Name: 指南在体内单单元从Optogenetically鉴定皮质抑制性录像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习利用光遗传学技术在小鼠皮层中记录抑制性中间神经元的单单元电生理信号。该方法通过ChR2表达和蓝光刺激实现细胞类型特异性识别，为神经科学研究提供经济可靠的电生理记录方案。

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本工作由怀特霍尔基金会和美国国立卫生研究院（NIH）资助。我们感谢克拉福德·达克斯（Clifford Dax，俄勒冈大学技术支持管理局）在设计光递送电路方面提供的帮助与专业知识。

注意：以下实验方案遵循美国国立卫生研究院指南，并已获俄勒冈大学动物护理与使用委员会批准。
1. 急诊外科
<ol>
	<li>通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮-美托咪啶混合物使动物麻醉（表1）。 
	注意：本实验所用小鼠由cre依赖性ChR2-eYFP转基因品系10与中间神经元驱动品系（Pvalb-iCre11，PV+；Sst-iCre12，SOM+；Cr-iCre12，CR+）杂交获得。若表达水平相似，病毒递送ChR2或相关视蛋白应具有同等效果。</li>
	<li>手术开始前，确认动物对轻柔脚趾夹捏无反应。根据需要在实验过程中重复给予麻醉剂，以维持该麻醉深度。若使用注射类麻醉剂，可选择性地植入腹腔导管用于维持给药。</li>
	<li>在整个实验过程中，使用生理盐水或乳酸林格液保持动物水合状态（约3 ml/kg/hr），例如通过使用适当稀释的麻醉混合液进行维持注射（表1）。</li>
	<li>将动物置于立体定位仪或其他头部固定装置中，确保颅骨牢固固定。这对于维持稳定的单细胞记录至关重要。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥，维持体温在36.5–37 °C。</li>
	<li>进行小脑延髓池引流以增强记录稳定性。使用手术刀片去除颅骨后部组织，暴露小脑延髓池。在硬脑膜上做一小切口以引流脑脊液。仅使用刀尖操作，避免接触小脑或脑干。</li>
	<li>使用手术刀在目标皮层区域上方进行小范围开颅（约2 mm2）（对于听觉皮层，大致位于前囟后方-2.3 mm，中线外侧4.5 mm）。</li>
	<li>去除硬脑膜，并用一层温热的琼脂糖覆盖暴露的皮层（0.5–1 mm厚，1.5%琼脂糖溶于生理盐水0.9% NaCl，约37 °C时应用）。实验过程中定期滴加数滴生理盐水，保持琼脂糖湿润。</li>
</ol>
2. 记录装置设置
<ol>
	<li>准备一根钨电极（7-14 MΩ，直径127 μm，锥角12°，环氧树脂涂层）。用万能胶将电极粘附到玻璃毛细管上，并添加热缩管以增加握持性（图1）。</li>
	<li>将电极安装在电动（或液压）微操作器上，使其移动方向垂直于皮层表面。将一根接地导线置于头皮下，紧贴颅骨。避免与头侧及颈部后方的肌肉接触，因其可能产生肌电图伪迹。</li>
	<li>使用适用于单神经元记录的细胞外放大器对电信号进行放大，最好配备阻抗检测模式。通过两台示波器和一组有源扬声器监测持续的放电活动（带通滤波300 - 5,000 Hz）。此处，记录的数据以10 kHz的采样率连续数字化；动作电位在离线状态下提取。</li>
	<li>将电极推进琼脂糖中，直至其尖端到达皮层表面。通过显微镜观察此过程，并在微操作器上将此位置设为“零”点。</li>
	<li>为最准确地估算记录深度，在每次穿刺结束时撤回电极，通过视觉确认电极尖端在深度为零时恰好离开皮层表面。 
	注意：若微操作器读数与实际观察到的电极位置存在差异，表明电极相对于组织发生了漂移。这可能是由于脑组织或动物不稳定，或微操作器自身漂移所致。
	<ol>
		<li>为额外验证该零点设定确实对应于皮层表面，可在电极穿入组织最初数百微米的过程中，监测刺激诱发的场电位。监测场电位时，将细胞外放大器的低频带通滤波截止频率调低至10 Hz。确认局部场电位的极性在约100 µm深度附近发生反转，该位置接近第I/II层交界处13。此点在听觉皮层中是一个可靠的参考标记，但在其他皮层区域可能有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一根连接蓝光光源的光纤（图2）安装在手动微操作器上。通过显微镜，将光纤尖端尽可能靠近琼脂糖表面放置，并使光束中心对准电极进入组织的位置。</li>
