生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

本实验的总体目标是在生理流动条件下，观察内源性连接蛋白、Terin 和 PCAM-1 在白细胞跨内皮迁移过程中的分布情况。该目标通过以下步骤实现：首先，利用Percoll梯度法从健康志愿者的全血中分离多形核白细胞（PMNs）；第二步，在启动流动实验前30分钟，将荧光标记的抗体加入经TNF-α刺激的人脐静脉内皮细胞单层，该细胞单层培养于流动小室中。

这将能够实现在生理流动条件下观察中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞连接处的动态变化。接下来，将含有经荧光标记的TNF alpha刺激的人脐静脉内皮细胞的流动小室连接至流动系统，并放置于显微镜载物台上。泵将从储液器中通过流动室抽取缓冲液进入注射器。

最后一步是通过注射口将中性粒细胞（PMNs）缓慢注入流动系统。最终，使用共聚焦激光扫描显微镜观察中性粒细胞。数分钟后，白细胞出现、黏附并发生跨内皮迁移。

该实验可在任意期望的时刻停止。与静态迁移实验等现有方法相比，该技术的主要优势在于，可在生理流动条件下实时研究细胞黏附和跨内皮迁移过程。这将有助于我们理解白细胞为何选择某种迁移路径而非另一种，即穿越细胞间（PGA）与穿越细胞本身（跨细胞迁移）之间的选择机制。

我们通过使用荧光标记的抗体对细胞间连接进行可视化来实现这一点。本实验所用的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）根据制造商的说明，在纤连蛋白包被的培养皿中，使用添加了内皮细胞生长因子的培养基进行培养。细胞培养使用第4至第8代之间的细胞，当细胞融合度达到80%至90%时，用pH 7.4的室温PBS小心洗涤，然后用胰蛋白酶消化细胞，再进行离心处理。

用培养基将细胞重悬至每毫升800,000个细胞。实验所用流室已在前一天包被纤维连接蛋白。将80,000个细胞加入每条纤维连接蛋白包被的流室通道中，轻轻吹打混匀，然后在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养过夜，次日进行后续实验。

通过将流动腔室载玻片轻轻倾斜至45度角来更换培养基。建议仅移除储液池中的培养基，而不要移除通道内的培养基。由于移液时培养基产生的拖拽力，移除通道内的培养基可能导致内皮细胞脱落和死亡。

通过相差显微镜检查内皮细胞是否已形成单层。如果细胞未达到100%汇合度，则每天更换两次培养基，直至细胞达到100%汇合。一旦细胞达到100%汇合，即用含有炎症介质的培养基刺激细胞。

用TNFα刺激uix过夜，可导致内皮细胞呈现炎症表型，即细胞黏附分子（如ICAM-1和VAM-1）上调。在分离多形核白细胞（PMNs）之前，准备用于洗涤分离所得PMNs以及流式实验的缓冲液：取100毫升预先配制的储备溶液，加入100微升新鲜的1摩尔氯化钙、2.5毫升人血清白蛋白（来自200克/升储备浓度）以及0.1克葡萄糖。

使用0.45微米滤器过滤流动缓冲液。在分离中性粒细胞（PMNs）之前，还需制备pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中含10%枸橼酸三钠（trisodium citrate）或TNC溶液。中性粒细胞将从健康志愿者采集的20毫升全血中分离，全血使用含钠肝素的离心管（ette）收集。

首先，在15毫升离心管中将全血与10% PBST NNC按1:1比例稀释。接着，将移液器调至最慢流速，小心地将20毫升稀释后的血液缓慢加入新的50毫升离心管中，该管内已含有12.5毫升密度为1.130克/毫升的Perco胶体水溶液。在加入血液时，含Perco胶体的离心管应倾斜呈45度角。

将试管小心放入离心机，在室温下以800 G离心20分钟，加速度设为低速，离心结束后关闭刹车。吸除所有上清液，每管加入预冷的红细胞裂解缓冲液以裂解红细胞。将试管置于冰上，期间偶尔轻轻颠倒混匀，直至悬液变为深红色，然后在4°C下以500 G离心5分钟，开启刹车。

