单纳米荧光成像（FIONA）

本实验的总体目标是演示如何以一纳米的精度进行荧光成像，即FIONA实验。首先需要搭建所需的设备，并对光学系统进行调整，以实现全内反射荧光显微镜（TIRF）成像。下一步是在样品腔的内表面固定CY3标记的DNA，并以纳米级精度定位单个CY3标记的DNA分子。

随后，应用 Fiona 研究单个被量子点标记的截短型肌球蛋白 V a 分子马达的运动。最终，通过 Fiona 分析测得肌球蛋白在肌动蛋白上行走的步长为 36 纳米。尽管该方法可为分子马达的研究提供深入见解，也可应用于其他系统，例如细胞膜上受体的追踪。

该方法的可视化演示至关重要，因为其实验细节难以学习。在安装过程中，必须始终佩戴激光安全护目镜。适用于全内反射、荧光、显微镜或草坪。

首先，将所有光学元件的高度调节至显微镜后端口中心的高度，安装激光器、激光快门和中性密度（ND）滤光片。使用ND滤光片将激光功率尽可能降低，同时保持光束可见。使用合适的六角扳手拧紧螺丝。

按照虚线蓝色线条所示规划光路。在此示意图中，使用胶带或标记笔在光学平台上标出光路。将反射镜 M1 置于第一个直角转弯处，并将两个光阑放置在规划光路的第二段直线部分上。

调整 M1 的位置和倾斜角度，使激光通过光阑并射向反射镜 M2。在第二个直角转弯处，将 10 倍扩束镜放置在光路的第三段直线部分。调节其倾斜角度，使扩束镜与光学平台以及规划的光路均保持平行。

下一步是迭代调整 M1 和 M2，使激光束直接穿过扩束器的两个透镜 L1 和 L2 的中心。使用一张白纸在扩束器后方阻挡光束，通过肉眼检查光束轮廓。调节至扩束后光束的轮廓呈非ED状态为止。

调节高斯光束使L1与L2之间的距离合适，从而实现光束准直。取下激光显微物镜，换上荧光对准装置。调整M3和M4反射镜，将扩束后的光束导入显微镜端口并投射至二向色镜上。

在物镜转换器内部。调节M3，使光束最亮部分对准荧光靶中心，调节M4使光束倾斜方向垂直，关闭激光器，然后将物镜重新拧入。微调M3和M4的倾斜角度，以优化物镜输出的激光功率和光束轮廓。

将 E-M-C-C-D 相机安装到显微镜上，并将相机连接至计算机。启动相机的配套软件。在显微镜上安装荧光样品。

观察相机上的明亮荧光点。检查当焦距改变时，该光点在屏幕上是否不发生移动。将TIR透镜放置在XY、Z平移台上，使其与物镜后焦平面之间的距离等于焦距L3，约为30厘米。

调整透镜 L three 的位置，使激光通过透镜中心。沿光路平移 L three 以调节光束准直。确保光束在显示器上仍保持居中，且形状对称。

将L3垂直于光束路径平移，使光束偏离物镜。持续平移全内反射（TIR）透镜，确保在进行Fiona实验前已实现全内反射。对固定和可移动的CY3标记DNA单分子进行定位实验。按照协议文本中的详细步骤构建样品腔室。

将两条双面胶带贴在载玻片的长边边缘，中间留出三到五毫米的间隙，然后将一块清洁的盖玻片置于载玻片上方，图示为从右侧和正面观察的样品室侧视图。样品室的两端保持开放，作为进样口和出样口，用于将SI 3D NA固定在样品室的内表面。用移液器向样品室中加入10微升BSA生物素溶液。

等待五分钟。用移液器将40微升T 50 BSA加入样品室，清洗样品室。然后向样品室中加入10微升neut travain，孵育五分钟。

用 40 µL T50 BSA 溶液冲洗样品室一次，再向样品室中加入 20 µL SI 3D NA，孵育 5 分钟。最后，用 80 µL T50 BSA 溶液冲洗样品室。为开始成像 SI 3D NA 单分子的实验，用移液器将 30 µL 成像缓冲液加入样品室，静置 8 至 10 分钟。

