荧光成像与一纳米精度（FIONA）
September 26th, 2014
单荧光团可与纳米精度利用FIONA本地化。这里的FIONA技术的总结报告，以及如何进行FIONA实验进行说明。
该程序的总体目标是演示如何以一纳米精度进行荧光成像或 Fiona 实验。这是通过首先设置所需的设备并对齐全内反射、荧光、显微镜或草皮的光学元件来实现的。下一步是将 CY 3D NA 固定在样品室的内表面，并以纳米精度定位 CY 3D NA 单分子。
随后，Fiona 被应用于研究单个截短的肌球蛋白 5 的运动，一个用量子点标记的马达。最终，肌球蛋白在行走时的步长，通过 Fiona 分析测量为 36 纳米。虽然这种方法可以提供对分子马达的见解，但它也可以应用于其他系统，例如跟踪细胞膜上的受体。
这种方法的视觉演示至关重要，因为实验细节很难学习。在设置过程中始终佩戴激光护目镜非常重要。用于全内反射、荧光、显微镜或草皮。
首先，将所有光学元件的高度设置为显微镜中心的高度，向后端口安装激光器、激光快门和 ND 滤光片。使用 ND 滤光片将激光功率尽可能低地衰减，同时保持光束可见。使用适当的六角扳手拧紧螺钉。
规划光束路径，如蓝色虚线所示。在此示意图中，在光学平台上用胶带或记号笔标记光束路径。将镜子 M1 放置在第一个直角转弯处，沿规划光束路径的第二个直线部分放置两个光圈。
调整 M1 的位置和倾斜度，使激光穿过虹膜放置镜 M 2。在第二个直角转弯处，将 10 x 扩束器沿路径的第三个直线段放置。调整其倾斜度，使扩束镜平行于光学平台和规划的光束路径。
下一步是迭代调整 M1 和 M 2，使激光直接穿过两个透镜的中心，即扩束镜的 L 1 和 L 2。用一张白纸挡住扩束器后的光束，用肉眼检查光束轮廓。调整直到扩展梁的梁轮廓为非 ED。
高斯调整 L 1 和 L 2 之间的距离，使光束成为 Sorted Shutter。激光器拧下显微镜物镜并拧入荧光对准。目标放置镜子 M 3 和 M 4，以将扩展光束引导到显微镜端口和二向色镜上。
炮塔内部。调整 M 3 使光束最亮的部分在荧光靶上居中，调整 M 4 使光束垂直倾斜，关闭激光并将物镜拧回原处。好。调整 M 3 和 M 4 的倾斜度，以优化物镜外的激光功率和光束轮廓。
将 E-M-C-C-D 相机安装到显微镜上，并将相机连接到计算机。启动相机的软件。将荧光样品安装在显微镜上。
看看相机上明亮的荧光点。检查该点是否在焦点更改时在屏幕上没有移动。将 TIR 镜头放在 XY、Z 平移台上，距离物镜的后焦平面一定距离，该距离等于焦距，即 L 三，约为 30 厘米。
调整 L 3 的位置，使激光穿过镜头中心。沿光束路径平移 L 3 以调整光束排序。确保光束仍位于显示器的中心且形状对称。
垂直于光束路径平移 L 三次，以将光束倾斜出物镜。继续平移 TIR 镜头，以便在执行 Fiona 之前达到 TIR。定位和移动 CY 3D NA 的实验。单分子构建样品室，如方案文本中所述。
沿长边将两条双面胶带贴在载玻片上，在中心留出 3 到 5 毫米的间隙，然后将清洁的盖玻片放在载玻片的顶部，从右侧和正面显示了腔室的侧视图。样品室的开口端保持开放状态，用作入口和出口，将 SI 3D NA 固定在样品室的内表面。将 10 微升 BSA 生物素移液到腔室中。
等待 5 分钟。将 40 微升 T 50 BSA 移液到样品室中，清洗样品室。然后将 10 微升 neut travain 移液到腔室中并孵育 5 分钟。
用 40 μL T 50 BSA 移液管、20 μL SI 3D NA 进入样品室再次清洗腔室，并孵育 5 分钟。最后，用 80 微升 T 50 BSA 清洗腔室。要在草皮 M 下开始对 SI 3D NA 单分子进行成像，请将 30 微升成像缓冲液移液到样品室中，等待 8 到 10 分钟。
将样品安装在配备有绿色激光器、100 X 油浸物镜和 E-M-C-C-D 相机的草皮显微镜上进行成像。设置曝光时间和 EM 增益。获取 1000 帧样本的影片。
编译并运行 Fiona Pro 以进行 Fiona 分析。使用此 IDL 程序导入采集的图像，以输入有效像素大小和从强度到光子数的转换因子，并选择用于 Fiona 分析的光斑。最后，程序将输出带有 2D Gaussian 函数的拟合结果以及总光子数和定位精度编译并运行 pH 计数 pro。
要表征光子计数，请使用此 DL 程序来测量植物群发射的平均光子数。照片漂白前四导入采集的图像并输入从强度到光子数的转换因子。该程序将检测荧光点，自动计算光子计数作为帧号的函数，并输出光子计数的轨迹。
通过在 DD H 2 O 中以每毫升 1 毫克的浓度将 20 微升生物素化 BSA 移液到样品室中来制备用于本实验的样品。孵育 10 分钟。用 30 μL D ddh 冲洗，用两支 O 移液管蘸 0.5 毫克/毫升的 neut travain 冲洗，孵育 2 分钟。
用 30 微升 M five PSA 清洗腔室。该实验的作用必须在前一天准备好，如方案文本中所述。通常将制备的 f 肌动蛋白稀释 25 倍，肌动蛋白缓冲液至终浓度约为 0.004 毫克/毫升。
将肌动蛋白溶液移液到腔室中并等待 10 分钟。用 30 微升缓冲液冲洗腔室，将带标志标签的肌球蛋白 5 A 稀释 30。将 M Five 缓冲液折叠至终浓度为 250 纳摩尔。
将 1 微升稀释的肌球蛋白与 1 微升 Anti-Flag Q.Do 7 0 5 混合。加入 8 微升 M 5 以填充至 10 微升，然后上下移液以混合。在冰上孵育 10 分钟。
将 20 微升含有肌球蛋白 Q 点的成像缓冲液移液到样品室中。孵育 8 到 10 分钟。在草坪显微镜上以 30 毫秒的曝光对样品进行成像。
至少采集 1000 帧以开始数据分析。打开图像 J 中的视频文件，然后围绕移动点裁剪视频。通过将 Fiona 分析应用于视频的每一帧，跟踪视频中的点，以生成随时间变化的 X 和 Y 坐标（以像素为单位）。
