Name: 控制皮层影响模型创伤性脑损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 学习控制皮层冲击模型在小鼠中诱导创伤性脑损伤的方法，包括麻醉、颅骨切除术和冲击系统设置。该模型为研究脑损伤病理机制和开发治疗策略提供了可重复的标准化平台。

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本工作获得了印第安纳脊髓研究基金的资助 &amp;#38; 脑损伤研究资助（SCBI 200-12）、Ralph W. 和 Grace M. Showalter 研究奖、印第安纳大学生物研究资助、NIH 资助 RR025761 和 1R21NS072631-01A。

动物护理 
雄性C57 BL/6小鼠群养，维持在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，可自由获取食物和水。ad libitum。本方案所用动物年龄为10至12周。所有操作均根据印第安纳大学动物护理与使用委员会批准的方案进行。
1. 手术准备
<ol>
	<li>使用氯胺酮/赛拉嗪&#160;混合物（87.7 mg/ml 氯胺酮和 12.3 mg/ml 赛拉嗪）&#160;对小鼠进行麻醉，并通过腹腔注射&#160;给予（1 ml/kg）。</li>
	<li>剃除小鼠两耳之间的头部毛发。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹凡士林&#160;以防止手术期间眼睛干涩。</li>
	<li>用10%碘液清洁剃毛区域，然后用70%乙醇擦去碘液。</li>
	<li>使用耳杆和门齿固定板将小鼠头部固定于立体定位仪上，确保脑组织稳定。</li>
</ol>
2. 开颅术
<ol>
	<li>使用剪刀在头部正中做一纵向切口。用止血钳将皮肤向左侧牵开并固定。</li>
	<li>用棉签清除骨面上的血液和组织，暴露颅骨。让暴露的颅骨干燥1分钟。</li>
	<li>用镊子施加压力，确保颅骨保持不动。确定解剖标志：人字缝（后部）和冠状缝（前部）。在人字缝与冠状缝的中点处画一个直径4&#160;mm、距中线0.5&#160;mm的圆圈。</li>
	<li>使用钻头沿标记的圆圈进行切割。轻轻吹去骨屑。切勿将颅骨完全钻透，以免损伤硬脑膜。</li>
	<li>用镊子移除骨片，暴露硬脑膜。</li>
</ol>
3. 撞击法
撞击系统包括一个用于设定撞击参数的控制箱、一个执行撞击的致动器，以及一个用于固定致动器和小鼠头部以进行撞击的立体定位框架。
<ol>
	<li>手术前将致动器的速度预设为 3&#160;m/sec。</li>
	<li>预设不同的形变深度以诱导不同严重程度的损伤。形变深度为 0.0–0.2 mm、0.5–1.0 mm 和 1.2–2.0 mm 时，分别对应轻度、中度和重度创伤性脑损伤（TBI）。本方案描述了如何使用 3&#160;m/sec 的速度实现形变深度为 1&#160;mm 的中重度脑损伤。</li>
	<li>将致动器安装至立体定位架上的支架，并使用微操纵器移动致动器，使其圆形平头端（直径 3&#160;mm）固定于暴露颅骨区域的中心位置，然后调整其角度，使致动器尖端与撞击部位表面平行。</li>
	<li>通过在伸展模型中下移致动器，使其尖端接触撞击部位表面，以此建立零点，随后将立体定位控制面板上的 Z 轴通道设为零。</li>
	<li>在回缩撞击头的同时，同步将致动器下移 1&#160;mm。</li>
	<li>按下撞击按钮，对损伤部位进行撞击，实现 1&#160;mm 的形变深度。</li>
</ol>
4. 损伤部位闭合
<ol>
	<li>使用棉签清除撞击后残留的血液，但不要触碰受伤区域。</li>
	<li>将小鼠放置在加热垫上以维持体温。</li>
	<li>待出血停止后，缝合伤口。将动物放回洁净的笼子中，并在加热垫上过夜恢复。</li>
	<li>术后连续2天，每8-12小时皮下注射一次&#160;Buprenorphine 0.05-0.10 mg/kg&#160;。</li>
</ol>

