Name: 作为一种工具来描绘分子途径参与神经毒性和神经保护神经元细胞在线实时阻抗为基础的细胞分析仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解基于阻抗的实时细胞分析技术，用于监测神经元细胞系的细胞保护过程，并阐明第二信使通路在神经保护中的作用机制。该方法为高通量评估神经保护化合物提供了有效平台。

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本研究中实验的经费由瑞士国家科学基金会的玛丽·海姆-沃特林项目提供支持。
我们感谢Johanna Nyffeler女士开发了一套改进的MATLAB程序，用于筛选实时细胞分析仪数据中具有统计学意义的差异，同时感谢Yama Abassi博士提供的有益讨论。

1. 准备
<ol>
	<li>将实时细胞分析仪的主机置于设定为 37 °C 并含有 5% CO2 的组织培养孵育箱中。所有细胞培养操作和药理学处理均须在组织培养超净台内无菌条件下进行。</li>
	<li>注意：对于培养所需温度条件不同于标准条件的神经细胞系，应相应调整培养参数。对于贴壁能力较弱的细胞系，可使用包被试剂以促进细胞与 E-Plate 96 孔板底部金微电极之间的相互作用。</li>
	<li>配制用于细胞培养处理的药理学化合物（神经保护剂或第二信使通路抑制剂）的 1,000 倍浓缩母液（溶于适当的溶剂——二甲基亚砜或无菌水），并于 -20 °C 保存。后续处理中以相应溶剂作为空白对照。</li>
	<li>在添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12 培养基（增殖培养基）中培养人神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞，使用表面积为 175 cm2 的细胞培养瓶，培养至细胞密度约为 75%。为确保细胞增殖速率及对细胞毒性的反应在不同实验间具有一致性，细胞传代次数应控制在一定范围内（约 10 代以内），优先使用较低代次的细胞。</li>
	<li>用 PBS 洗涤贴壁生长的 SK-N-SH 细胞层，随后在 37 ˚C 下用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化 5 分钟。以 170 × g 离心 5 分钟去除胰蛋白酶，加入 10 ml 增殖培养基重悬细胞。使用 Scepter 细胞计数器计数细胞，并用增殖培养基将细胞浓度调整至 300,000 个细胞/ml。</li>
</ol>
2. SK-N-SH 细胞的铺板与增殖
<ol>
	<li>向 E-Plate 96 的每个孔中加入 100 µl 增殖培养基，在室温下的组织培养超净台中静置 30 分钟以平衡。将 E-Plate 96 插入 CO2 培养箱中 37 °C 的实时细胞分析仪工作站内。</li>
	<li>启动实时细胞分析仪软件。在“布局”页面选择实验中包含的孔，并在编辑框中输入有关细胞类型、细胞数量、用于细胞处理的化合物名称及其浓度的信息。 
	注意：本方案建议每种处理至少设置 4 个重复孔。</li>
	<li>在软件的“时间表”页面，通过选择测量细胞指数（Cell Index）的扫描次数以及每步之间的间隔时间，确定实验中包含的“步骤”。由于步骤 1 已预设用于背景测量，请点击“添加步骤”，并将步骤 2 设置为每 15 分钟测量一次细胞指数，持续 96 小时。 
	注意：对于预期具有快速动力学效应的处理，应设置更短的扫描间隔。</li>
	<li>点击“开始”以启动自动预设的步骤 1，测量培养基的背景阻抗。一旦细胞被加入各孔，该数值将在每次数据采集点由软件自动扣除。</li>