按照协议文本中的说明将像素转换为纳米。计算从初始位置的位移作为时间的函数。对位移运行 T 检验以获得肌球蛋白行走的步骤。
从 step size （步长） 列中删除所有零值。使用 origin 或 matlab 绘制步长的分布。将高斯量拟合到直方图。
在这个典型的表面固定 SI 3D NA 图像中。黄色箭头指向单个 SI 3D NA 分子，其点扩散函数或 PSF 如图所示。PSF 拟合有二维高斯函数，并且还显示了拟合残差。该图是光子数与帧数的典型轨迹，指数拟合给出的平均光子数约为 1.4 乘以 10 到 6，以测量具有单个肌球蛋白良好信噪比的视频文件的肌球蛋白步长。
当它行走时，肌动蛋白丝被捕获。显示了三个示例帧。将 Fiona 应用于每个帧会产生以红色绘制的距离与时间轨迹。
基于 T 检验的步长查找算法用于提取各个步骤，输出以白色叠加步长，纳米以白色标记。当来自多条迹线的步长组合成直方图时，测得的步长呈高斯分布，约为 35.8 正负 0.4 纳米。看完这个视频，你应该对如何进行 Fiona 实验有一个很好的了解，包括设置草坪显微镜 为了获得最佳结果，通过这些程序，最大限度地减少对地板力使用和实验的光损伤是很重要的。
不要忘记，使用草坪显微镜和 Fiona 可能非常危险，因此在执行此程序时应佩戴护目镜等预防措施。
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概述
本文讨论了FIONA技术，该技术能够以纳米级精度定位单个荧光分子。它详细介绍了进行FIONA实验所需的步骤，包括设备设置和分子固定。
关键研究组成部分
科学领域
- 荧光成像
- 分子电机
- 单分子定位
背景
- FIONA代表Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy（具有纳米级精度的荧光成像）。
- 该技术用于研究单个分子的动力学。
- 它可以提供对各种生物过程的洞察。
- 应用包括跟踪分子电机和细胞膜受体。
研究目的
- 展示FIONA技术用于单分子定位。
- 以高精度测量分子电机的运动。
- 探索FIONA在生物学研究中的潜在应用。
使用的方法
- 设置全内反射荧光显微镜设备。
- 在样品腔表面固定CY 3D NA。
- 定位单个CY 3D NA分子。
- 应用FIONA研究单个截短肌球蛋白电机的运动。
主要结果
- 肌球蛋白的步长被测量为36纳米。
- FIONA提供了肌球蛋白在肌动蛋白上行走机制的洞察。
- 该技术可用于研究其他分子相互作用。
- FIONA增强了我们对分子电机和细胞过程的理解。
结论
- FIONA是单分子研究的强大工具。
- 它可以揭示分子电机的详细动力学。
- 该方法在细胞生物学中有广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
FIONA enables nanometer-scale localization of single fluorophores, providing quantitative spatial data critical for de-risking mechanistic hypotheses in target validation. By measuring molecular motor step sizes and receptor dynamics with precision, it supports predictive confidence in early discovery decisions. This capability aids in prioritizing targets with validated mechanistic continuity from discovery through preclinical stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving single-molecule movements and interactions at nanometer scale.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of motor protein mechanics and receptor trafficking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative, reproducible data on target behavior under near-physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated single-molecule detection systems for downstream compound screening campaigns.
- Operational Value: Delivers standardized, high-precision localization outputs essential for assay reproducibility and cross-laboratory comparability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse biological systems, including membrane receptors and cytoskeletal motors, after initial validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains methodological consistency from single-molecule discovery to preclinical functional validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies force-generation mechanisms and stepping kinetics, reducing ambiguity in target mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by correlating nanoscale motor behavior with functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