	<li>使用能够输出特定宽度和持续时间的TTL（晶体管-晶体管逻辑）脉冲序列的控制单元调节光源输出——例如 Arduino控制器（图3）、计算机I/O卡（如图所示）或市售的脉冲发生器。
	<ol>
		<li>在两台示波器上同时监测信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用功率计测量光纤尖端的总光功率（mW）。将该值除以光纤芯的横截面积，计算出辐照度（mW/mm2）。初始强度建议设定在10 - 15 mW/mm2范围内，必要时可逐步降低，直至消除伪迹。</li>
	<li>将电极置于琼脂糖中、即将进入组织前，检查是否存在光伪迹。启动搜索脉冲序列（例如，30毫秒光脉冲，刺激间间隔500毫秒）。
	<ol>
		<li>通过调整光纤相对于电极的位置以改变入射光角度，消除瞬态光伪迹（图4）。若伪迹仍存在，可尝试降低光功率。在极少数无法完全消除伪迹（仅能最小化）的情况下，可延长搜索脉冲的持续时间，以帮助识别真实的神经元放电。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 直接 PINP 操作
<ol>
	<li>以大约1 µm/sec的速度将电极缓慢推进穿过脑组织。使用一台示波器监测持续的电活动，另一台示波器用于触发激光脉冲。</li>
	<li>在音频监视器上聆听光诱发锋电位微弱的“咔嗒”声，这表明电极正在接近ChR2+细胞，且通常在示波器上尚未明显显示电信号之前即可察觉。此时应减缓推进速度。 
	注意：如果细胞正好位于电极路径上，光诱发的活动将变得更强烈（声音更大）。当电极接近单个中间神经元时，杂乱信号将转变为微小但形态和大小均一的清晰峰电位。</li>
	<li>一旦光刺激诱发的动作电位在示波器上足够大，能够单独触发时，即开始进行记录。调整水平轴的缩放比例，以观察动作电位波形的精确形状。</li>
	<li>停止并等待组织沉降。切勿急于将电极向细胞靠近。此步骤对获得稳定的记录至关重要。若数分钟后信噪比仍未改善——即组织已沉降，但细胞并未更接近电极尖端——则再向前推进5 µm，并再次等待。
	<ol>
		<li>重复此过程，直至能够以远高于噪声基线的电压阈值稳定地记录到动作电位的峰值或谷值（例如， ±300 µV 或更大 
		注意：在使用PINP激活抑制性中间神经元时，假阳性或结果模糊的风险极低。大多数细胞能够稳定跟随脉冲持续时间为30毫秒、脉冲间隔为500毫秒或更短的脉冲序列，且首个动作电位的潜伏期可靠地保持在2–5毫秒范围内。图5）。特别是大多数PV+细胞能够持续放电达完整1秒（图6由于这些是抑制性神经元，因此不必过于担心双突触（间接）激活的问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录过程中，通过第一台示波器监测持续的电活动，利用第二台示波器密切观察峰电位的大小和形态，并注意听扬声器中峰电位声音的质量。
	<ol>
		<li>仔细聆听信号的突然变化，这表明细胞可能过于接近电极（存在被刺穿或损伤的风险），或正在远离电极。如果尖峰信号变得显著且失真，应缓慢回撤电极；如果信号逐渐变小，则向前推进电极。以 2 µm 为步长缓慢移动。</li>
		<li>通过将所有峰电位波形叠加并以波峰或波谷对齐，事后确认记录质量。调整电压阈值，在较宽范围的阈值下，应仅存在一种高度一致的稳定峰电位形态（图5a).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果在任何时候信号受到邻近神经元尖峰的污染，则继续推进。缓慢前进，寄希望于电极可能脱离邻近细胞的记录范围，但仍保持在目标神经元的范围内。（这种情况通常不会成功。）</li>
	<li>在每次穿刺过程中，将电极穿过整个皮层深度（900+ µm）。如果经过多次穿刺仍未记录到光响应神经元，或者相反，记录中持续受到邻近ChR2-细胞的尖峰干扰，则更换新的电极。 
	注意：即使在同一生产批次中，各个电极的阻抗和尖端几何形状也可能存在显著差异。这两个因素共同影响电极的有效“监听半径”，该半径在搜索过程中必须足够大以检测光诱发的放电脉冲，同时又需足够小，以实现对单个中间神经元的独立记录。</li>
	<li>根据需要测试电极的阻抗。为避免损伤组织，应将电极尖端置于琼脂糖层上部，远离脑组织。在7–14 MΩ范围内，阻抗的具体数值并不能确切预测该应用中的记录性能或神经元信号获取数量。然而，阻抗可作为监听半径的合理参考指标：低阻抗电极可记录到更多神经元信号，高阻抗电极则记录到的信号较少。</li>
	<li>实验结束时，采用机构批准的方法处死动物，例如麻醉过量，或在深度麻醉状态下进行颈椎脱位。</li>
</ol>