将样品安装在配备绿色激光器、100倍油浸物镜和电子倍增CCD（E-M-C-C-D）相机的共聚焦显微镜上进行成像。设置曝光时间和EM增益。采集样品共1000帧的动态图像。

编译并运行Fiona Pro以进行Fiona分析。使用此IDL程序导入采集的图像，输入有效像素尺寸以及光强到光子数的转换系数，并选择用于Fiona分析的荧光点。程序最后将输出二维高斯函数拟合结果，以及总光子数和定位精度，并编译运行pH Count Pro。

为了表征光子计数，使用此深度学习程序来测量植物发射的平均光子数。在光漂白前四次导入所获取的图像，并输入从强度到光子数的转换系数。该程序将检测荧光点，自动计算光子计数随帧数的变化，并输出光子计数的轨迹。

用移液器将20微升浓度为每毫升1毫克的生物素化BSA溶于DD H2O中，加入样品室，作为本实验的样品准备。孵育10分钟。用30微升D ddh冲洗，再加入0.5毫克/毫升的中性亲和素溶液20微升，孵育2分钟。

用30微升M5 PSA缓冲液清洗腔室。本实验所需的F-肌动蛋白必须按照方案文本所述，在前一天制备。将制备好的F-肌动蛋白用普通肌动蛋白缓冲液稀释25倍，终浓度约为0.004毫克/毫升。

将肌动蛋白溶液用移液器加入样品室，静置10分钟。用30微升缓冲液冲洗样品室，将带有Flag标签的肌球蛋白V A稀释30倍。用M5缓冲液将其稀释至终浓度为250纳摩尔。

取一微升稀释后的肌球蛋白与一微升 Anti-Flag Q.Do 7 0 5 混合。加入八微升 M five，使总体积达到十微升，用移液器吹打混匀。置于冰上孵育十分钟。

将含有肌球蛋白量子点的20微升成像缓冲液加入样品室中。孵育8至10分钟。在TURF显微镜下以30毫秒曝光时间对样品进行成像。

至少采集 1000 帧以开始数据分析。在 ImageJ 中打开视频文件，并围绕移动的斑点对视频进行裁剪。通过将 Fiona 分析应用于视频的每一帧，追踪该斑点随时间推移的运动轨迹，从而获得以像素为单位的 X 和 Y 坐标。

按照方案文本中所述将像素转换为纳米。计算随时间变化的相对于初始位置的位移。对位移进行T检验以获得肌球蛋白行走的步长。

从步长列中删除所有零值。使用 Origin 或 MATLAB 绘制步长的分布图。对直方图进行高斯拟合。

在此表面固定的SI 3D NA典型图像中，黄色箭头指向一个SI 3D NA单分子，其点扩散函数（PSF）如图所示。该PSF通过二维高斯函数进行拟合，同时展示了拟合残差。此图为单个肌球蛋白在良好信噪比条件下的光子计数随帧数变化的典型轨迹，通过指数拟合得到平均光子数约为1.4×10⁶，用于测量肌球蛋白的步长。

当其移动时，会捕获到一条肌动蛋白丝。图中展示了三个示例帧。对每一帧应用FIONA分析，得到以红色绘制的距离随时间变化的轨迹。

基于T检验的步进识别算法用于提取单个步进，结果以白色叠加显示。步进大小和纳米单位以白色标注。当将多个轨迹的步进合并为直方图时，测得的步进大小呈高斯分布，中心值为35.8 ± 0.4 纳米。观看本视频后，您应充分理解如何开展FIONA实验，包括设置TIRF显微镜以获得最佳结果。在这些实验中，至关重要的是尽量减少光漂白对荧光分子的损伤。

请注意，使用草坪显微镜和Fiona可能存在极高危险性，因此在进行该操作时应佩戴安全护目镜等防护装备。