Name: 用奔放的整体体积描记测量呼吸功能的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习使用无束缚全身体积描记法测量清醒啮齿动物的呼吸参数。该方法无需麻醉或约束，可实现肺功能评估的重复测量，适用于呼吸系统生理学的纵向研究。

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我们感谢 David Walker 教授在本技术开发过程中提供的技术建议和设备支持。本工作由维多利亚州政府运营基础设施支持计划资助。部分工作由维多利亚州政府运营基础设施支持计划资助。

注意：以下实验方案已获得莫纳什大学动物伦理委员会批准，并依照《澳大利亚科学研究用途动物护理与使用实践准则》（2006）进行。用于获得代表性结果的成年雌性 C57BL/6 小鼠由莫纳什动物服务中心提供。小鼠饲养于特定病原体阴性、温湿度可控的环境中，光照周期为 12 小时明暗循环。小鼠可自由获取食物和水。
1. 初始设置
<ol>
	<li>使用 USB 线缆将笔记本电脑/台式机连接到数据采集设备以进行记录。</li>
	<li>使用 BNC 线缆将桥式放大器从“输出 1”连接至数据采集设备的“输入 1”。</li>
	<li>将压力传感器插入八通道桥式放大器的“通道 1”。打开数据采集设备并启动分析软件。软件应能自动识别设备配置（参见材料与设备表）。</li>
	<li>在软件的设置工具栏中打开通道设置，将正在记录的通道数更改为 1。</li>
	<li>设置气压计以测量室内气压，并设置水柱装置以校准桥式放大器。水柱装置由两个通过塑料管连接的 5 ml 刻度移液器组成。</li>
	<li>用水填充水柱并使用直尺确保水位平衡。将一段塑料管分别连接到每个移液器的顶部。图 2展示了水柱装置的设置。</li>
</ol>
2. 桥式放大器校准
注意：校准桥式放大器时，需向水柱中注入空气，以产生1 cm H2O的偏转。该操作仅在特定条件下进行，具体取决于使用者的设备。为便于说明，以下步骤展示了本实验室进行校准的具体方法。
<ol>
	<li>用1 ml注射器吸取300 μl；将注射器连接至水柱右侧管路末端的三通阀。注意：确保三通阀对注射器和水柱开放，对室空气密闭。若此时水位未平衡，可旋转三通阀使其对室空气和水柱开放，以重新平衡水位。水柱左侧管路应连接至压力传感器，用于测量注射器推注所引起的压力变化。</li>
	<li>将左侧水柱的管路连接至压力传感器顶部环形接口。</li>
	<li>在软件主界面右侧通道1旁边找到下拉菜单，选择“Bridge amp”（参见材料与设备表）。</li>
	<li>将设置调整为5 mV、20 Hz低通滤波，勾选“反转”选项框，然后点击“归零”。再次点击“归零”以使基线稳定在约0 mV。将窗口大小调整为4:1，以便更清晰地观察。</li>
	<li>一切准备就绪后，按压1 ml注射器并保持3秒。由于压力发生变化，软件上将出现一个突然的峰值。当按压300 μl时，压力会使水柱中的水移动1 cm。该已知数值将用于校准桥式放大器。 
	注意：由于300 μl的凹陷，腔室内压力的增加对应于PK 用于后续计算的值。</li>
	<li>在Bridge Amp窗口左下角选择“input units”。</li>
	<li>突出显示加标前的“背景轨迹”，即所谓的“零区”。
	<ol>
		<li>单击“点 1”旁边的箭头，即可在此范围内产生背景信号&#160;-0.002 mV 至 -0.002 mV（该值永远不会恰好为 0 mV）。</li>
		<li>在背景信号窗口旁的窗口中输入“0”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当推动注射器时，标出图表中“压力升高区域”。点击第2个点旁边的箭头，其数值应在0.9–1.2 mV范围内。
	<ol>
		<li>在“增加压力”窗口旁边的输入框中输入“1”。有关步骤 2.7 和 2.8 的图示说明，请参见 图3. 超出规定范围的数值可能表明 Octal Bridge Amp 出现损坏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转至窗口右上角的“定义单位”，并选择“cmH”2O”。如果此选项不可用，可手动输入。点击“确定”。</li>
	<li>返回“Bridge Amp”菜单（参见2.1）。选择1 mV并将放大器设为“zero”。此操作将完成校准，可安全移除水柱。</li>
</ol>
3. 肺功能记录
<ol>
	<li>称量小鼠体重（g）。注意：在进行生理评估前一周，将小鼠引入体积描记室环境中，以帮助其适应环境，减少后续操作时的应激反应。有关无创通气体积描记（UWBP）装置的整体示意图，请参见图4。</li>
	<li>使用直肠温度计测量体温。插入前先用凡士林润滑温度计。记录温度读数，并用80%（v/v）乙醇擦去残留润滑剂。若使用非常小的动物（如新生小鼠），可改用红外温度计测定平均体温。</li>
	<li>将温湿度探头置于体积描记室单孔端。在放入小鼠前，记录体积描记室内温度、湿度和大气压。</li>
	<li>将小鼠放入体积描记室，轻微覆盖开放端，使其适应环境，随后关闭腔室。</li>
	<li>将温湿度探头插入体积描记室一侧的单孔中，再将换能器和注射器插入另一侧的双孔中。</li>