<ol><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Moore, A. K., Wehr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+inhibitory+interneurons+in+auditory+cortex+are+well-tuned+for+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency.</a> J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).</li>
<li>Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+interneuronal+inhibition+in+the+cerebral+cortex+of+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals.</a> Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+interneurons+linearly+transform+cortical+responses+to+visual+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli.</a> Neuron. 73, 159-170 (2012).</li>
<li>Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+subtraction+by+distinct+cortical+inhibitory+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo.</a> Nature. 488, 343-348 (2012).</li>
<li>Letzkus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+microcircuit+for+associative+fear+learning+in+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex.</a> Nature. 480, 331-335 (2011).</li>
<li>Pi, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneurons+that+specialize+in+disinhibitory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control.</a> Nature. 503, 521-524 (2013).</li>
<li>Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3, 159(2005).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

尽管PINP在概念上很简单，但在实际操作中可能具有挑战性。成功的关键因素之一是电极的选择。电生理记录的监听半径是一个关键参数。该半径必须足够大，以便在电极尖端距离ChR2+细胞尚有一定距离时，仍能检测到光诱发的动作电位，从而可以根据信号调整推进速度。同时，该半径又必须足够小，以实现良好的单细胞单位分离，即电极不应同时记录到邻近ChR2-细胞的放电活动。在监听半径上实现恰当的平衡对于任何靶向细胞类型而言都是一项挑战，而对于抑制性中间神经元尤其如此，因为这类细胞分布稀疏、体积较小，且常常与具有较大细胞外放电信号的锥体细胞紧密相邻。即使采用本文建议的策略，预期的记录成功率也不高。在满足单细胞单位分离质量高且记录时长超过半小时的标准下，我们通常每只动物可获得0–2个PV+神经元。
在PINP抑制性神经元时，双突触（间接）激活并不是主要问题，因为抑制性神经元相对不太可能间接激活突触后细胞。而在PINP兴奋性神经元时，双突触激活较为常见；许多在光照下产生动作电位的神经元并不表达ChR2，而是接受了来自表达ChR2神经元的强效突触兴奋。如何区分直接激活与间接激活的神经元，Lima et ...

