Name: 荧光成像与一纳米精度（FIONA） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学习使用FIONA技术进行单分子定位，以纳米级精度追踪分子马达运动。本方法通过全内反射荧光显微镜测量肌球蛋白步长，揭示细胞生物学中分子机制的动态过程。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金068625、美国国家科学基金会（NSF）基金1063188以及生命细胞物理学中心基金0822613的支持。特别感谢贝克曼先进科学与技术研究所的 Marina Marjanovic 博士惠赠兔眼。

伦理声明：兔角膜组织的采集遵循伊利诺伊大学动物护理和使用机构指南。
1. TIRFM 装置设置
注意：始终佩戴激光安全护目镜。
<ol>
	<li>确保材料清单中所列的所有必要光学元件均已备齐并准备进行准直。如有需要，可使用其他公司功能相当的替代品。确保反射镜和透镜具有与所用激光器匹配的抗反射（AR）涂层。</li>
	<li>将所有光学元件的高度调节至显微镜后端口中心的高度。</li>
	<li>安装激光器、激光快门和中性密度（ND）滤光片。使用ND滤光片将激光功率尽可能降低，同时保持光束可见。使用合适的六角扳手拧紧螺丝。</li>
	<li>规划光路路径，并在光学平台上用胶带或标记笔标出（图1中的蓝色虚线）。为简化操作，沿光学平台上的孔阵直线布置光路。</li>
	<li>将反射镜M1（图1）放置在第一个直角转折处。在计划光路的第二段直线部分放置两个光阑。调整M1的位置和倾斜角度，使激光穿过两个光阑。</li>
	<li>将反射镜M2（图1）放置在第二个直角转折处。在光路的第三段直线部分放置10倍扩束镜（L1和L2，图1）。调整其倾斜角度，使扩束镜与光学平台和计划光路均保持平行。
	<ol>
		<li>反复调整M1和M2，使激光笔直穿过扩束镜两片透镜的中心。重复此步骤，直至扩束后光束的轮廓呈现无截断的高斯分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反复调整M1以使光束在L1（图1）上居中，调整M2以使光束在L2（图1）上居中。若光束轮廓不佳，通常意味着激光被截断；可在扩束镜后用一张白纸遮挡光束，肉眼观察光束轮廓。如需高精度分析，应使用光学光束轮廓仪。</li>
	<li>调节L1与L2之间的距离，使光束达到准直状态。如有必要，重复步骤1.8和1.9。 
	注：当光束尺寸不随传播距离变化时，其准直程度已足以满足TIRFM系统的需要。如需进一步提高准直精度，可使用剪切干涉仪等工具。典型的扩束后光束直径约为20 mm。</li>
	<li>关闭激光快门。卸下显微镜物镜，安装荧光对准靶标。放置反射镜M3和M4（图1），将扩束后的光束导入显微镜端口并照射至物镜转盘内的二向色镜上。确保激光束经二向色镜反射后朝向天花板方向。</li>
	<li>调整M3，使光束最亮部分位于荧光靶标中心；调整M4，使光束倾斜角度垂直。</li>
	<li>关闭激光快门，重新安装物镜。若上一步的对准操作准确，则应有对称的光斑从物镜射出。微调M3和M4的倾斜角度，以优化物镜出射的激光功率和光束轮廓。</li>
	<li>将EMCCD相机安装到显微镜上，并连接至计算机。启动相机配套软件。</li>
	<li>在显微镜上安装荧光样品（荧光分子溶液）。通过相机观察明亮的荧光光斑。检查在改变焦距时，屏幕上的光斑位置是否保持稳定不移动。</li>
	<li>将TIR透镜（L3，图1）放置在XYZ平移台上，使其与物镜后焦平面的距离等于L3的焦距（约30 cm）。调整L3的位置，使激光穿过透镜中心。</li>
	<li>沿光路方向平移L3以调节光束准直度。确保监视器上的光斑仍保持居中且形状对称。 
	注：样品平面上的照明区域随TIR透镜焦距减小而增大。一般情况下，应选用能适配装置的最小焦距透镜。</li>
	<li>沿垂直于光路的方向平移L3，使光束倾斜出射物镜。持续移动TIR透镜直至实现全内反射（TIR）。通过EMCCD相机观察荧光微球样品，并微调L3以获得良好的信噪比（SNR）。</li>
</ol>
<img alt="用于通过物镜将激光束扩束并聚焦到样品上的光学装置示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 全内反射荧光显微镜（TIRFM）的光学配置。
2. Cy3-DNA 上的 FIONA
<ol>
	<li>清洁显微镜载玻片和盖玻片：用 ddH2O 和异丙醇冲洗显微镜载玻片和盖玻片，并用氮气吹干；将载玻片和盖玻片置于氩等离子体中，在等离子清洗仪中处理 5 分钟。</li>
	<li>构建样品腔室（如图 2所示）。
	<ol>
		<li>在实验台上铺一张纸巾，再将一张镜头纸放在纸巾上。将载玻片置于镜头纸上，确保载玻片的洁净面朝上。</li>
		<li>沿载玻片长边方向贴上两条双面胶，中间留出 3–5 mm 的间隙。将已清洁的盖玻片放置在载玻片上方，确保盖玻片的洁净面朝向载玻片。</li>
		<li>使用移液器吸头按压双面胶以确保粘合牢固。用刀片去除载玻片上多余的胶带，使胶带仅保留在盖玻片下方。 
		注意：腔室的两端保持开放，作为进样口和出样口。腔室体积为几微升。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显微镜载玻片制备示意图；盖玻片、载玻片、胶带在显微镜中的排列方式。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 典型样品腔的示意图。 （a）俯视图；（b）右侧侧视图；（c）前侧侧视图。
<ol start="3">
	<li>将Cy3标记的DNA固定在样品室的内表面。
	<ol>