	<li>在软件程序中点击“开始”，记录约15–45秒。选取动物静止不动的5–10秒数据进行记录；运动将改变动物的基础呼吸生理状态，导致结果不理想。呼吸波形应在软件中呈线性振荡，此类数据可用。注意：排尿或排便可能导致体积描记室内温度和湿度升高，干扰后续分析结果。一旦发生排尿或排便，应立即停止记录，并用80%（v/v）乙醇清洁体积描记室。参见图6中所示非理想结果的图示，此类数据应予以剔除。</li>
	<li>记录45秒后，在软件程序（见材料与设备表）中点击“停止”。将小鼠从体积描记室中取出，并立即记录腔室内的温度和湿度。单次记录时间不得超过45秒，以免对动物造成应激。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，用80%（v/v）乙醇喷洒并擦拭体积描记室。</li>
	<li>待体积描记室干燥并恢复至基线温湿度后，再对下一只小鼠进行操作。对后续动物重复步骤3.1至3.9。注意：若需检测多只动物，每次放入新动物前，须确保体积描记室的温度和湿度已恢复至接近基线水平。</li>
</ol>
4. 体积描记法分析
注意：要计算呼吸参数（如潮气量（VT）和每分钟通气量），需要测量以下变量：呼吸频率（次/分钟）、总呼吸周期时间（秒）、吸气/呼气时间（Ti/Te，秒）以及每次潮气量引起的压力变化（PT）。图1展示了从呼吸曲线中可测量的参数。以下步骤使用一种软件（见材料与设备表）来测量这些变量。分析时应避免包含嗅探或运动干扰的曲线区域。为了获得可重复的结果，至少需要5秒质量良好的呼吸曲线。有关不同呼吸曲线的示例，请参见图5和图6。
<ol>
	<li>将屏幕设置为全屏，视图设为 1:1，并选取 5 秒可用数据。代表性截图如图 5所示。</li>
	<li>打开程序顶部“DataPad”标签页中的迷你数据面板窗口。选择通道 1，在左侧栏选择“cycle measurements”，在右侧栏选择“average cyclic height”。
	<ol>
		<li>点击“Option”，将最小峰值检测的时间尺度设为 1（毫秒）。此设置可检测每一个峰值，在使用产生微小振荡的小型动物时尤为重要。</li>
		<li>点击“OK”。此时将显示“每次潮气量引起的压力偏转”（PT）测量值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在迷你数据面板中，选择“cycle measurements”，然后选择“event count”，点击“OK”。此时将显示“频率”（f）测量值。
	<ol>
		<li>需将频率转换为次/分钟（breaths/min）。方法是将测得数值乘以 60 秒，再除以总记录时间（分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在迷你数据面板中，选择“cycle measurements”，然后选择“period”，点击“OK”。此时将显示“总呼吸周期时间”（Ttot，秒）测量值。</li>
	<li>接下来的步骤用于创建宏指令，以生成吸气和呼气峰值时间值。确保光标精确位于波峰/波谷的最大值上方，并对连续 9 个波峰和波谷添加注释。从振荡波形的波峰开始，如图 5所示。</li>
	<li>随后，选择“window: data pad”和第 1 列。在弹出窗口中，左侧栏选择“selection information”，右侧栏选择“duration”，点击“OK”。</li>
	<li>选择程序顶部的“macro”功能并开始录制。然后依次选择命令：“Find”、“Go”、“Start of File”，再点击“Find”。</li>
	<li>选择命令：“Find”和“Find comments”。在“containing”框中输入与注释框中相同的短语。选择“Select to Previous Point”选项卡，点击“Find”。</li>
	<li>选择命令：“Add to data pad”。接着选择“macro: macro commands”并开始循环。弹出的循环次数窗口应设置为 9。</li>
	<li>选择命令：“Find next”。选择命令：“Add to data pad”。最后选择“macro commands”并结束循环。
	<ol>
		<li>现在选择该宏并停止录制。保存并以动物编号命名该宏。注意：为每只动物设置宏指令，可便于纵向研究使用，并节省时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>现在可运行该宏，以获取每条注释之间的吸气（Ti）和呼气（Te）时间值。数据将显示在数据面板的通道 1 下。呼气与吸气连续发生，数据也将按此顺序排列。
	<ol>
		<li>需手动将数据拆分为吸气和呼气数值。对每个参数的四个数据值取平均，以获得平均 Ti 和 Te。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在获得主要参数后，可计算潮气量（VT，ml）。使用 Drorbaugh 和 Fenn8 的公式计算潮气量： 
	VT (ml)= (PT / PK) x (VK) x ((TCORE(PB - PC)) / (TCORE(PB - PC) - TC(PB - PCORE))) 
	 