	<li>使用步骤 1.5 中预先制备的细胞悬液，其浓度为 300,000 个细胞/ml 的增殖培养基。进行细胞毒性/神经保护研究时，每孔接种 30,000 个细胞；进行细胞增殖研究时，每孔接种 15,000 个细胞。取出 E-Plate，每孔加入 100 µl 细胞悬液用于细胞毒性/神经保护研究；每孔加入 50 µl 细胞悬液和 50 µl 增殖培养基用于细胞增殖研究。每孔接种的细胞数量需根据不同细胞系进行经验性优化。</li>
	<li>轻轻摇动 E-Plate 96，使细胞均匀分布。将 E-Plate 96 置于室温下的组织培养超净台中静置 30 分钟，使细胞均匀沉降到孔底。</li>
	<li>将 E-Plate 96 插入实时细胞分析仪工作站，并在“时间表”页面启动步骤 2。通过软件的“曲线图”页面观察细胞生长曲线，以及“细胞指数”页面查看原始细胞指数数据，全程监测细胞指数变化。</li>
</ol>
3. 血清剥夺
<ol>
	<li>细胞接种后24小时，暂停实验，将E-Plate 96从实时细胞分析仪工作站中取出。用无血清的DMEM/F12培养基将第二信使抑制剂从1,000倍储存液稀释至200倍&#215; 最终浓度。用1处理细胞 &#956;在启动细胞毒性实验前30分钟，加入第二信使通路的抑制剂，以检测这些通路在神经毒性/神经保护中的作用，并抑制相应通路。将E-Plate 96放回工作站，继续进行细胞指数的实验测量。</li>
	<li>30 分钟后暂停实验。使用移液器（或多通道移液器）小心地将增殖培养基从 E-Plate 96 孔板的各孔中完全移除，注意将移液器吸头边缘对准孔的角落，避免破坏贴壁的细胞层。加入 200 &#181;每孔加入无血清 DMEM/F12 培养基（血清剥夺培养基）。更换细胞培养基时应迅速操作，以尽量减少对细胞的机械刺激。</li>
	<li>将待检测神经保护作用的化合物用无血清 DMEM/F12 培养基从 1,000 倍浓缩储备液稀释至 200 倍&#215; 最终浓度。加入1 &#956;待测试其神经保护作用的化合物以及 1 &#956;根据实验方案，在各个孔中加入第二信使通路的抑制剂。</li>
	<li>在进行细胞增殖研究时，不要更换培养基。将待测化合物从1,000倍浓缩储备液稀释至200倍。&#215; 增殖培养基中的最终浓度，用1处理 &#956;每孔1升，在增殖培养基中继续培养。</li>
	<li>继续实验，按照之前设定的条件，每15分钟进行一次细胞指数测量，持续96小时。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>对于神经毒性/神经保护数据，在“绘图”页面上选择“归一化的细胞指数”和“归一化时间”，将细胞指数归一化至药物处理或更换培养基前的最后一个时间点，以减少不同实验之间的差异。</li>
	<li>在“绘图”页面上高亮显示感兴趣的实验条件对应的孔，然后点击“添加”以绘制归一化的细胞指数曲线。观察归一化细胞指数随时间变化的动力学曲线，以评估神经毒性/神经保护效应或第二信使抑制作用。</li>
	<li>观察测试药物在增殖培养基中随时间变化的细胞指数曲线，以评估增殖效应是否参与了神经保护/神经毒性作用。</li>
	<li>从细胞指数软件页面导出所有细胞指数时间点的实验信息至Excel文件，以启动结果的统计学评估 
	注意：在统计分析的初始步骤中，可使用一组改进的MATLAB程序，该程序采用Welch's t检验，并以半对数形式绘制p值，同时时间轴采用倒置坐标（相关代码文件作为补充材料提供）。这些程序能够检测整个实时细胞分析实验过程中随时间变化的p值，从而有助于选择合适的时间点进行更详细的统计分析。有关程序的详细信息请参见补充材料。</li>
	<li>针对特定时间点下不同处理条件下细胞指数值差异的统计分析，从导出的Excel文件中选取相应时间点的细胞指数值。使用统计学软件对选定时间点的细胞指数值进行单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行事后检验。</li>
</ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