		<li>配制T-50缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl）。用T-50缓冲液配制BSA-biotin，终浓度为1 mg/ml。通过将BSA溶解于T-50缓冲液中，配制T50-BSA缓冲液，终浓度为10 mg/ml。</li>
		<li>在 T50-BSA 缓冲液中配制 0.5 mg/ml 链霉亲和素。在 T50-BSA 缓冲液中配制生物素标记的 Cy3 荧光染料标记 DNA（Cy3-DNA），终浓度为 5–10 pM。</li>
		<li>移液器 10 µl 将 BSA-biotin（1 mg/ml）加入样品室，静置 5 分钟。</li>
		<li>用洗涤液清洗腔室 40 µl T50-BSA。移液器 10 µl 将链霉亲和素（0.5 mg/ml）加入样品室，孵育5分钟。</li>
		<li>用缓冲液清洗腔室 40 µl T50-BSA。移液 20 µl 将Cy3-DNA加入样品室，孵育5分钟，然后用 80 µl T50-BSA</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在TIRFM下观察Cy3标记的DNA单分子图像。
	<ol>
		<li>配制成像缓冲液（100 µl) 通过混合 1 µl 原儿茶酸-3,4-双加氧酶（PCD， 5 µM), 4 µl 原儿茶酸（PCA，62.5 mM） 50 µl 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox，T-50 中 2 mM），以及 45 µl T50-BSA</li>
		<li>移液加入 30 µl 成像缓冲液中孵育，静置 8–10 分钟。</li>
		<li>将样品安装在配备绿色激光器（532 nm）、100倍油浸物镜（1.45 数值孔径）和EMCCD相机的全内反射荧光显微镜上进行成像。</li>
		<li>将曝光时间设置为100至500毫秒，EM增益设置为25至100。采集样本共1,000帧的图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对Cy3-DNA的记录图像进行FIONA数据分析。
	<ol>
		<li>确定有效像素大小（即，通过将EMCCD相机规格表中读取的物理像素尺寸除以总放大倍数（物镜放大倍数乘以任何附加放大倍数），计算出从像素到纳米的转换因子。</li>
		<li>通过将CCD灵敏度（单位：电子数/光子）除以增益（单位：电子数/ADU），计算像素强度到光子数的转换系数即，电子数每A/D计数，从CCD相机的技术规格表中读取）除以图像采集过程中使用的电子倍增（EM）增益。</li>
		<li>编译并运行 FIONA.pro 以进行 FIONA 分析。使用该 IDL 程序导入采集的图像，输入有效像素尺寸（来自步骤 2.5.1）以及光强到光子数的转换系数（来自步骤 2.5.2），并选择用于 FIONA 分析的荧光点。 
		注意：程序最后将输出二维高斯函数的拟合结果，以及总光子数和定位精度。典型结果见代表性结果部分。 图4c-4d.</li>
		<li>编译并运行 phcount.pro 以表征光子计数。使用该 IDL 程序测量荧光染料在光漂白前发射的平均光子数，导入所获取的图像，并输入从强度转换为光子数的转换因子（来自步骤 2.5.2）。 
		注意：程序将自动检测荧光点（也可选择手动选取），计算光子数随帧数的变化，并输出光子数轨迹。
		<ol>
			<li>丢弃质量不佳的轨迹，并指定光漂白后的帧范围以进行基线校正。最后，程序将输出所有未被丢弃斑点的总光子数列表。随后绘制光子数的分布图，并用指数衰减函数拟合该分布，以获得平均光子数。典型结果见代表性结果部分。 图4e-4f.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用FIONA在纳米尺度上量化运动蛋白（例如，肌球蛋白在肌动蛋白上的运动）动力学
<ol>
	<li>聚合肌动蛋白（即 在FIONA实验前一天制备F-actin。
	<ol>
		<li>用普通肌动蛋白缓冲液将G-肌动蛋白（单体）和生物素标记G-肌动蛋白（单体）重悬至10 mg/ml。搅拌确保两者完全溶解，并置于冰上保存。</li>
		<li>混合 10 µl G-actin（单体）与 1.7 µl 1.5 ml 微量离心管中的生物素标记G-actin。加入 100 µl 冰冷的肌动蛋白聚合缓冲液</li>
		<li>在混合物中过夜放置 4 °C （形成F-actin）后加入ddH₂O2加水至终体积为1 ml。</li>
		<li>将肌动蛋白丝（F-actin）储存于 4 °C 用于后续实验。 
		注意：纤维会随着时间推移逐渐解体并缩短，但可使用至少两周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备样品以进行成像。
	<ol>
		<li>制作样品室（如方案 2.1 和 2.2 所述）。用移液器加入 20 µl 1 mg/ml 的生物素标记BSA溶于ddH₂O2O. 孵育10分钟。用 30 µl ddH₂O2O. 
		注意：此步骤可封闭玻璃表面，并沉积生物素以结合肌动蛋白丝。生物素化聚-L-赖氨酸-聚乙二醇（PLL-PEG）也可起到相同作用。</li>
		<li>加入0.5 mg/ml中性亲和素溶液，孵育2分钟，然后用缓冲液洗涤反应腔 30 µl M5缓冲液</li>
		<li>用普通肌动蛋白缓冲液将制备好的F-actin稀释25倍，移取至终浓度约为0.004 mg/ml。静置10分钟，用缓冲液冲洗样品室 30 µl 缓冲液</li>
