黑腹果蝇Drosophila melanogaster幼虫盘的解剖与免疫染色

本实验的总体目标是从果蝇幼虫中解离出成虫盘，用于免疫组织化学分析。首先，从幼虫中移除头部复合体，包括口器、钩状结构、眼盘、触角盘和脑组织。第二步是固定头部复合体，并用一抗和二抗进行孵育。随后，将眼盘和触角盘从头部复合体中分离出来。

最后一步是将成虫盘组织用抗淬灭剂封片于载玻片上。最终，通过荧光显微镜观察荧光报告基因或LAC Z报告基因以及抗体染色结果，可以揭示基因和蛋白质在成虫盘组织中的时空表达模式。尽管该技术可用于研究整个成虫盘中基因和蛋白质的定位。

它也可应用于其他成虫盘组织，例如翅腿和平衡棒。开始实验时，用解剖缓冲液填充一个35毫米的培养皿。将10至20条幼虫放入培养皿中，使其游动五分钟。

为了使用工具进行自我清洁，先在硅基解剖板中央制备一个较大的解剖缓冲液池。在大液滴周围放置三个较小的液滴，并用镊子将幼虫转移至最下方的小液滴中。接着，使用5号镊子将一只已清洁的幼虫从较小的液滴转移至较大的解剖缓冲液池中。

开始粗分离时，用一对镊子夹住口钩，另一对镊子轻轻夹住幼虫。在距其体长三分之一处固定住口钩，然后用第二对镊子迅速将虫体其余部分拉离。

松开镊子，使幼虫内脏自然逸出，从而让成虫盘保持其正常形态。然后夹住口钩，用另一把镊子移除幼虫下半部分的三分之二，包括内部肠道。接着，轻柔地去除唾液腺、足成虫盘及其他组织。

应保留的组织仅有少量上覆的角质层、口钩、眼和端盘、脑半球以及腹神经节。在最多20分钟后，将所有解剖得到的组织转移至多聚甲醛-赖氨酸-高碘酸盐固定液中。

固定样本或使用PLP固定液。解剖后的成虫盘组织在解剖缓冲液中停留时间不得超过20分钟，否则组织将发生降解。将解剖得到的组织以100 µL为单位分批转移至含有冷PLP的表面皿中。

使用一对镊子确保已解剖的组织完全浸没。将已解剖的组织在室温下置于冷 PLP 固定液中孵育 45 分钟，不振荡。接着，将 100 微升已解剖的组织从 PLP 转移至洗涤缓冲液中。

确保组织完全浸没，并在室温下静置孵育45分钟。然后将分离的组织转移至1.5毫升微量离心管中。吸除洗涤缓冲液，并加入100微升封闭液替代。

将组织置于室温下，在台式旋转仪上轻轻旋转孵育10分钟。封闭后，移除溶液，并加入100 µL含10%正常山羊血清的一抗溶液。根据抗体的强度，将组织在室温下轻轻旋转孵育16小时。

接下来，移除一抗，并加入 750 微升洗涤缓冲液。将离心管置于室温摇床上孵育 10 分钟。从摇床上取出离心管，静置使组织沉降至管底。

然后移除洗涤缓冲液，并加入100微升含10%正常血清的二抗溶液。根据抗体强度，将试管在室温下轻轻旋转孵育至少2小时。孵育结束后，从组织中移除二抗溶液。

加入 500 微升洗涤缓冲液，使组织沉降至管底。在硅胶解剖板上放置三份洗涤缓冲液。将所有解剖得到的组织转移至解剖皿上较大的洗涤缓冲液池中。

这有助于去除多余的二抗，开始精细解剖。将头部复合体腹面朝下放置，用镊子夹住口钩。将第二把镊子插入大脑与眼盘之间的空隙，迅速将大脑从口钩处拉开，以分离两个脑叶，同时继续夹住口钩。尽可能靠近眼-触角盘的触角部分与口钩之间的连接处，将组织剪断。

继续操作直至所有目标组织均被分离。随后，将两小片大小与盖玻片相当的滤纸置于解剖皿中，间隔约三英寸。将载玻片放置于这两片滤纸上，以防止载玻片粘附在解剖皿的硅胶底座上。

使用 P20 移液器，在玻璃显微镜载玻片中央加入 9 µL 抗淬灭剂，以防止组织荧光发生漂白；使用同一未切割的吸头，收集所有幼虫盘和成虫盘，并将其加入抗淬灭剂液滴中。接着，用镊子在抗淬灭剂液滴内将眼-成虫盘分开并铺展开，确保没有任何两个成虫盘相互接触。然后，使用细毛刷轻轻将盖玻片缓慢放入抗淬灭剂液滴上，避免产生气泡。

最后，将载玻片储存于负20摄氏度，直至准备使用明场或荧光显微镜观察和成像离子顶盘。该方法可稳定地制备出高质量的分析样本，如这些成像盘的共聚焦图像所示。这些成像盘经鬼笔环肽偶联的荧光染料处理，该染料可结合F-肌动蛋白，从而勾勒出每个细胞的轮廓。

眼盘最显著的特征之一是形态发生沟，可在组织内观察到沿背腹轴延伸的凹陷结构。随着形态发生沟在眼区中推进，无序排列的细胞群体被转化为周期性间隔排列的规则小眼单元，即小眼（ommatidia）。该方法的后续应用包括克隆表达的验证以及对幼虫成体盘的分析。

上方三个图显示了使用不同抗体染色的碟状结构，例如 ilis、A DPP、LAC Z 转录报告基因，以及细胞特异性标记物，如胚胎致死性异常视觉（embryonic, lethal, abnormal vision）或 vy，后者编码一种泛神经元 RNA 结合蛋白。下方三个图展示了利用 GFP 标记特定细胞群体的碟状结构。一旦熟练掌握该操作流程，从 10 至 20 条幼虫中分离头部复合体约需 10 分钟，此外，从这些复合体中精细分离离子碟状结构也大约需要 10 分钟。