本视频文章的出版费用由“ACEA Biosciences”赞助。

本方案介绍了利用实时细胞分析仪在无标记条件下连续评估化合物对神经细胞系的神经保护/神经毒性作用，并深入研究参与该作用的第二信使通路。
尽管实时细胞分析仪在研究细胞毒性以及药物对细胞增殖影响方面的应用价值已得到普遍认可，但目前仅有少数研究将其用于神经元相关细胞类型。我们先前已证明，实时细胞分析仪可用于监测5-HT2A受体激动剂在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的神经保护作用，而Galante et al. 则已证明该技术可用于评估β-淀粉样肽在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的神经毒性7,10。最近一项研究表明，尽管实时细胞分析仪在神经细胞系和神经前体细胞中能够可靠地测量细胞增殖与细胞死亡，但其在原代神经元中检测细胞死亡的精确性取决于损伤的严重程度5。重要的是，实时细胞分析系统所使用的交流电信号幅度极低，仅产生微安级电流，远低于神经元等可兴奋细胞的阈电位。该系统依赖于对E-Plate 96孔板底部表面阻抗的测量，因此细胞贴壁程度至关重要。进一步优化E-Plate孔板表面的细胞外基质蛋白包被以增强细...

神经元细胞死亡在多种脑部相关疾病的发生发展过程中起着关键作用1可靠的高通量方法的可获得性 体外 毒性检测对于深入理解神经毒性的机制以及在药物开发中筛选具有神经保护作用的候选治疗分子至关重要2然而，目前最常用的方法存在诸多局限性 体外 神经毒性检测方法。这些方法仅在单一时间点评估神经毒性或神经保护作用，无法实现动力学解析；通常需要使用标记物或探针，可能干扰信号通路，限制对同一细胞群体进行其他研究，且往往操作繁琐，在多数情况下难以提供机制性信息。本研究中，我们展示了基于实时阻抗的细胞分析系统在神经细胞系中实时、无标记地检测神经毒性和神经保护作用的应用价值，并通过分析效应中涉及的第二信使通路，揭示其下游作用机制。
既往研究已证实，与标准技术相比，实时细胞分析仪在测定细胞系的细胞毒性以及对细胞增殖影响方面的有效性3,4,5,6。例如，在基础增殖条件下以及在HeLa细胞中经历两种不同毒性处理后，多个时间点的标准细胞活力WST-1检测结果与细胞指数（Cell Index）值之间均观察到良好的相关性3。在A549和MDA-MB-231细胞中，使用微管稳定剂紫杉醇诱导的细胞增殖与细胞毒性，通过细胞指数测量和常用的磺酰罗丹明B（sulforhodamine B, SRB）检测法评估时，结果非常相似4。在永生化海马神经元细胞系HT-22中，细胞指数测量已被验证可用于检测细胞增殖、谷氨酸诱导的细胞毒性和对广泛使用的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测的细胞保护作用5。在同一项研究中，MTT检测结果与细胞指数测量在评估神经前体细胞增殖、生长因子剥夺后的细胞毒性以及泛半胱天冬酶抑制剂QVD对细胞毒性的挽救作用时也表现出良好的相关性5。Vandetanib（血管内皮生长因子受体和表皮生长因子受体抑制剂）在NIH 3T3细胞中诱导的细胞毒性，通过细胞指数值或中性红摄取实验检测所得结果亦相似6。
我们最近使用实时细胞分析系统，在神经元细胞系（SK-N-SH细胞）中评估了5-羟色胺2A（5-HT2A）受体激动剂盐酸(±)-2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）的神经保护作用，并通过监测第二信使通路化学抑制剂对所观察到的神经保护效应的影响，筛选了相关信号通路的参与情况7。有趣的是，5-HT2A受体存在致幻性和非致幻性两类激动剂（例如DOI和利舒脲分别为代表），它们可能激活部分共同但也有差异的第二信使通路8。
本技术的优点在于，能够连续数天实时收集细胞存活信息，明确参与其中的第二信使通路，评估增殖效应在神经保护中的可能作用，并为在同一细胞群体上进行其他终点研究选择最佳时间点。当前方案的工作流程示意图见图1。

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&amp;nbsp; RTCA SP 系统套装</td><td>ACEA Biosciences</td><td>货号：00380601030</td><td>包含 RTCA 分析仪、RTCA SP 站和 RTCA 控制单元</td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>货号：05232368001</td><td>用于细胞培养，插入 RTCA SP 站中使用</td></tr><tr><td>SK-N-SH 细胞</td><td>ATCC（与 LGC Standards 合作提供）</td><td>HTB-11</td><td>可用其他感兴趣的贴壁神经元细胞系替代</td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>16140-063</td><td>用于促进细胞增殖，但不用于血清剥夺培养基</td></tr><tr><td>组织培养瓶 T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>用于培养后续将接种至 E-Plate 96 的细胞</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>用于组织培养瓶中细胞的消化</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 细胞计数仪</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>自动化细胞计数设备</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>用于细胞洗涤</td></tr><tr><td>(&amp;plusmn;)-DOI 盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>用于细胞培养处理的 5-HT2A 激动剂</td></tr><tr><td>LY-294002 盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>用于细胞培养处理的 PI3-K 抑制剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>马来酸利舒脲（Lisuride maleate）</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td><td>具有 5-HT2A 激动活性的化合物，用于细胞培养处理</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>用于溶解 LY-294002 和马来酸利舒脲</td></tr></tbody></table>