<ol><li>Menon, D. K., Schwab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+statement%3A+definition+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Position statement: definition of traumatic brain injury.</a> Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).</li>
<li>Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Experimental models of brain injury.</a> J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).</li>
<li>Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+cortical+impact+model+of+traumatic+brain+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat.</a> J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).</li>
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<li>Chen, S., Pickard, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+cellular+pathology+after+controlled+cortical+impact+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury.</a> Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).</li>
<li>Long, J. B., Bentley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast+overpressure+in+rats%3A+recreating+a+battlefield+injury+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).</li>
<li>Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+accumulation+after+traumatic+brain+injury+in+rats%3A+comparison+of+weight+drop+and+controlled+cortical+impact+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models.</a> J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).</li>
<li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li>
<li>Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed%2C+selective+neuronal+death+following+experimental+cortical+impact+injury+in+rats%3A+possible+role+in+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits.</a> Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).</li>
<li>Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury+leads+to+increased+expression+of+peripheral-type+benzodiazepine+receptors%2C+neuronal+death%2C+and+activation+of+astrocytes+and+microglia+in+rat+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus.</a> Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).</li>
<li>Gao, X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+promotes+neural+precursor+proliferation+without+increasing+neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

使用电子磁力冲击系统成功制备稳定一致的创伤性脑损伤（TBI）模型以产生颅脑撞击伤（CCI）最关键的步骤包括：1）将小鼠头部稳定固定于立体定位仪框架中；2）在不同小鼠之间制备相同大小的骨窗，并在去骨瓣过程中去除颅骨的同时避免损伤其下方的硬脑膜；3）在冲击前将冲击头准确置于骨窗中央位置，并建立零点定位。
在进行撞击前，必须将小鼠头部非常牢固地固定在立体定位仪框架中。固定不牢会导致损伤程度出现较大变异。为确保固定稳定，可在小鼠头部固定于立体定位仪框架后，使用镊子对颅骨施加压力，并确认颅骨保持不动。需采取预防措施，避免暴露的颅骨发生感染。在暴露颅骨后，进入控制性皮质撞击手术中最困难的步骤：在不损伤下方硬脑膜的前提下，于颅骨上钻出一个环形切口。
钻头尖端的最佳尺寸为0.5&#160;mm。合适的转速为10,000-20,000 rpm；然而，使用更高的转速有助于钻出更理想的骨窗。钻孔过程中会产生热量，可能损伤脑组织，尤其是在颅骨与硬脑膜紧密贴附的幼年小鼠中。为防止脑组织受损，钻孔时应向颅骨表面滴加生理盐水。滴加生理盐水后，需使用解剖显微...

创伤性脑损伤（TBI）是指由外力引起的脑功能改变或存在其他脑部病理学证据1。TBI 仍是全球范围内严重的健康问题，尤其是在美国。根据美国疾病控制与预防中心的数据，美国每年至少发生 170 万例 TBI，占所有与损伤相关死亡的 30.5%。仅在 2000 年，美国 TBI 的直接医疗费用和间接费用总计估计达 765 亿美元。尽管过去几十年在技术和治疗方面取得的进展改善了 TBI 患者的生活质量和生存时间，但目前尚无有效的药物或预防性治疗方法。由于 TBI 具有复杂且广泛的影响，包括组织损伤、细胞死亡和轴突退变，因此没有两种损伤是完全相同的；因此，目前尚无任何动物 TBI 模型能够准确再现人类 TBI 的所有方面。然而，动物模型确实能够产生几乎一致的损伤，有助于研究 TBI 的各种影响，从而进一步理解 TBI 的临床表现。
控制性皮层冲击（CCI）模型利用冲击系统对动物暴露的硬脑膜施加物理冲击，可诱导出从轻度到重度的创伤性脑损伤（TBI），其程度与人类所经历的损伤相似。该损伤模型最初在雪貂中建立2，随后被改进用于大鼠3,4、小鼠5-7和绵羊8。自首次建立以来，损伤部位已被设置于中线部位2,9或外侧皮层10。CCI 提供了一种简便且精确的方法，用于研究创伤性脑损伤的效应及其潜在治疗方法。
除了CCI模型外，液体打击和重物坠落模型也常用于制备创伤性脑损伤（TBI）。然而，这些模型存在局限性，包括对损伤参数的控制较弱、产生在人类TBI中未见的组织病理学改变，以及小鼠意外死亡的发生率更高3,5,10。冲击波模型也被用于制备TBI。尽管冲击波模型无法复制机械撞击后所见的组织病理学改变，但该模型能够准确模拟军事人员所经历的TBI11。由于能够精确控制变形参数（如撞击时间、速度和深度），可控性皮质撞击模型更易于操控5。这种精确性使得在整组动物中复制几乎相同的损伤成为可能。最重要的是，CCI模型能够再现人类TBI中所见的损伤特征12。然而，目前尚无一种动物模型能够完全成功地复制TBI后观察到的全部病理变化谱系。仍需进一步研究以全面揭示TBI后发生的急性和慢性变化。
创伤性脑损伤（TBI）后会出现两种类型的损伤：原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤发生在撞击瞬间，对治疗干预不敏感；然而，继发性损伤在初始损伤之后持续存在，可通过治疗手段进行干预13。控制性皮质冲击模型可产生原发性损伤，从而允许研究人员研究TBI的影响以及针对继发性损伤可能长期效应的潜在治疗方法。利用CCI模型开展的潜在研究领域包括神经元死亡、脑水肿、神经发生、血管效应、组织病理学改变、记忆缺陷等3,13-16。

