基于实时阻抗的细胞分析仪作为研究神经毒性与神经保护分子通路的工具在神经细胞系中的应用

本实验的总体目标是利用基于阻抗的技术，实时监测神经元细胞系的细胞保护作用，以阐明第二信使通路在保护过程中的参与机制。该目标通过以下步骤实现：首先，在基于阻抗的实时细胞分析系统中，于增殖条件下培养神经元细胞系；第二步，研究潜在的相关因素。

在对细胞系进行神经保护处理之前，先通过药理学方法抑制第二信使通路。随后，在不同实验条件下，利用实时细胞分析仪监测神经元细胞系的状态。最终，可通过统计学分析评估第二信使通路在神经元细胞保护作用中的实时参与情况。

与现有的终点神经毒性检测方法相比，该技术的主要优势在于，能够在无标记条件下实时评估神经细胞系中的Tito保护作用和Tito毒性。该方法有助于回答分子神经生物学领域的关键问题，通过体外高通量筛选潜在的神经保护化合物，并揭示参与神经保护作用的分子机制。首先洗涤贴壁的神经细胞系单层。例如，此处使用人神经母细胞瘤S-K-N-S-H细胞，用PBS洗涤后，在37摄氏度下用胰蛋白酶消化细胞5分钟。

通过离心去除胰蛋白酶，然后将细胞重悬于10毫升增殖培养基中。计数细胞后，用增殖培养基将细胞稀释至每毫升3×10⁵个细胞的浓度，随后在室温下的组织培养超净台中，向EPL 96的每孔加入100微升增殖培养基进行平衡。30分钟后，将EPL 96放入二氧化碳培养箱中37°C的实时细胞分析仪工作站内，并启动实时细胞分析软件。

然后在布局页面上，选择实验所需的适当孔位，并在时间表软件页面的编辑框中输入细胞类型、细胞数量以及目标化学化合物的名称和浓度，第一步已预设。为进行背景测量，选择“添加步骤”，并将第二步设置为每15分钟测量一次细胞指数，持续96小时。然后单击“开始”以启动第一步，并测量培养基的背景阻抗。

现在移除EPL，并向每个实验孔中加入100 µL神经母细胞瘤细胞悬液。轻轻摇晃EPL 96板，使细胞均匀贴壁，然后将该板置于超净台内的室温条件下孵育，使细胞沉降约30分钟。随后将EPL 96板重新放入实时细胞分析仪工作站，并启动第二步。为在整个实验过程中监测细胞指数值，可在绘图页面查看细胞曲线，并在细胞指数页面查看24小时的原始细胞指数数据。

接种细胞后，暂停实验并将培养板从实时细胞分析仪工作站中取出。向每孔中加入1 µL新近稀释的目标抑制剂，然后重新装入EPL 96板，30分钟后恢复细胞指数的测量。再次暂停实验，迅速但小心地从各孔中移除增殖培养基，移液时将移液器吸头边缘对准孔的角落，以避免破坏贴壁的细胞层。随后立即向每孔中加入200 µL无血清培养基，向相应孔中分别加入1 µL新近稀释的目标神经保护化合物以及1 µL目标第二信使通路抑制剂。

然后，按照之前设定的方案，每15分钟继续进行细胞指数测量，持续96小时以分析数据。现在，在绘图页面上选择归一化的细胞指数和归一化时间函数，将细胞指数归一化至细胞培养处理前的最后一个时间点，以减少实验间的差异。在绘图页面上选中感兴趣实验条件的孔，并点击“添加”以绘制归一化的细胞指数曲线。

然后，将细胞指数软件页面中所有细胞指数时间点的实验数据导出至电子表格文件，用于对不同处理条件下特定时间点的细胞指数值差异进行统计分析。在导出的电子表格文件中选择相应时间点的细胞指数值。最后，使用统计软件对选定时间点的细胞指数值进行单因素或双因素方差分析，并随后进行事后检验。这些图中显示了对细胞施加神经毒性刺激后细胞指数值的下降情况：当S-K-N-S-H细胞在增殖培养基中培养时，细胞指数增加；而在将细胞转换至无血清培养基后，细胞指数下降，随后稳定在新的较低水平。

当细胞在无血清培养基中培养时，加入两种5微摩尔的血清素2A受体激动剂DOI和20微摩尔的IDE，可观察到其神经保护作用。神经保护研究中的一个重要问题是，化合物对细胞增殖的影响是否有助于其对细胞存活的观察效应。在本图中，5微摩尔DOI处理对SKNS细胞增殖无影响，表明增殖并未对所观察到的神经保护效应产生贡献。

在本组最终的图表中，可以观察到使用 10 微摩尔磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 处理对细胞存活率的影响，以及 DOI 对血清剥夺的 SK-N-SH 细胞的神经保护作用。LY294002 在血清剥夺阶段阻断了 DOI 的神经保护作用，同时其自身也表现出一定的毒性效应。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用实时细胞分析仪在神经元细胞系中追踪 CTO 保护作用，并阐明第二信使通路在该保护作用中的参与机制。