一种用于从水中浓缩病毒的小体积方法

以下实验的总体目标是利用一种最初用于优化病毒浓度的小规模技术，优化从水中回收病毒的效果。实验发现，玻璃纤维素滤膜是浓缩水中腺病毒的最佳正电滤膜。在二次洗脱步骤中，硅藻土二次浓缩技术被证明是从未吸附表面洗脱腺病毒的最佳方法。该最终技术基于在所有测试的滤膜与洗脱组合中观察到的最高回收率，可从自来水中回收最多的腺病毒。

与现有的大规模体积浓缩等方法相比，该技术的主要优势在于其使用较小的样品体积，从而能够快速、简便地评估多种浓缩变量。

准备本方案时，应提前准备好所有所需溶液，包括经0.22微米滤膜过滤的病毒溶液，其浓度为每毫升10至100,000 MPN。

首先量取一升无菌自来水，转移至一个两升的烧杯中，并加入一个磁力搅拌子。在搅拌的同时加入0.7克硫代硫酸钠，使其完全溶解。然后逐滴加入1摩尔的酸或碱储备溶液，将pH值调节至7至7.5之间。接着，向水中加入病毒，加入1毫升已制备好的病毒溶液。用无菌封口膜覆盖烧杯，让病毒与水混合10分钟。

同时，准备 Millipore 滤器。首先，将其从包装中取出，并确保上部滤碗与下部滤网之间紧密贴合。接着，检查滤器上的软木材料是否与一个 1 升抽滤瓶的瓶口紧密匹配。现在取下滤器的上部滤碗，用镊子将一个 47 毫米的带正电滤膜圆片准确地放置在滤网中央。然后重新安装滤碗，并通过逆时针旋转将其锁紧到位。

使用无菌量筒量取 100 毫升加标自来水。然后将水转移至装有两升烧瓶的已准备好的滤器外壳中。滤器中的带正电滤膜可以是褶皱状玻璃纤维素或纳米氧化铝玻璃纤维。可使用轻微真空使剩余的水通过滤膜。

现在，将滤器外壳转移至一个 250 毫升的抽滤瓶中。量取 100 毫升牛肉浸出液，缓慢倾倒于滤膜上。让浸出液缓慢通过滤膜，并用轻微的真空抽吸以回收残留液体。

然后继续采用以下两种次级浓缩方案中的任意一种。

使用硅藻土浓缩病毒时，将含有病毒的250毫升烧瓶内容物转移至搅拌器上。用搅拌子形成微小漩涡。接着，将0.1克硅藻土粉末加入100毫升牛肉浸出液中。让硅藻土充分分散，并准备调节溶液pH值。逐滴加入0.1摩尔盐酸，将pH值降至4.0。

然后让溶液混合10分钟。在混合的同时，将47毫升预滤器连接到一个2升的烧瓶上。现在将100毫升牛肉提取物-硅藻土混合物通过预滤器过滤。可使用轻微真空抽滤完成此步骤。

接着，将一个金属管夹安装在滤器外壳出口端。在管夹上连接一个无菌的15毫升聚丙烯收集管，然后将滤器重新组装到烧瓶上。

现在用 5 毫升 pH 为 9 的 1×PBS 从 Celite 颗粒中洗脱病毒。通过重力作用使大部分 PBS 滴入 15 毫升离心管中，再用轻微真空抽吸将剩余液体移出。为通过有机絮凝法浓缩病毒，将含有病毒的 250 毫升烧瓶内容物转移至搅拌器上。使用搅拌子形成微小涡流，逐滴加入 1 摩尔盐酸，调节溶液 pH 至 3.5。随后继续搅拌 30 分钟。之后将溶液转移至无菌的 250 毫升锥形离心管中。在 4 摄氏度下以 2,500 ×g 离心 15 分钟。离心结束后，操作离心管时需小心，避免扰动沉淀。小心弃去上清液，并将沉淀重悬于 5 毫升 pH 9 的 PBS 中。确保沉淀完全溶解。然后将重悬液在 4 摄氏度下以 4,000 ×g 离心 10 分钟。现在收集含有浓缩病毒的上清液，沉淀可弃去。

在优化本方案时，比较了三种类型的硅藻土。较大的硅藻土颗粒导致腺病毒40型和腺病毒41型的回收率均较低。

在pH值介于7.5至12之间测试了滤膜洗脱效果，以确定哪种条件最适合从滤膜中回收腺病毒（ADV）颗粒。在pH 10条件下，使用玻璃纤维-纤维素滤膜结合牛肉提取物及硅藻土时，回收率最高。该结果在ADV 40和ADV 41中一致。

在 pH 10 条件下，牛肉浸膏的絮凝效果优于有机絮凝法。

将优化后的方法与添加25%胰蛋白酶的方法进行比较，并与在牛肉提取物中补充0.1%三聚磷酸钠的方法进行比较。两种处理均未显著提高腺病毒的回收率。

如果操作得当，掌握此技术后可在45分钟内完成。