		<li>用 M5 缓冲液（20 mM HEPES（pH 7.6），2 mM MgCl₂）将带有 FLAG 标签的 myosin Va 稀释 30 倍2，25 mM KCl，1 mM EGTA）至终浓度为250 nM。混匀 1 µl 肌球蛋白与 1 µl Anti-FLAG-Qdot705（~1 µM，使用Qdot705抗体偶联试剂盒，按照制造商说明书将Anti-FLAG抗体与Qdot705偶联。加入 8 μl M5 补足至 10 µl用移液器反复吹打混匀。冰上孵育10分钟。 
		注意：此步骤得到摩尔比为1个马达蛋白对应4个量子点的混合物，肌球蛋白浓度约为25 nM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌球蛋白在肌动蛋白上行走的成像
	<ol>
		<li>配制成像缓冲液（100 µl) 通过混合 84 µl M5-BSA（含1 mg/ml BSA的M5缓冲液）， 1 µl ATP（三磷酸腺苷）50 µM 在 ddH₂O 中2O) 2 µl DTT（500 mM，溶于ddH₂O）2O) 1 µl CK（500 U/ml）， 5 µl CP（200 mM）， 1 µl 程序性细胞死亡， 4 µl 主成分分析， 1 µl 肌球蛋白-量子点经进一步稀释10倍后，肌球蛋白浓度为2.5 nM，以及 1 µl 生物医学工程</li>
		<li>移液加入 20 µl 将成像缓冲液加入样品室，孵育8-10分钟。</li>
		<li>在TIRF显微镜下以30毫秒曝光时间对样品成像，至少采集1,000帧。如有必要，调整步骤3.3.1中肌球蛋白-量子点的用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行数据分析并确定肌球蛋白行走的步长。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开视频文件17 裁剪视频以移动斑点为中心区域。裁剪范围应足够大，确保斑点在运动过程中始终距离边缘超过20像素，并确认视频中无其他斑点存在。确保该斑点沿直线路径运动。</li>
		<li>通过将FIONA分析（步骤2.5.3）应用于视频的每一帧，追踪视频中的光斑，以像素为单位随时间生成x和y坐标。</li>
		<li>将像素转换为纳米，方法如前一节所述。</li>
		<li>根据时间计算从初始位置的位移。</li>
		<li>对位移进行 t 检验以获得肌球蛋白行走的步长。 
		注意：为 t 检验提供的程序（step_t_test.zip）使用 IDL 编写，包含在文件夹中的 14 个子程序。
		<ol>
			<li>在 IDL 中打开所有子程序，并将所有程序编译两次。然后运行 mtltyanalysis_ttest.pro，选择一个仅包含单列距离数据的文本文件。将生成一个输出的 Excel 文件，其中包含原始数据、拟合结果以及步长大小。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>删除步长列中的所有零值。使用 Origin 或 MATLAB 绘制步长的分布图。对直方图拟合高斯分布。 
		注意：需要删除步长为零的数值，因为零步长表示从前一帧未发生移动。拟合结果在36 nm附近出现一个峰值（如图所示） 图 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FIONA 厚样品制备
<ol>
	<li>制备溶胶-凝胶包埋的量子点。
	<ol>
		<li>混合 4.5 ml TMOS 和 1 ml ddH₂O2O 和 100 µl HCl（120 mM）。将混合物置于冰上，在材料列表中指定的超声波清洗仪中进行超声处理30分钟（频率 = 40 kHz，加热器关闭）。每10分钟混匀一次溶液。</li>
		<li>稀释 1.5 µl Qdot605 溶于 1.5 ml HEPES（50 mM，pH 7.2）中。将该溶液与前一步骤中的 1.5 ml TMOS 混合。</li>
		<li>将混合物倒入玻璃底培养皿中。用帕拉膜（Parafilm）密封玻璃底培养皿，并于4 ºC保存1.5小时。</li>
		<li>向样品皿中加入 2 ml 含 1% BME 的 PBS，室温孵育 30 分钟后再进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备经量子点染色的角膜样本。 
	注意：兔眼由 Marina Marjanovic 博士惠赠。
	<ol>
		<li>将角膜从眼球上分离，并切成 3 mm × 3 mm 的小片。</li>
		<li>稀释 1 µl Qdot 605-链霉亲和素溶于1 ml PBS中。将角膜组织与1 nM Qdots溶液在4℃孵育 在 4 ºC 下孵育 1 小时。用 PBS 洗涤组织。</li>
		<li>取一块干净的载玻片和一片#1.5盖玻片。在载玻片长边一侧贴上4层双面胶，再平行于前一排双面胶贴上另外4层双面胶，两排胶带之间留出约1 cm宽的通道。将上一步骤中的组织置于通道中央，盖上盖玻片。</li>
		<li>轻轻按压盖玻片两侧，使其粘附于胶带。用液体润湿通道 50 µl 成像前用 PBS 处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在溶胶-凝胶和角膜中成像量子点
	<ol>
		<li>对于厚样品的FIONA成像，使用工作距离为0.27 mm的60倍水浸物镜，或使用工作距离为0.28 mm的60倍水浸物镜。</li>
		<li>将样品置于显微镜上。调节TIRF镜头，使其进入落射荧光模式（即 激光束以一定角度从物镜射出并作用于盖玻片。插入一个额外的放大透镜（3.3倍或4.0倍）。</li>
		<li>将物镜的焦平面移动至所需的 z 位置（例如 &gt;200 µm）。记录样品中静止量子点的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照本方案第2.5节所述进行FIONA分析。</li>
</ol>