	其中 
	VT：潮气量 
	Pk：每次注入 1 ml 引起的压力偏转（参见步骤 2.5） 
	Tcore：每只动物的核心温度 
	PC：腔室温度下的水蒸气压 × 腔室相对湿度 
	TC：动物腔室内的温度 
	Pcore：体温下的压力（体温时的水蒸气压 × 1.0） 
	Pt：每次潮气量引起的压力偏转 
	Vk：校准用的注入体积 
	&#160;PB：大气压 
	&#160;</li>
	<li>在计算出潮气量后，还可进一步确定以下参数：
	<ul>
		<li>每分钟通气量（ml/min） = VT × f</li>
		<li>每分钟通气量（ml/min/kg） = (VT × f) / 体重（kg）</li>
		<li>VT（ml/kg） = VT（ml） / 体重（kg）</li>
		<li>吸气时相占比（%） = Ti / Ttot</li>
		<li>吸气流速（ml/sec） = VT / Ti</li>
		<li>吸气时间与呼气时间比值 = Ti / Te</li>
		<li>总呼吸周期时间（秒） = 吸气时间（秒） + 呼气时间（秒）</li>
	</ul>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。作者无任何冲突需要披露。

本文所述技术是一种用于评估未束缚且未麻醉小鼠呼吸参数的非侵入性方法。该方案的优点在于操作简便，能够纵向精确测量肺功能，且产生的干扰极小。然而，该操作过程中也存在一些局限性和关键步骤需要注意。首先也是最重要的一点是，小鼠必须在舱室内保持安静至少五秒钟。额外的压力会干扰小鼠的呼吸模式，从而导致结果波动（图6a）。这一缺点可能始终存在，在某些情况下属于正常现象。但通过将小鼠放回其饲养笼内，并给予足够时间使其恢复平静，即可轻松纠正。为获得连续五秒合适且可用的数据，必须确保动物在舱室环境中感到舒适。此外，还需关注舱室环境本身的影响。与呼吸力学无关的环境因素可能显著影响实验结果。随着检测时间延长，舱室内的湿度和温度会上升，同时可用氧气减少，这些变化会显著影响通气状况。通气时间的延长会导致舱室内湿度和温度升高，并减少可用氧气含量21。在舱室中设置微小泄漏口有助于减轻因产热引起的热漂移22,23。本文所述方案针对所列设备和仪器而设定。第二节中桥式放大器的校准将取决于使用者所用的具体设备。如果诸如导管长度等因素有所不同，则注入300 µl空气可能不会引起1 cm.H2...