表征构成哺乳动物大脑的众多细胞类型一直是神经生理学的核心目标，但长期以来难以实现。例如，大脑皮层中不同抑制性细胞类型的特性与功能备受关注，但目前仍知之甚少。部分原因在于，传统的盲法体内记录技术在区分不同细胞类型方面存在局限性。虽然可通过细胞外动作电位的波宽来区分假定的钙结合蛋白阳性抑制性神经元与兴奋性锥体细胞，但该方法容易产生I型和II型错误2,3。另一种方法是将记录的神经元进行染料填充、回收并染色，以事后确认其形态学和分子特征，但这一过程费时费力。近年来，通过钙成像或视觉引导的膜片钳记录技术，已可对基因定义的抑制性中间神经元群体进行研究。在这些方法中，通过病毒载体或转基因手段表达钙指示剂（如GCaMP）或荧光蛋白（如GFP），可识别并表征由启动子表达所定义的细胞类型。这些方法依赖双光子显微镜，不仅需要昂贵的设备，而且由于脑组织对光的散射特性，仅限于浅层皮层的成像。
最近，Lima 及其同事1开发了一种光遗传学的新应用，用于在活体（in vivo）条件下对基因定义的神经元类型进行靶向电生理记录，该方法称为“PINP”（神经元群体的光刺激辅助鉴定，Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations）。该记录在特定神经元亚群表达通道视紫红质-2（Channelrhodopsin-2, ChR2）的小鼠中进行。通过给予短暂的蓝光闪光，根据神经元的反应来识别该群体中的成员。与许多其他光遗传学应用不同，该方法的目的不是调控神经环路功能，而是简单地鉴定属于某一基因定义类别的神经元，从而可在正常脑功能过程中对其进行特征描述。该技术可使用标准的细胞外记录设备实现，因此可作为钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种易于获取且成本较低的替代方案。本文中，我们描述了在麻醉状态下的听觉皮层中对特定细胞类型进行PINP的方法，并期望其中的通用原则可有效地应用于其他实验制备和脑区。
在大脑皮层中，PINP 技术在研究抑制性中间神经元的 体内 反应特性方面具有特殊前景。GABA 能中间神经元是皮层神经元中数量较少且具有异质性的一个亚群4。近年来研究发现，表达不同分子标记物的各类亚型在皮层环路中执行不同的计算功能5-9。随着遗传学工具的进步，未来或许能够进一步区分属于这些大类之内的、在形态学和生理学上均可区分的不同神经元类型。本文分享了我们在麻醉小鼠皮层中对已鉴定的抑制性中间神经元获取稳定且分离良好的单细胞单位记录的策略。该策略最初专为靶向定位表达小清蛋白的（PV+）细胞而设计，但我们发现它同样适用于其他类型的中间神经元，例如表达生长抑素的（SOM+）和表达钙结合蛋白 calretinin 的（CR+）中间神经元。尽管 PINP 技术在概念上较为直接，但在实际操作中却可能出人意料地难以掌握。我们通过反复试验积累了许多实用技巧，可供尝试该方法的其他研究者参考。

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP 品系</td><td>Jackson 实验室菌种</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Pvalb-iCre (PV) 品系</td><td>Jackson 实验室菌种</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Sst-iCre (SOM) 品系</td><td>Jackson 实验室菌种</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Cr-iCre (CR) 品系</td><td>Jackson 实验室菌种</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>III-A 型，高电渗扩散（High EEO）</td></tr><tr><td>微点针（硬脑膜钩）</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>FST</td><td>10003-12（刀柄），10011-00（刀片）</td><td></td></tr><tr><td>普拉露比眼科软膏</td><td>Foster &amp; Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>恒温毯</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!C11">507220F&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>钨微电极</td><td>A-M Systems</td><td>577200</td><td>12 M&amp;Omega; 交流电阻，127 &amp;mu;m 直径，12&amp;deg; 锥形尖端，环氧树脂涂层</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>热缩管</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zapit 加速剂</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>需与标准瞬干胶配合使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微电极交流放大器 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 电动显微操作器</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>四通道数字示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>有源扬声器</td><td>Harman</td><td>型号 JBL&amp;nbsp;Duet</td><td></td></tr><tr><td>手动操作器</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &amp;micro;m 光纤补丁电缆</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>功率计</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D（功率计），S121C（标准功率传感器）</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED 的功率和效率持续提升，建议查询最新产品（www.cree.com）。</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

神经生理学的一个主要挑战是表征大脑皮层中大量抑制性细胞类型的反应特性和功能。 我们在此分享一种策略，该策略采用Lima及其同事开发的方法，用于在麻醉小鼠皮层中对已鉴定的抑制性中间神经元进行稳定且分离良好的单细胞单位记录1在表达通道视紫红质-2（Channelrhodopsin-2, ChR2）的特定神经元亚群的小鼠中进行记录。通过观察细胞对短暂蓝光闪光的反应来识别该神经元群体中的成员。该技术被称为“PINP”（Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations，光刺激辅助的神经元群体识别），可使用标准的细胞外记录设备实现。该方法可作为钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济且易于实施的替代方案，用于将细胞外记录靶向至基因型明确的细胞。本文提供了一套优化该方法在日常实践中应用的指导原则。我们特别针对小清蛋白阳性（parvalbumin-positive, PV+）细胞优化了该策略，但发现该方法同样适用于其他类型的中间神经元，如表达生长抑素（somatostatin-expressing, SOM+）和表达钙视网膜蛋白（calretinin-expressing, CR+）的中间神经元。