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li>
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<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

FIONA 是一种能够以纳米级精度和低至 1 毫秒时间分辨率定位荧光发射源（有机荧光团或量子点）位置的技术4-8。当收集到足够光子时，该技术可比衍射极限（约 200 nm）更精确地确定荧光发射源的位置，从而为观察传统光学显微镜无法分辨的结构提供了途径4-8。自发明以来，FIONA 已成功应用于观测多种分子马达的运动行为，如肌球蛋白和驱动蛋白。近年来，该技术结合其他研究3,19，进一步推动了某些新兴超分辨率成像技术（如 STORM 和 PALM）中的定位过程13-16。
实现FIONA的关键步骤在于收集光子的数量，该数量受多种因素影响。例如，用于FIONA实验的TIRFM装置应精确对准，以获得良好的PSF（即 未拉伸，未染色 等等。）时，即可获得合理的信噪比。此外，应使用数值孔径（NA）较高的物镜，以尽可能多地收集光子。
为了收集更多光子，从...

约在1882年，恩斯特·阿贝发现可见光显微镜的分辨率约为λ/2NA，即约200 nm（其中λ为波长，NA为数值孔径）。1,2因此，任何小于该尺寸的物体在光学显微镜下均会呈现为一个受衍射极限限制的光斑。然而，可以以高得多的精度确定该光斑的中心位置，即物体的实际位置。3单荧光分子纳米级精确定位技术（FIONA）是一种简单而实用的技术，可在x-y平面内以纳米级精度对单个荧光分子进行定位。4定位精度，σµ (即，均值的标准误差）取决于收集到的光子总数， <img alt="Statistical error equation; √(s²/N + a²/12N + 8πs⁴b²/a²N²); formula for precision analysis." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1">，其中 N 为光子计数，s 为荧光斑点的标准差，a 为成像探测器的像素尺寸，b 为背景的标准差3,4对于发射约 10,000 个光子的荧光染料，FIONA 可实现约 1 nm 的定位精度4.
FIONA 可用于精确定位静止或运动的发光体（假设成像速度足够快）。FIONA 可逐帧应用于视频图像，从而追踪单个分子的运动4-8。可能需要使用光保护试剂，以确保样品不发生光降解。此外，荧光物体本身的尺寸可以任意，无论其大小是否超过衍射极限——例如，它可能是一个含有许多分散在其膜上的荧光蛋白的细胞器（约 1 µm）。使用 FIONA 仍可获得其平均质心位置的高精度（纳米级）结果。FIONA 在定位精度上的显著提升，使得随时间分辨纳米级运动成为可能，从而将显微技术推进至分子尺度4-8。
自其发明以来，FIONA 已衍生出多种变体。例如，具备一纳米精度的明场成像技术（bFIONA）9，FIONA 的一种微小变体，可成像并定位黑色素体等密集物体 体内 （含有黑色素的暗色物体）的透射光成像。此外，FIONA 已被用于分辨多种染料。例如，结合光漂白的单分子高分辨率成像（SHRImP）10,11 或单分子高分辨率共定位（SHREC）12 已开发出可在约10 nm范围内分辨两种染料的技术。（请注意，此为 分辨率 即 一种染料与另一种相同染料之间区分的准确程度。）最近，FIONA 分析已应用于某些超分辨率显微技术（如随机光学重建显微镜，STORM）的定位过程。13-15 光激活定位显微镜（PALM）16，其中临时性的暗态荧光团被激发，随后对荧光信号进行定位。通过反复激发密度较低的染料分子（每个衍射极限光斑内少于一个），收集其荧光信号，并利用FIONA对每个信号进行分析，即可构建出高分辨率图像。此时分辨率仅受限于每个染料分子发射的光子数量，以及样品保持静止的程度（包括 例如采集过程中显微镜载物台的移动
本文概述了FIONA技术，并简要介绍了利用FIONA开展的研究实例。首先，介绍了如何搭建FIONA实验所需的设备， 即，描述了一种全内反射荧光显微镜（TIRFM）的使用方法，并详细说明了光学系统的对准步骤。接着，通过适当的实验方案，演示了如何对固定化的Cy3标记DNA单分子进行简单的FIONA实验以实现精确定位。随后，展示了利用FIONA测量单个截短型肌球蛋白Va（myosin Va）分子马达36 nm步长的方法。肌球蛋白Va是一种关键的持续性运动蛋白，可在沿肌动蛋白丝移动时运输细胞内货物。本实验采用截短的肌球蛋白Va构建体，以去除与步长无关的功能域，并在其C末端添加FLAG标签，便于使用带有抗FLAG抗体的功能化量子点进行标记。实验在低ATP浓度条件下进行，以减缓肌球蛋白的运动速度，从而允许使用足够长的曝光时间，确保每一帧图像获得充足的光子计数。在以下实验流程中，任何足够亮的荧光标记均可替代所用标记物。最后，报告了近期将FIONA技术应用于厚样本的探索性研究。作为原理验证，将量子点浸入溶胶-凝胶材料和兔眼角膜中，随后利用FIONA对其进行成像与定位。成像时采用60X水浸物镜（数值孔径NA=1.2），因其工作距离长于此前常用的100X油浸物镜。为补偿该物镜放大倍数较低的问题，在发射光路中额外插入了一个放大透镜（3.3X或4.0X）。此外，为了获取厚样本深层区域的信号，需采用落射荧光（非全内反射）显微镜模式。结果表明，浸入溶胶-凝胶及兔眼角膜深层（Z方向）的量子点 &gt; 200 µm）可实现2-3 nm精度的定位。