肺功能障碍是全球发病率和死亡率的主要原因之一。该病症以氧气交换不足为特征，常伴有咳嗽、胸痛和呼吸困难。呼吸系统疾病约占全球死亡率的10%1根据世界卫生组织的数据，由于持续的吸烟和污染，死亡率预计将上升 &amp;#38; 职业性刺激物。UWBP 是研究肺生理学的一项有效补充技术，可与传统的生化和组织学分析方法相互印证2. 用于肺部评估的其他方法无法提供与UWBP相同的优势。侵入式体积描记法是一种常用技术，但需要对动物进行麻醉3,4 因此，所获得的呼吸测量结果未必能反映自然状态。此外，机械通气和化学刺激的要求也限制了后续测量的进行。3,4另一种收集呼吸数据的方法是强迫振荡法，与无创全身体积描记法（UWBP）相比，该方法对呼吸参数的细微变化更为敏感。5然而，强迫振荡是一种侵入性技术，需要在数据采集时终止动物生命。5-7.
超声波肺功能检测（UWBP）需要将动物置于一个特制的密闭舱内。在吸气过程中，潮气在肺内被加温加湿，导致水蒸气压升高并引起气体热膨胀8。这一效应引起空气体积的净变化，从而导致体积描记舱内的压力升高8。在呼气过程中则发生相反的变化，由此形成动物的呼吸波形。随后通过波形分析从呼吸轨迹中测量以下参数：呼吸频率（次/分钟）、总呼吸周期时间（秒）、吸气/呼气时间（Ti/Te，秒）以及每次潮气量引起的压力变化（PT）。图1展示了呼吸轨迹中各项测量值的来源。这些测量值易于计算，并可进一步推导出多种呼吸参数，包括：潮气量（正常吸气与呼气之间移动的空气体积）、每分钟通气量（每分钟吸入肺内的气体体积）、吸气占空比（吸气时间占总呼吸周期时长的百分比）以及吸气流速（单位时间内吸入的空气量）。
非侵入性全身体积描记法（UWBP）可对动物模型的呼吸生理学进行精确、无创的定量分析，可用于评估呼吸系统疾病的进展和肺功能6,9。与其他体积描记技术不同，UWBP避免了使用麻醉剂、束缚和侵入性操作，从而减少了由此产生的伪影和实验变异性6,9。麻醉可能抑制呼吸、改变心率，且难以精确调控10。束缚会通过皮质酮和肾上腺素的释放引发额外应激，导致呼吸频率升高11,13。UWBP的关键优势在于可进行重复的生理学评估，因此适用于纵向研究。UWBP被强烈推荐用于肺生理功能的纵向评估，是未来呼吸系统药物评价中一项重要的技术手段。
博来霉素、卵清蛋白和低氧已被多项研究用于诱导呼吸系统挑战，而无创全身体积描记法（UWBP）已成功实现了对肺部生理功能的准确评估7,9,13-16。所述方案专为标准成年实验小鼠设计。然而，UWBP也已应用于其他动物，如大鼠、豚鼠和非人灵长类动物17-20。UWBP不仅限于评估肺功能障碍，还曾用于评估肺成熟度3。由于其多功能性、操作简便性和可重复性，UWBP已成为评估动物肺功能的一种优良技术。执行本方案需要使用多种软件（见材料与设备表）。经验丰富的科研人员可在1&#160;小时内完成单只小鼠的实验操作。

