%吐温（troponin）的PBS洗涤三次，每次五分钟，室温操作。然后将荧光标记的二抗用含有0.5% BSA和0.1%吐温（ponent）的PBS稀释。向每个盖玻片加入100微升稀释后的抗体，室温孵育细胞两小时。两小时后。

用含有0.5% BSA和0.1%肌钙蛋白的PBS洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗涤三次。移除洗涤液后，向盖玻片加入100至300微升PBS。用镊子轻轻提起盖玻片，并用实验室纸巾或纸巾吸去PBS。

然后向盖玻片加入15 µL含有DPI的合适Antifa封片剂。将盖玻片倒置，使细胞面朝下，放置在玻璃显微镜载玻片上。随后将载玻片放入载玻片盒中，于室温下避光过夜，以使Antifa封片剂充分固化。

抗原修复液凝固后，载玻片可保存在4摄氏度或负20摄氏度，直至进行显微镜观察。此步骤中，从负20摄氏度或4摄氏度取出保存的载玻片，使其恢复至室温。打开显微镜和汞弧灯。

将一张盖玻片朝向物镜的载玻片放置在显微镜载物台上。接着，选择 DAPI 滤光片并打开快门。通过目镜观察，调节物镜焦距，直至图像清晰可见。

由于所有细胞均已用 dpi 染色，细胞核应易于观察。使用适当的图像处理软件采集图像，本图中的盖玻片样本经 CPC 和 CPD 处理后，分别用溶剂或 1 µM 的 SRC 抑制剂 SKI-606 处理 24 小时，然后对细胞进行固定和染色。

根据所述实验方案，使用特异性抗体及与LOR 488偶联的二抗对绿色显示的β-catenin进行可视化，细胞核则用蓝色显示的DPI染色。注意经SKI 606处理后，β-catenin从细胞核向细胞膜的定位变化。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何对巴雷特食管进行免疫荧光染色，以研究蛋白质定位或细胞结构。