<table><tbody><tr><td>双面胶带</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &amp;#181;微米厚</td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>布拉索斯</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>荧光滤光片组</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白聚合缓冲液&amp;nbsp;</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的G-肌动蛋白</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-肌动蛋白&amp;nbsp;</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>通用肌动蛋白缓冲液&amp;nbsp;</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>激光快门（带驱动器）</td><td>Electro-Optical Products Corp.&amp;nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16–0.19 mm 厚</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>金印载玻片&amp;nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93–1.05 毫米厚</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿&amp;nbsp;</td><td>体外科学</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA 寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'生物素</td></tr><tr><td>荧光微球&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 抗体偶联试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学平台</td><td>Newport 公司</td><td></td><td>RS4000 系列</td></tr><tr><td>60倍物镜</td><td>尼康</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100倍物镜</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 油镜 &amp;infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60倍物镜</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>起源</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>兔肌酸磷酸激酶</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>磷酸肌酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-二硫苏糖醇</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;四乙酸</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>主成分分析</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>原儿茶酸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>程序性细胞死亡</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>原儿茶酸-3,4-双加氧酶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>正硅酸四甲酯</td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸</td></tr><tr><td>1&amp;rdquo; 带安装架的直径宽带介质镜</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BB1-E02，KM100</td><td>数量：2</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; 直径柱</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TR4</td><td>数量 &amp;ge; 6</td></tr><tr><td>10倍扩束镜</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rdquo; 直径 f = 300 mm 带镜座透镜</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LA1256-A，LMR2</td><td>TIR透镜</td></tr><tr><td>荧光对齐靶标&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>VRC2SM1</td><td></td></tr><tr><td>激光安全护目镜</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>中性密度滤光片</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>光束分析仪</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>后置式虹膜光圈</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ID25</td><td>数量：2</td></tr><tr><td>剪切干涉仪</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 平移台， &amp;frac12;&amp;rdquo; 旅行&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>激光</td><td>World Star Technologies&amp;nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm，30 mW</td></tr></tbody></table>

单纳米荧光成像（fiona）

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

纳米级精度荧光成像（FIONA）是一种简单而实用的技术，可用于在x-y平面内以纳米级精度定位单个荧光分子。本文概述了FIONA技术的基本原理，并简要介绍了利用FIONA开展的一些研究实例。首先，介绍了如何搭建FIONA实验所需的设备， 即，描述了一种全内反射荧光显微镜（TIRFM）技术，并详细介绍了光学系统的对准方法。随后展示了如何采用适当方案对固定化的Cy3标记DNA单分子进行简单的FIONA实验，以实现精确定位；接着说明了如何利用FIONA测量以量子点标记的单个截短型肌球蛋白Va马达的36 nm步长。最后，报道了近期将FIONA技术拓展应用于厚样品的研究进展。结果表明，通过使用水浸物镜，并将量子点浸入溶胶-凝胶以及兔眼角膜深层组织中，可实现对较厚样品中单分子的高精度定位。&#62;200 µm）时，可实现2-3 nm的定位精度。

典型的物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）装置如图3所示。首先对表面固定的Cy3-DNA样品进行成像，典型图像如图4a所示。该图像的曝光时间为0.5秒，EM增益为50，相机的CCD灵敏度为12.13。单个Cy3-DNA分子的点扩散函数（PSF）如图4b所示（来自图4a中箭头所指的斑点），其中颜色条表示像素强度的尺度。实际光子数可通过将像素强度乘以转换因子α = CCD灵敏度 / EM增益来计算。该斑点包含约14,000个光子（经背景校正后）。
然后使用二维高斯函数 f(x,y) = z 对点扩散函数（PSF）进行拟合0 + A·exp(-(x-µx)2 / (2秒x2) - (y-µy)2 / (2秒y2），如图所示 图 4c</str...