<table><tbody><tr><td>LabChart 7 软件（适用于 Macintosh）</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLU60/7</td><td>用于方案步骤4</td></tr><tr><td>PowerLab 8/30（型号 ML870）</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>八通道桥式放大器（型号 ML228）</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>黑色BNC转BNC电缆（1米）</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>Macintosh 操作系统</td><td>Apple Inc.</td><td></td><td>Mac OS X 10.4 或更高版本</td></tr><tr><td>Surgipack 数字直肠体温计</td><td>Vega Technologies</td><td>MT-918</td><td></td></tr><tr><td>Grass容积式压力换能器PT5A</td><td>Grass Instruments Co.</td><td>型号 PT5A；序列号 L302P4</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清学移液吸管</td><td>Greiner Bio One</td><td>606160</td><td>通过塑料管连接</td></tr><tr><td>天平/秤</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>SHIMAUW220D</td><td>分辨率为0.1克的任何电子天平</td></tr><tr><td>HM40 湿度 &amp;和温度计</td><td>Vaisala</td><td>HM40A1AB</td><td></td></tr><tr><td>气压计</td><td>气压计世界</td><td>1586</td><td></td></tr><tr><td>实验室管路</td><td>道康宁</td><td>508-101</td><td>用于连接水柱、注射器和压力传感器</td></tr><tr><td>圆柱形有机玻璃室</td><td>Dynalab 公司</td><td></td><td>定制圆柱形腔室，内部尺寸为：50 mm（宽）× 1,500 mm（长）。腔室两端各有一个盖子，尺寸为80 mm（长）× 80 mm（宽）。每个盖子正面开有一个直径60 mm、深50 mm的圆形孔，用于容纳腔室。在盖子的每个孔周围安装有橡胶圈，以确保腔室与盖子紧密贴合。用于连接注射器和压力传感器的开口直径为5 mm；用于连接湿度探头的开口直径为25 mm。</td></tr><tr><td>80% 乙醇（4 L）</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>BDH1162-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

使用无束缚全身体积描记法测量小鼠呼吸功能

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

呼吸功能障碍是全球发病率和死亡率的主要原因之一，且死亡率持续上升。在啮齿类动物模型中对肺功能进行定量评估，是未来疗法开发的重要工具。目前常用的呼吸功能评估技术包括侵入式体积描记法和强制振荡技术。尽管这些技术能够提供有价值的信息，但由于需要对动物进行麻醉和/或侵入性操作，数据采集过程中常出现伪影和实验变异性。相比之下，非限制性全身体积描记法（UWBP）提供了一种精确、非侵入性且可定量的呼吸参数分析方法。该技术避免了传统体积描记法中常见的麻醉和束缚步骤。本视频将演示UWBP的操作流程，包括设备安装、校准以及肺功能记录；并讲解如何分析所采集的数据，识别由动物活动引起的实验异常值和伪影。通过该技术获得的呼吸参数包括潮气量、每分钟通气量、吸气时相占比、吸气流速以及吸气时间与呼气时间之比。UWBP操作无需特殊技能，成本低廉。UWBP的一项关键特性，也是其对潜在用户最具吸引力之处，是能够在同一只动物上重复进行肺功能测量。

当正确执行该操作步骤后，数据分析软件上会生成一条稳定的振荡轨迹。在完成设置后的几分钟内，该方法即可提供呼吸轨迹，并通过简单的计算确定所列的呼吸参数。图5展示了一条来自对照组（健康）小鼠的合适呼吸轨迹。当动物未主动移动时，即可获得适当的振荡数据。
UWBP 是评估对照组与肺纤维化队列小鼠肺功能的一种极为有用且可靠的手段。图7展示了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠在第14天的肺功能情况。与对照组图谱相比，图7显示出与博来霉素给药一致的可视化差异7。如前所述，该检测可重复进行，从而允许我们观察这两组之间呼吸参数随时间的变化。
结果应以均值 ± 标准误（SEM）表示。建议将收集的数据复制粘贴到一个简单的 Excel 电子表格中，以便进行步骤 4.13 和 4.14 中讨论的计算。呼吸功能可在两组之间进行直观比较，如图8所示。
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呼吸生理学的评估传统上依赖于需要对动物进行束缚或麻醉的技术。然而，无束缚式整体容积描记法能够对动物模型的呼吸生理学提供精确、无创且定量的分析。此外，该技术允许对小鼠进行重复的呼吸评估，从而实现纵向研究。