<table><tbody><tr><td>7.5% 聚维酮碘</td><td>Purdue product L.P.</td><td></td><td>外科刷洗</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Henry Schein</td><td>100-6015</td><td>清除血液和碎屑</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>手术</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td>手术</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13021-12</td><td>手术</td></tr><tr><td>可充电无线微型钻机</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>与钻头配合使用以制作骨窗</td></tr><tr><td>微型钻机用钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>单股缝合线</td><td>Ethicon</td><td>G697</td><td>缝合</td></tr><tr><td>叔戊醇</td><td>Sigma</td><td>152463-250ML</td><td>配制 2.5% Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>配制 2.5% Avertin</td></tr></tbody></table>

创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

每年有超过一百万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）。结合全球TBI的发生率，其对身体、情绪、社会和经济方面的影响令人震惊。因此，有必要进一步研究TBI的影响及有效的治疗方法。控制性皮质冲击（CCI）模型可诱导从轻度到重度的创伤性脑损伤。该方法使用刚性冲击器，以精确控制的速度向开颅术后暴露的完整硬脑膜传递机械能量，从而在设定参数下实现预定的变形深度。尽管存在其他TBI模型，如自由落体撞击和液体冲击模型，但CCI模型更为精确、易于控制，且最重要的是，所产生的创伤性脑损伤与人类患者所见的损伤更为相似。然而，目前尚无任何TBI模型能够完全复制人类患者中观察到的病理变化。CCI模型可用于研究TBI的短期和长期影响，例如神经元死亡、记忆缺陷和脑水肿，以及潜在的TBI治疗手段。

控制性皮层冲击模型可产生从轻度到重度不同程度的创伤性脑损伤（TBI）。冲击后，冲击部位颅骨的肿胀程度、出血情况以及颅骨变形程度可反映由冲击速度和变形深度参数所导致的损伤严重性。轻度TBI表现为冲击部位颅骨肿胀，并因硬脑膜轻微破裂而出现少量出血。中度TBI则因冲击时硬脑膜破裂，表现出更明显的颅骨肿胀和出血增加（图1）。中度与重度TBI之间的区别在活体上可能难以分辨，需通过显微镜观察固定后的组织才能明确（图2）；然而，重度TBI有时在冲击后即可表现出更显著的形态扭曲和颅骨肿胀。CCI模型可用于研究TBI多个方面的效应，包括组织变形（图2）、神经元死亡以及组织病理学变化。
<img alt="小鼠颅窗制备过程，展示手术步骤；实验性脑外科手术方法。" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg" width="...