本文介绍了我们采用Lima 等1开发的光遗传学方法，在麻醉小鼠皮层中对基因型分类的抑制性中间神经元进行单细胞记录的策略。表1列出了推荐的麻醉剂混合配方——氯胺酮-美托咪啶-乙酰丙嗪（“KMA”）。图1展示了一根用于记录的钨微电极的制备状态。图2提供了一个简易LED控制单元的电路图。图3展示了使用Arduino微控制器控制光输出的配置与代码。图4显示了实验方案中讨论的光诱导电学伪迹示例。此类伪迹偶尔会出现（左图），但易于校正（右图）。图5展示了三种光学鉴定的中间神经元（PV+、CR+ 和 SOM+）的记录示例。左图显示了原始电压迹线及对齐的波形，代表了采用该策略可望获得的信噪比水平。通过设定数百微伏的固定电压阈值，可稳定捕获动作电位。点阵图（右图）显示了光诱发反应的短潜伏期和高可靠性，从而可明确鉴定ChR2阳性中间神经元。图6展示了三个PV+中间神经元在1秒光脉冲刺...

本文介绍了我们在麻醉小鼠皮层中从已鉴定的抑制性中间神经元获取稳定且分离良好的单细胞单位记录的策略。表达ChR2的神经元通过其对蓝光的反应来识别。该方法使用标准的细胞外记录设备，是钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济替代方案。