利用FIONA技术可实现单个荧光分子的纳米级精确定位。本文介绍了FIONA技术的基本原理，并详细描述了如何开展FIONA实验。

单纳米荧光成像（FIONA）

纳米级精度荧光成像（FIONA）是一种简单而实用的技术，可用于在纳米精度下定位单个荧光分子……

本实验的总体目标是演示如何以一纳米的精度进行荧光成像，即FIONA实验。首先需要搭建所需的设备，并对光学系统进行调整，以实现全内反射荧光显微镜（TIRF）成像。下一步是在样品腔的内表面固定CY3标记的DNA，并以纳米级精度定位单个CY3标记的DNA分子。随后，应用 Fiona 研究单个被量子点标记的截短型肌球蛋白 V a 分子马达的运动。最终，通过 Fiona 分析测得肌球蛋白在肌动蛋白上行走的步长为 36 纳米。尽管该方法可为分子马达的研究提供深入见解，也可应用于其他系统，例如细胞膜上受体的追踪。该方法的可视化演示至关重要，因为其实验细节难以学习。在安装过程中，必须始终佩戴激光安全护目镜。适用于全内反射、荧光、显微镜或草坪。首先，将所有光学元件的高度调节至显微镜后端口中心的高度，安装激光器、激光快门和中性密度（ND）滤光片。使用ND滤光片将激光功率尽可能降低，同时保持光束可见。使用合适的六角扳手拧紧螺丝。按照虚线蓝色线条所示规划光路。在此示意图中，使用胶带或标记笔在光学平台上标出光路。将反射镜 M1 置于第一个直角转弯处，并将两个光阑放置在规划光路的第二段直线部分上。调整 M1 的位置和倾斜角度，使激光通过光阑并射向反射镜 M2。在第二个直角转弯处，将 10 倍扩束镜放置在光路的第三段直线部分。调节其倾斜角度，使扩束镜与光学平台以及规划的光路均保持平行。下一步是迭代调整 M1 和 M2，使激光束直接穿过扩束器的两个透镜 L1 和 L2 的中心。使用一张白纸在扩束器后方阻挡光束，通过肉眼检查光束轮廓。调节至扩束后光束的轮廓呈非ED状态为止。调节高斯光束使L1与L2之间的距离合适，从而实现光束准直。取下激光显微物镜，换上荧光对准装置。调整M3和M4反射镜，将扩束后的光束导入显微镜端口并投射至二向色镜上。在物镜转换器内部。调节M3，使光束最亮部分对准荧光靶中心，调节M4使光束倾斜方向垂直，关闭激光器，然后将物镜重新拧入。微调M3和M4的倾斜角度，以优化物镜输出的激光功率和光束轮廓。将 E-M-C-C-D 相机安装到显微镜上，并将相机连接至计算机。启动相机的配套软件。在显微镜上安装荧光样品。观察相机上的明亮荧光点。检查当焦距改变时，该光点在屏幕上是否不发生移动。将TIR透镜放置在XY、Z平移台上，使其与物镜后焦平面之间的距离等于焦距L3，约为30厘米。调整透镜 L three 的位置，使激光通过透镜中心。沿光路平移 L three 以调节光束准直。确保光束在显示器上仍保持居中，且形状对称。将L3垂直于光束路径平移，使光束偏离物镜。持续平移全内反射（TIR）透镜，确保在进行Fiona实验前已实现全内反射。对固定和可移动的CY3标记DNA单分子进行定位实验。按照协议文本中的详细步骤构建样品腔室。将两条双面胶带贴在载玻片的长边边缘，中间留出三到五毫米的间隙，然后将一块清洁的盖玻片置于载玻片上方，图示为从右侧和正面观察的样品室侧视图。样品室的两端保持开放，作为进样口和出样口，用于将SI 3D NA固定在样品室的内表面。用移液器向样品室中加入10微升BSA生物素溶液。等待五分钟。用移液器将40微升T 50 BSA加入样品室，清洗样品室。然后向样品室中加入10微升neut travain，孵育五分钟。用 40 µL T50 BSA 溶液冲洗样品室一次，再向样品室中加入 20 µL SI 3D NA，孵育 5 分钟。