基于实时阻抗的细胞分析仪作为研究神经毒性与神经保护分子通路的工具在神经细胞系中的应用

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

许多与大脑相关的疾病在其病理生理过程中涉及神经元细胞死亡。 体外 研究药物神经保护或神经毒性作用及其下游通路的模型将有助于深入了解神经保护/神经毒性的分子机制，并可能促进药物开发。然而，许多现有的 体外 毒性检测方法存在主要局限性——大多数方法仅在单一时间点评估神经毒性和神经保护作用，无法观察效应的时间进程和动力学特征。此外，能够实时获取参与神经保护的下游信号通路信息将具有重要意义。在本方案中，我们描述了利用基于实时阻抗的细胞分析仪来测定5-羟色胺2A（5-HT₂A）受体激动剂对星形胶质细胞的神经保护作用。该方法可连续监测细胞形态和贴壁状态的变化，从而动态反映药物干预下的细胞健康状况和功能响应。通过该技术，可在全时程范围内定量分析神经保护效应的动力学特征，并结合特异性信号通路抑制剂，进一步解析相关信号转导机制。该方法具有非侵入性、高时间分辨率和无需标记等优势，适用于研究神经保护化合物的作用机制及药物筛选。 

关键词：毒性检测，神经毒性，神经保护，实时阻抗分析，5-HT₂A受体，星形胶质细胞，信号通路，细胞动力学2A)受体激动剂在无标记和实时条件下对神经细胞系进行检测。此外，我们证明了第二信使通路的抑制剂可用于阐明参与神经保护效应的下游分子。我们还描述了该技术在判断细胞增殖效应是否贡献于所观察到的神经保护作用方面的应用。该系统采用一种称为E-Plate的特殊微电子板，其孔底部表面含有交替排列的金微电极阵列，作为细胞传感器。细胞贴壁数量、细胞活力、形态和黏附状态均可影响阻抗读数。通过电学阻抗测量获得一个无量纲参数——细胞指数（Cell Index），用于表征细胞状态。总体而言，基于实时阻抗的细胞分析系统可实现对神经保护和神经毒性效应的实时、无标记评估，并可用于评价第二信使通路的参与情况，从而促进对潜在神经保护化合物进行更详尽且高通量的分析。 体外用于筛选治疗候选药物。

血清剥夺会导致细胞指数值下降，可通过实时细胞分析仪对这一变化进行连续监测
神经毒性刺激会导致细胞指数值下降，通过本技术可实时监测该变化，其动态过程取决于特定的神经毒性刺激因素及所研究的细胞类型。图2展示了SK-N-SH细胞在增殖培养基中培养时细胞指数的上升，直至达到平台期（绿色线条）；当将细胞转至无血清培养基后，细胞指数下降，并稳定在新的较低水平（红色线条）。这种下降可能反映了因血清撤除导致的细胞黏附状态改变。
药物治疗的神经保护作用可通过实时细胞分析仪进行连续监测
通过实时细胞分析仪，可以连续监测在神经毒性刺激前（预处理）、同时（共处理）或之后（提示细胞恢复）加入的化合物的神经保护作用，从而提供有关神经保护作用速率和持续时间的信息。图3展示了两种5-HT2A激动剂在细胞切换至无血清培养基时加入后的神经保护动态的代表...

改进的 体外 神经毒性检测将有助于鉴定新的神经保护化合物。本文介绍了利用实时阻抗细胞分析仪测定神经元细胞系的细胞毒性和细胞保护作用，并阐明第二信使通路的参与情况，从而深入理解神经保护的作用机制。

