光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

以下实验的总体目标是从表达通道视紫红质2的小鼠皮层中间神经元中获得高质量的细胞外单细胞记录。通过将高阻抗记录电极推进至组织中，利用中间神经元对蓝光脉冲产生的放电反应来识别目标细胞。监测电信号的变化，以判断推进速度是否合适，并评估获得稳定且分离良好的记录的可能性。

如果无法获得良好的单细胞分离效果，或者相反地，很少记录到光响应性神经元，则应更换记录电极。实验结果表明，通过光遗传学方法识别的神经元能够稳定产生光诱发的反应，并展示了采用该策略所获得的典型信噪比。光刺激方法是一种简便且经济的手段，可利用标准的细胞外放大器和蓝光靶向特定的基因型细胞类型。

这是我们在麻醉状态下的听觉皮层中特异性标记特定中间神经元的策略，但其中更普遍的要点也适用于其他皮层区域中的稀疏细胞类型。开始该操作时，先通过腹腔注射氯胺酮-甲苯噻嗪混合物对动物进行麻醉，然后将其置于立体定位仪或其他头部固定装置中，并确保颅骨被牢固固定。这对于维持稳定的单细胞记录至关重要。

接下来，将眼药膏涂抹于眼睛以防止干燥，并将动物体温维持在37摄氏度。为获得更稳定的记录效果，进行枕骨大孔胸骨引流：用手术刀片去除后颅骨组织，暴露枕骨大孔。然后用刀尖在软脑膜上做一个小切口，以引流脑脊液。现在使用手术刀，在目标皮层区域上方进行一个小的开颅手术。

随后，去除硬脑膜，然后用一层温热的琼脂覆盖暴露的皮层。用生理盐水保持琼脂湿润。准备一个舌状支架电极。

用瞬间胶和加速剂将电极粘附到玻璃毛细管上，然后添加热缩管以增加握持力。随后，将电极安装在电动或液压显微操作器上，并将其设置为垂直于皮层表面移动。

将接地线插入皮肤下方并紧贴颅骨。避免与头部侧面和颈部后方的肌肉接触，因为这些肌肉可能产生肌电图伪迹。使用适合单细胞记录的细胞外放大器放大电信号，最好选用带有阻抗检测模式的放大器。

通过两台示波器和一组有源扬声器监测持续的放电活动。现在将电极穿过硬脑膜，并检测其阻抗，确保其在7至14兆欧姆之间。当电极尖端穿透皮层表面时，在显微操作器上将此位置归零。

为了最准确地估计记录深度，需通过视觉确认电极尖端在深度为零处穿出皮层表面。在听觉皮层穿刺结束并回撤电极时，为确保该零点设定值对应于皮层水平，应监测刺激诱发的场电位。在将电极推进穿过组织最表层的数百微米过程中，需确认局部场电位的极性在约100微米深度处发生反转。

接下来，将连接至蓝光光源的光纤安装到手动显微操作器上。使用能够输出特定宽度和持续时间TTL脉冲序列的控制单元调节光源输出。然后在两台示波器上同时监测信号。

使用功率计测量光纤末端的总光功率。将该值除以光纤纤芯的横截面积，以计算辐照度。起始值应在每平方毫米10至15毫瓦的范围内。

使用显微镜将光纤尖端尽可能靠近嗅球表面。将光束中心对准电极进入组织的位置。现在检查电极在嗅球中时是否存在光伪影。

施加一个脉冲应变。通过重新调整光纤相对于电极的位置，改变入射光的角度，以消除任何瞬态光伪影。如果伪影仍然存在，尝试降低光源功率。

接下来，以大约每秒一微米的速度缓慢将电极推进穿过脑组织。使用一台示波器监测电极的持续活动，另一台用于触发激光脉冲。

在音频监视器上聆听光刺激引发的微弱放电声，这表明电极正在接近表达通道视蛋白的细胞。一旦光刺激引发放电，即应减缓推进速度。动作电位足够大，可在示波器上被单独触发显示。

开始操作。调节横轴上的刻度以观察峰电位波形的精确形状。此时，停止推进电极，并等待其在组织中稳定。

这对于获得稳定的记录至关重要。数分钟后，如果信噪比仍未改善，则再向前推进五微米并等待。重复此过程，直至能够以电压阈值可靠地捕获动作电位的峰值或谷值。

记录时将信号设置在远高于噪声基线的水平。在第一台示波器上监测持续的电活动，同时使用第二台示波器观察尖峰放电的大小和形状，并注意其在扬声器中发出声音的质量。

仔细聆听信号中的突然变化，这表明细胞正在靠近或远离电极。若尖峰信号变大且发生畸变，应撤回电极；若信号变小，则推进电极。

以两微米为步长缓慢移动，以确认尖峰信号的质量。在较宽范围的阈值条件下叠加所有尖峰波形。应仅观察到一种高度一致的稳定尖峰形状。

大多数PV阳性细胞能够持续放电达整整一秒。如果信号受到邻近神经元放电的污染，应推进电极，在每次穿刺中寻找新的细胞，并将电极穿过皮层的全部深度。如果经过多次穿刺仍未记录到光反应性神经元，或者相反，记录中持续受到邻近通道、视蛋白阴性细胞放电的污染，则应更换新的电极。

该图展示了三种经光学鉴定的中间神经元的示例记录。这些细胞对搜索脉冲序列产生可靠的簇状放电反应。图中显示了100次扫描的叠加峰电位以及平均插值后的波形。

这些群集图显示了光诱发峰电位的稳定时序。此处展示了部分功率伏特正性中间神经元的首次峰电位潜伏期。

光刺激方法在概念上非常简单，但实际上可能具有出人意料的挑战性，且成功率较低。在实际操作中，玻璃膜片电极明显倾向于记录参数神经元，因此很少能获取到内侧神经元。

另一方面，使用多通道电极记录时，能够获得大量对光有反应的中间神经元，但其动作电位幅度较小，且存在大量重叠的波形，因此很难可靠地将其分离为单个神经元单位。我们尝试了多种方法来解决这一问题，对于中间神经元，我们发现这种尖端直径为10至14兆微米的电极在监听半径方面达到了最佳平衡：该半径必须足够大，以便远距离检测到光激活的动作电位，但又必须足够小，以实现良好的单神经元信号隔离。不过这其中仍有一些经验性因素。

如果无法实现这一点，放弃该电极并继续尝试下一个，直到找到可用的电极，这样可以节省大量时间。