最后，用 80 µL T50 BSA 溶液冲洗样品室。为开始成像 SI 3D NA 单分子的实验，用移液器将 30 µL 成像缓冲液加入样品室，静置 8 至 10 分钟。将样品安装在配备绿色激光器、100倍油浸物镜和电子倍增CCD（E-M-C-C-D）相机的共聚焦显微镜上进行成像。设置曝光时间和EM增益。采集样品共1000帧的动态图像。编译并运行Fiona Pro以进行Fiona分析。使用此IDL程序导入采集的图像，输入有效像素尺寸以及光强到光子数的转换系数，并选择用于Fiona分析的荧光点。程序最后将输出二维高斯函数拟合结果，以及总光子数和定位精度，并编译运行pH Count Pro。为了表征光子计数，使用此深度学习程序来测量植物发射的平均光子数。在光漂白前四次导入所获取的图像，并输入从强度到光子数的转换系数。该程序将检测荧光点，自动计算光子计数随帧数的变化，并输出光子计数的轨迹。用移液器将20微升浓度为每毫升1毫克的生物素化BSA溶于DD H2O中，加入样品室，作为本实验的样品准备。孵育10分钟。用30微升D ddh冲洗，再加入0.5毫克/毫升的中性亲和素溶液20微升，孵育2分钟。用30微升M5 PSA缓冲液清洗腔室。本实验所需的F-肌动蛋白必须按照方案文本所述，在前一天制备。将制备好的F-肌动蛋白用普通肌动蛋白缓冲液稀释25倍，终浓度约为0.004毫克/毫升。将肌动蛋白溶液用移液器加入样品室，静置10分钟。用30微升缓冲液冲洗样品室，将带有Flag标签的肌球蛋白V A稀释30倍。用M5缓冲液将其稀释至终浓度为250纳摩尔。取一微升稀释后的肌球蛋白与一微升 Anti-Flag Q.Do 7 0 5 混合。加入八微升 M five，使总体积达到十微升，用移液器吹打混匀。置于冰上孵育十分钟。将含有肌球蛋白量子点的20微升成像缓冲液加入样品室中。孵育8至10分钟。在TURF显微镜下以30毫秒曝光时间对样品进行成像。至少采集 1000 帧以开始数据分析。在 ImageJ 中打开视频文件，并围绕移动的斑点对视频进行裁剪。通过将 Fiona 分析应用于视频的每一帧，追踪该斑点随时间推移的运动轨迹，从而获得以像素为单位的 X 和 Y 坐标。按照方案文本中所述将像素转换为纳米。计算随时间变化的相对于初始位置的位移。对位移进行T检验以获得肌球蛋白行走的步长。从步长列中删除所有零值。使用 Origin 或 MATLAB 绘制步长的分布图。对直方图进行高斯拟合。在此表面固定的SI 3D NA典型图像中，黄色箭头指向一个SI 3D NA单分子，其点扩散函数（PSF）如图所示。该PSF通过二维高斯函数进行拟合，同时展示了拟合残差。此图为单个肌球蛋白在良好信噪比条件下的光子计数随帧数变化的典型轨迹，通过指数拟合得到平均光子数约为1.4×10⁶，用于测量肌球蛋白的步长。当其移动时，会捕获到一条肌动蛋白丝。图中展示了三个示例帧。对每一帧应用FIONA分析，得到以红色绘制的距离随时间变化的轨迹。基于T检验的步进识别算法用于提取单个步进，结果以白色叠加显示。步进大小和纳米单位以白色标注。当将多个轨迹的步进合并为直方图时，测得的步进大小呈高斯分布，中心值为35.8 ± 0.4 纳米。观看本视频后，您应充分理解如何开展FIONA实验，包括设置TIRF显微镜以获得最佳结果。在这些实验中，至关重要的是尽量减少光漂白对荧光分子的损伤。请注意，使用草坪显微镜和Fiona可能存在极高危险性，因此在进行该操作时应佩戴安全护目镜等防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