所得沉淀部分含有中性粒细胞（PMNs），与红细胞一同存在。弃去上清液，将沉淀在冰上用裂解缓冲液洗涤两次，每次500 × g 离心五分钟，温度为4°C。第二次洗涤后弃去上清液，用室温的流式缓冲液重悬沉淀，并使用自动细胞计数仪测定PMNs的浓度。

最后，将中性粒细胞重悬于流动缓冲液中，浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞，并在室温下保存，用于标记内皮细胞连接处的VE-钙黏蛋白和PCAM-1。向流动腔室中的VE培养基加入PCAM-1抗体LOR 6 47，稀释比例为1:100，同时加入钙离子非依赖性FE-钙黏蛋白抗体ZI，稀释比例为1:50，于37°C孵育30分钟。为准备中性粒细胞用于检测，在将其注入流动系统前，先将其置于37°C水浴中孵育15分钟。

将管路连接至一个空的流动室，并用温热的流动缓冲液填充，以防止气泡形成。在设置流动系统时，使用硅胶管将空流动室的一侧连接到含有20毫升注射器的注射泵流动系统。

将流室放置在显微镜载物台上。实验将使用配备63倍油镜物镜、并带有设置为37摄氏度和5%二氧化碳的控温控气培养室的共聚焦激光扫描显微镜进行。将空流室的另一端连接至装有37摄氏度流动缓冲液的储液瓶，并启动注射泵，以使流动缓冲液充满所有管路；泵将驱动缓冲液从储液瓶经流室流入注射器。

该管路还带有一个在线诱饵注射口，允许使用针头将中性粒细胞（PMNs）注入正在进行的实验中，而无需停止流动或产生气泡。接下来，将空的流动室更换为含有经TNF-α处理的血管内皮细胞（VE）的流动室；在断开和重新连接管路至含有VE的流动室之前，请先夹住并夹紧管路。为避免系统中产生气泡，夹闭并夹紧管路至关重要。在连接载有细胞的载玻片时，

将流室置于显微镜载物台上，根据毛细血管后微静脉中的生理流速（1至5达因/平方厘米），调节流速至1达因/平方厘米，记录微分干涉差显微镜（DIC）在647 nm下的图像。同时，使用1毫升注射器通过串联进样口缓慢将中性粒细胞（PMN）注入流动系统。数分钟后，白细胞出现、黏附并发生跨内皮迁移；可在任意所需时间点终止实验。

通过断开流室的管路连接，并用移液器将固定剂加入流室，测定内皮单层细胞的电阻，以检测抗体是否干扰内皮屏障功能。当加入 VE 钙粘蛋白抗体克隆 55 7 H 1 或同型对照抗体时，未观察到电阻发生变化。相反，VE 钙粘蛋白阻断抗体 CL 75 显著降低了电阻。

RAP分析显示，在存在或不存在VE钙黏蛋白55 7H一抗体的情况下，荧光恢复均无变化，表明该抗体并未改变VE钙黏蛋白在中性粒细胞跨内皮迁移（TEM）过程中的动态行为。实时分析了VE钙黏蛋白和血小板内皮细胞黏附分子-1（PCAM-1）的分布情况。上图显示一个以白色轮廓标记的中性粒细胞黏附于内皮细胞表面，并穿过细胞-细胞连接处，而未破坏VE钙黏蛋白和PCAM-1的分布。在穿胞过程中，当一个中性粒细胞以白色轮廓标记并位于内皮细胞上方时，可观察到VE钙黏蛋白和PCAM-1在局部发生弥散。

黄色轮廓显示了已位于内皮下层的中性粒细胞膜。在跨内皮迁移完成后，细胞连接闭合，血管内皮钙黏蛋白（ve-cadherin）和血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）重新定位至迁移位点。跨内皮迁移的中性粒细胞边界以黄色标出。

通过该实验流程，可进一步开展白细胞跨内皮迁移实验，以回答其他问题，例如白细胞是否通过胞间途径或跨细胞途径穿越内皮层。