呼吸功能障碍是全球发病率和死亡率的主要原因之一，且死亡率持续上升。定量……

本实验的总体目标是通过非约束式全身体积描记法，测量清醒啮齿类动物的呼吸参数。首先需校准电桥放大器，校准完成后，将小鼠放入体积描记室中，使其适应环境后再进行测试。接下来，记录腔室内发生 的压力变化。然后，利用体积描记系统获取的信息计算多种呼吸参数。结果表明，非限制性全身体积描记法是一种评估啮齿类动物肺功能的可靠方法。与现有的侵入性体积描记法相比，该技术的主要优势在于动物无需麻醉，因此不会引入与麻醉相关的干扰因素。此外，由于本方案具有非侵入性特点，可实现对同一动物进行多次纵向测量。通常，初次使用该技术的研究人员往往低估了动物适应等离子腔所需的时间。首先，设置数据采集系统的桥式放大器和压力传感器。准备就绪后，转至计算机并打开分析软件。在设置工具栏中找到通道设置选项，并将正在记录的通道数量更改为一个。接下来，按照演示设置水柱装置。用塑料管将两支5 mL的血清移液管连接起来。用水填充柱体，并确保水位平衡。使用直尺将一段塑料管连接到每根移液管的顶部。为校准桥式放大器，首先将一个装有300微升空气的一毫升注射器连接到水柱的右侧。将左侧的管路连接到压力换能器的接头上。接下来，打开下拉菜单并选择桥式放大器（bridge amp）。输入正确的设置参数，然后点击归零，使轨迹线大约位于零毫伏处。准备就绪后，按下一毫升注射器，由此产生的压力将使液柱中的水移动一厘米，并因压力变化在软件上显示一个突然的尖峰。接下来，从桥接放大器窗口中选择输入单位，并选中动作电位之前的背景轨迹，即所谓的零区域。点击 0.1 旁边的箭头，以生成介于负 0.002 毫伏至正 0.002 毫伏范围内的背景信号。在背景信号窗口旁边的输入框中键入“zero”。在注射器被按压时，于图表上标出压力升高的区域。点击 0.2 旁边的箭头，该数值应在 0.9 至 1.2 毫伏范围内。接着，在窗口中输入数字1。在增压窗口旁，进入“定义单位”并选择厘米水柱（cm H₂O），然后点击确定。返回至桥式放大器菜单。选择1毫伏并将放大器调零。这将完成校准，可安全移除水柱。为获得最佳结果，应在实验开始前一周将待测动物引入体积描记室。首先，将温湿度探头放置于体积描记室的一端，记录温度、湿度和大气压。记录动物体重和体温后，将其放入体积描记室内，并关闭舱门。接着，将换能器和注射器插入舱体另一侧的两个孔中。启动软件程序并记录最多45秒。确保在动物不活动时记录五秒的数据。45秒后停止记录，并将小鼠从体积描记室中取出。立即记录箱内的温度和湿度。将小鼠放回笼中，用80%（体积比）乙醇喷洒并擦拭实验箱，待其干燥并恢复至基础温度和湿度后，再进行下一只小鼠的实验。首先，全屏打开程序并选择数据。打开迷你数据面板窗口，在左侧栏中选择“循环测量”和“平均循环高度”。在第一列的右侧栏中选择“选项”，并将最小峰值检测的阈值设为1。这将在迷你数据 pad 中显示由于潮气

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Biology

生物学

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使用无束缚全身体积描记法测量小鼠呼吸功能

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