FIONA integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven single-molecule analysis that informs lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of targets through precise localization and step-size analysis of motor proteins and receptors.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative spatial readouts that allow reliable comparison of compound effects on single-molecule behavior.
- Analytics: Generates nanometer-resolution localization precision and step-size distributions, enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects single-molecule mechanism to cellular function through continuity in measurement approach across scales.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, adaptable capability for multiple projects after initial optical and analytical setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by providing direct, nanometer-scale observations of molecular dynamics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols for sample preparation, imaging, and FIONA-based analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets with high mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative benchmarks for target progression decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, TIRF microscopy, and single-molecule fluorescence detection.
- Depends on stabilized laser sources, high-sensitivity EM-CCD cameras, and precision translation stages for beam path control.
- Necessitates cross-team standardization of sample chamber preparation, molecule immobilization, and imaging buffer conditions.
- Involves adaptation considerations when extending to thick samples or diverse fluorophores such as quantum dots versus organic dyes.
- Limited by photon budget and photobleaching constraints, which affect localization precision and trajectory length in live-cell applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
TIRM Setup
4:40
FIONA on Cy3-DNA
6:28
Data Analysis for FIONA on Cy3-DNA
7:29
Application of FIONA to Quantify Motor Dynamics at Nanometer Scale
9:10
Data Analysis and Finding the Step-size of Myosin Walking
9:59
Results: Single Fluorophores Are Localized with Nanometer Precision Using FIONA
11:17
Conclusion