荧光成像与一纳米精度（FIONA）

我们描述了一种在电子显微照片中定位荧光标记蛋白的方法。首先在超薄切片上利用光激活定位显微镜对荧光信号进行定位，然后将这些图像与同一切片的电子显微照片进行配准对齐。...

纳米级荧光-电子显微：利用光激活定位显微镜与电子显微镜进行蛋白质定位

我们描述了一种制备具有最小流体动力学尺寸的胶体量子点的方法，用于单分子荧光成像。与传统量子点相比，这些纳米粒子的尺寸与球状蛋白质相似，并在单分子亮度、抗光降解稳定性以及抵抗与蛋白质和细胞的非特异性结合方面进行了优化。...

用于单分子成像的紧凑型量子点

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

四维（4D）成像技术被用于研究活体脊椎动物神经末梢中两种内体之间的行为及其相互作用。这些微小结构的运动在三维空间中得以表征，从而能够确认内体融合和胞吐等事件的发生。...

活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。...

通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

我们介绍了利用全内反射荧光显微镜（TIRF）从大型供体-受体网络获取单分子FRET数据的实验装置及操作流程。通过贝叶斯推断软件Fast-NPS对这些测量数据进行逐步分析，结合适配的染料模型，可获得高分辨率的结构信息。...

使用快速纳米定位系统从单分子FRET实验中获取结构信息

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

本方法学的总体目标是从样品制备到图像采集与重建，提供最佳实验条件，以在固定细胞中实现微管和中间丝的二维双色dSTORM成像。...

利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。...

使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸&lt;1...

使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程

学习使用FIONA技术进行单分子定位，以纳米级精度追踪分子马达运动。本方法通过全内反射荧光显微镜测量肌球蛋白步长，揭示细胞生物学中分子机制的动态过程。

单纳米荧光成像（FIONA）

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