许多与大脑相关的疾病在其病理生理过程中涉及神经元细胞死亡。改进的体外模型可用于研究神经保护或神经毒性……

本实验的总体目标是利用基于阻抗的技术，实时监测神经元细胞系的细胞保护作用，以阐明第二信使通路在保护过程中的参与机制。该目标通过以下步骤实现：首先，在基于阻抗的实时细胞分析系统中，于增殖条件下培养神经元细胞系；第二步，研究潜在的相关因素。在对细胞系进行神经保护处理之前，先通过药理学方法抑制第二信使通路。随后，在不同实验条件下，利用实时细胞分析仪监测神经元细胞系的状态。最终，可通过统计学分析评估第二信使通路在神经元细胞保护作用中的实时参与情况。与现有的终点神经毒性检测方法相比，该技术的主要优势在于，能够在无标记条件下实时评估神经细胞系中的Tito保护作用和Tito毒性。该方法有助于回答分子神经生物学领域的关键问题，通过体外高通量筛选潜在的神经保护化合物，并揭示参与神经保护作用的分子机制。首先洗涤贴壁的神经细胞系单层。例如，此处使用人神经母细胞瘤S-K-N-S-H细胞，用PBS洗涤后，在37摄氏度下用胰蛋白酶消化细胞5分钟。通过离心去除胰蛋白酶，然后将细胞重悬于10毫升增殖培养基中。计数细胞后，用增殖培养基将细胞稀释至每毫升3×10⁵个细胞的浓度，随后在室温下的组织培养超净台中，向EPL 96的每孔加入100微升增殖培养基进行平衡。30分钟后，将EPL 96放入二氧化碳培养箱中37°C的实时细胞分析仪工作站内，并启动实时细胞分析软件。然后在布局页面上，选择实验所需的适当孔位，并在时间表软件页面的编辑框中输入细胞类型、细胞数量以及目标化学化合物的名称和浓度，第一步已预设。为进行背景测量，选择“添加步骤”，并将第二步设置为每15分钟测量一次细胞指数，持续96小时。然后单击“开始”以启动第一步，并测量培养基的背景阻抗。现在移除EPL，并向每个实验孔中加入100 µL神经母细胞瘤细胞悬液。轻轻摇晃EPL 96板，使细胞均匀贴壁，然后将该板置于超净台内的室温条件下孵育，使细胞沉降约30分钟。随后将EPL 96板重新放入实时细胞分析仪工作站，并启动第二步。为在整个实验过程中监测细胞指数值，可在绘图页面查看细胞曲线，并在细胞指数页面查看24小时的原始细胞指数数据。接种细胞后，暂停实验并将培养板从实时细胞分析仪工作站中取出。向每孔中加入1 µL新近稀释的目标抑制剂，然后重新装入EPL 96板，30分钟后恢复细胞指数的测量。再次暂停实验，迅速但小心地从各孔中移除增殖培养基，移液时将移液器吸头边缘对准孔的角落，以避免破坏贴壁的细胞层。随后立即向每孔中加入200 µL无血清培养基，向相应孔中分别加入1 µL新近稀释的目标神经保护化合物以及1 µL目标第二信使通路抑制剂。然后，按照之前设定的方案，每15分钟继续进行细胞指数测量，持续96小时以分析数据。现在，在绘图页面上选择归一化的细胞指数和归一化时间函数，将细胞指数归一化至细胞培养处理前的最后一个时间点，以减少实验间的差异。在绘图页面上

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神经科学

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来源：Mudduluru, G.，等. 基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测方法。J. Vis. Exp.

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关键词：阻抗生物传感器，流体生物芯片，RTgill-W1细胞，饮用水毒性，细胞传感器，环境监测，实时细胞分析

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本研究利用细胞电阻抗传感技术（ECIS）——一种实时、高通量的筛选方法，评估了一种选定金属-有机框架材料的毒理学特征。...

用于实时评估金属有机框架毒理学特征的细胞电子基底传感技术

在此，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器（ECIS 和 cellZscope）测量脑血管内皮屏障强度的技术。我们详细介绍了制备过程以及向系统中添加各种刺激物的方法和技术。 体外...

利用两种基于阻抗的生物传感器测量癌细胞和细胞因子刺激下脑血管内皮屏障完整性的变化

我们开发了一款用于分析神经元形态的计算机程序。结合两种现有的开源分析工具，该程序可进行Sholl分析，并确定神经突的数量、分支点数量以及神经突末端数量。这些分析能够揭示神经突形态的局部变化。...

多尺度数字化神经元形态的自动Sholl分析

了解基于阻抗的实时细胞分析技术，用于监测神经元细胞系的细胞保护过程，并阐明第二信使通路在神经保护中的作用机制。该方法为高通量评估神经保护化合物提供了有效平台。

基于实时阻抗的细胞分析仪作为研究神经毒性与神经保护分子通路的工具在神经细胞系中的应用

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