创伤性脑损伤（TBI）仍然是一个严重的健康问题。通过使用控制性皮质冲击手术模型，可以开展针对TBI的影响及潜在治疗方法的研究。

每年有超过一百万美国人遭受创伤性脑损伤（TBI）。结合全球范围内TBI的发生率，其对身体、情绪……

本实验的总体目标是利用可控性皮层冲击模型制备创伤性脑损伤。首先对小鼠进行麻醉并完成手术准备，以实现该目标。实验的第二步是进行颅骨开窗术（C craniectomy）。第三步是使用设定的参数建立撞击系统。最后一步是对暴露的大脑进行撞击。最终，结果可以通过解剖后大脑的影像学观察以及免疫组织化学染色显示皮质损伤腔。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们难以产生稳定一致的脑损伤。本次操作将由本实验室的研究助理 Dr.Shang Gao 演示。麻醉后，将小鼠两耳之间的头部区域剃毛，并使用 10% 碘液和 70% 乙醇交替擦拭清洁暴露的皮肤。接下来，务必润滑眼睛以防止其干燥。然后利用耳杆和咬合板将小鼠固定在立体定位仪框架中，头部应保持非常稳定。使用剪刀在头部正中做纵向切口，开始颅骨切除术。然后用止血钳将皮肤向一侧牵开，并用棉签擦拭、清洁并暴露颅骨。等待约一分钟使其干燥，再继续后续操作。干燥后，使用镊子对颅骨施加压力，确保标本保持固定不动。辨认出人字缝（lambda）和冠状缝（bregma）解剖标志。然后在其中心绘制一个直径为4毫米、距中线0.5毫米的圆。接着沿标记的圆周进行钻孔，使骨质易于折断，但不要穿透至硬脑膜。根据需要清除骨屑。然后使用镊子折断骨环，暴露硬脑膜。C型开颅术是最关键的步骤。保持一致的骨窗参数将有助于实现一致的损伤程度。确保正确使用钻头尺寸、转速和力度。冲击系统利用驱动装置对颅骨实施冲击，需设定若干参数。将驱动装置的速度设为每秒三米。接下来，将驱动器固定到立体定位架上。使用显微操作器，将宽度为3 mm的驱动器置于暴露的颅骨区域。然后调节驱动器的尖端，使其与冲击表面平行。为设定零点，伸出执行器并将其降低，直到探针尖端刚好接触撞击位置。将框架上相应的 Z 轴通道设为零。现在将探针回缩，本例中为一毫米。然后设定相应创伤性脑损伤的变形深度，以驱动执行器。接着点击撞击按钮进行损伤操作。使用棉签清理任何血液，但不要触碰损伤部位。将小鼠移至保温垫上并监测损伤情况。止血后，缝合伤口，然后将小鼠放回铺有保温垫的清洁笼具中，过夜恢复。损伤后，肿胀、出血和颅骨变形的程度反映了损伤的真实严重性。硬脑膜出现部分至完全破裂会显著影响出血量，并导致轻度至中度的创伤性脑损伤。通过固定组织并使用显微镜观察，可轻松区分中度与重度创伤性脑损伤（TBI）。此处采用尼氏（Nissl）染色，将对照组与接受中度TBI的小鼠进行比较，可见一个向皮层深部延伸的空腔。该模型可用于研究脑损伤引起的此类退行性变以及神经元死亡和其他组织病理学变化。一旦掌握，若操作得当，该技术可在15分钟内完成。

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医学

控制皮层影响模型创伤性脑损伤

本视频演示了在小鼠模型中诱导创伤性脑损伤（TBI）的操作步骤。将一只麻醉后暴露颅骨的小鼠置于操作台，通过颅骨开窗，使用撞击装置诱导可控的皮层损伤。该损伤可破坏脑组织，导致认知功能障碍和运动协调能力受损。...

使用撞击器设备建立小鼠创伤性脑损伤模型

脑震荡是创伤性脑损伤中最常见的类型。因此，一种可重复的动物脑震荡模型，若能复制患者损伤的重要特征，则可能为以严谨、可控且高效的方式研究脑震荡提供有效手段。...

小鼠重复性脑震荡损伤模型

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。...

用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

脑实质内出血和神经炎症伴随脑挫伤可引发严重的继发性脑损伤。本方案详细介绍了小鼠可控性皮质冲击（CCI）模型，使研究人员能够研究出血性挫伤及创伤后免疫反应，并探索潜在的治疗方法。...

一种用于创伤性出血性挫伤和神经炎症研究的临床前可控皮层冲击模型

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。...

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

在此，展示了如何利用清醒状态下的闭合性头部损伤模型来研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型可复制r-mTBI患者的重要病理特征，并可与电生理记录、行为学检测及分子生物学分析等技术联合使用 体外...

利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

本方案介绍了一种通过闭合性头部损伤（CHI）方法诱导的重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠改良模型。该方法采用颅骨变薄窗口结合液体打击技术，可减少因脑膜暴露所引起的常见炎症反应，同时提高了在啮齿类动物中建立rmTBI模型的可重复性和准确性。...

改良的小鼠重复性轻度创伤性脑损伤模型结合颅骨变薄窗与液体打击技术

本文介绍了一种建立闭合性头部损伤动物模型的方案，该模型可复制轻度非复杂性创伤性脑损伤的神经影像学特征，即在急性期保留脑结构完整性，并出现长期脑萎缩。纵向磁共振成像是获取证据的主要方法。...

采用落锤法改良并经磁共振成像验证的轻度单纯性创伤性脑损伤模型的建立

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

学习控制皮层冲击模型在小鼠中诱导创伤性脑损伤的方法，包括麻醉、颅骨切除术和冲击系统设置。该模型为研究脑损伤病理机制和开发治疗策略提供了可重复的标准化平台。

创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

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