神经生理学中的一个主要挑战是表征大脑皮层中大量抑制性细胞类型的反应特性及其功能……

以下实验的总体目标是从表达通道视紫红质2的小鼠皮层中间神经元中获得高质量的细胞外单细胞记录。通过将高阻抗记录电极推进至组织中，利用中间神经元对蓝光脉冲产生的放电反应来识别目标细胞。监测电信号的变化，以判断推进速度是否合适，并评估获得稳定且分离良好的记录的可能性。如果无法获得良好的单细胞分离效果，或者相反地，很少记录到光响应性神经元，则应更换记录电极。实验结果表明，通过光遗传学方法识别的神经元能够稳定产生光诱发的反应，并展示了采用该策略所获得的典型信噪比。光刺激方法是一种简便且经济的手段，可利用标准的细胞外放大器和蓝光靶向特定的基因型细胞类型。这是我们在麻醉状态下的听觉皮层中特异性标记特定中间神经元的策略，但其中更普遍的要点也适用于其他皮层区域中的稀疏细胞类型。开始该操作时，先通过腹腔注射氯胺酮-甲苯噻嗪混合物对动物进行麻醉，然后将其置于立体定位仪或其他头部固定装置中，并确保颅骨被牢固固定。这对于维持稳定的单细胞记录至关重要。接下来，将眼药膏涂抹于眼睛以防止干燥，并将动物体温维持在37摄氏度。为获得更稳定的记录效果，进行枕骨大孔胸骨引流：用手术刀片去除后颅骨组织，暴露枕骨大孔。然后用刀尖在软脑膜上做一个小切口，以引流脑脊液。现在使用手术刀，在目标皮层区域上方进行一个小的开颅手术。随后，去除硬脑膜，然后用一层温热的琼脂覆盖暴露的皮层。用生理盐水保持琼脂湿润。准备一个舌状支架电极。用瞬间胶和加速剂将电极粘附到玻璃毛细管上，然后添加热缩管以增加握持力。随后，将电极安装在电动或液压显微操作器上，并将其设置为垂直于皮层表面移动。将接地线插入皮肤下方并紧贴颅骨。避免与头部侧面和颈部后方的肌肉接触，因为这些肌肉可能产生肌电图伪迹。使用适合单细胞记录的细胞外放大器放大电信号，最好选用带有阻抗检测模式的放大器。通过两台示波器和一组有源扬声器监测持续的放电活动。现在将电极穿过硬脑膜，并检测其阻抗，确保其在7至14兆欧姆之间。当电极尖端穿透皮层表面时，在显微操作器上将此位置归零。为了最准确地估计记录深度，需通过视觉确认电极尖端在深度为零处穿出皮层表面。在听觉皮层穿刺结束并回撤电极时，为确保该零点设定值对应于皮层水平，应监测刺激诱发的场电位。在将电极推进穿过组织最表层的数百微米过程中，需确认局部场电位的极性在约100微米深度处发生反转。接下来，将连接至蓝光光源的光纤安装到手动显微操作器上。使用能够输出特定宽度和持续时间TTL脉冲序列的控制单元调节光源输出。然后在两台示波器上同时监测信号。使用功率计测量光纤末端的总光功率。将该值除以光纤纤芯的横截面积，以计算辐照度。起始值应在每平方毫米10至15毫瓦的范围内。使用显微镜将光纤尖端尽可能靠近嗅球表面。将光束中心对准电极进入组织的位置。现在检查电极在嗅球中时是否存在光伪影。施加一个脉冲应变。通过重新调整光纤相对于电极的位置，改变入射光的角度，以消除任何瞬态光伪影。如果伪影仍然存在，尝试降低光源功率。接下来，以大约每秒一微米的速度缓慢将电极推进穿过脑组织。使用一台示波器监测电极的持续活动，另一台用于触发激光脉冲。在音频监视器上聆听光刺激引发的微弱放电声，这表明电极正在接近表达通道视蛋白的细胞。一旦光刺激引发放电，即应减缓推进速度。动作电位足够大，可在示波器上被单独触发显示。开始操作。调节横轴上的刻度以观察峰电位波形的精确形状。此时，停止推进电极，并等待其在组织中稳定。这对于获得稳定的记录至关重要。数分钟后，如果信噪比仍未改善，则再向前推进五微米并等待。重复此过程，直至能够以电压阈值可靠地捕获动作电位的峰值或谷值。记录时将信号设置在远高于噪声基线的水平。在第一台示波器上监测持续的电活动，同时使用第二台示波器观察尖峰放电的大小和形状，并注意其在扬声器中发出声音的质量。仔细聆听信号中的突然变化，这表明细胞正在靠近或远离电极。若尖峰信号变大且发生畸变，应撤回电极；若信号变小，则推进电极。以两微米为步长缓慢移动，以确认尖峰信号的质量。在较宽范围的阈值条件下叠加所有尖峰波形。应仅观察到一种高度一致的稳定尖峰形状。大多数PV阳性细胞能够持续放电达整整一秒。如果信号受到邻近神经元放电的污染，应推进电极，在每次穿刺中寻找新的细胞，并将电极穿过皮层的全部深度。如果经过多次穿刺仍未记录到光反应性神经元，或者相反，记录中持续受到邻近通道、视蛋白阴性细胞放电的污染，则应更换新的电极。该图展示了三种经光学鉴定的中间神经元的示例记录。这些细胞对搜索脉冲序列产生可靠的簇状放电反应。图中显示了100次扫描的叠加峰电位以及平均插值后的波形。这些群集图显示了光诱发峰电位的稳定时序。此处展示了部分功率伏特正性中间神经元的首次峰电位潜伏期。光刺激方法在概念上非常简单，但实际上可能具有出人意料的挑战性，且成功率较低。在实际操作中，玻璃膜片电极明显倾向于记录参数神经元，因此很少能获取到内侧神经元。另一方面，使用多通道电极记录时，能够获得大量对光有反应的中间神经元，但其动作电位幅度较小，且存在大量重叠的波形，因此很难可靠地将其分离为单个神经元单位。我们尝试了多种方法来解决这一问题，对于中间神经元，我们发现这种尖端直径为10至14兆微米的电极在监听半径方面达到了最佳平衡：该半径必须足够大，以便远距离检测到光激活的动作电位，但又必须足够小，以实现良好的单神经元信号隔离。不过这其中仍有一些经验性因素。如果无法实现这一点，放弃该电极并继续尝试下一个，直到找到可用的电极，这样可以节省大量时间。

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