一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记DNA杂交分析

以下实验的总体目标是利用微流控电化学装置，观察DNA杂交事件对阻抗谱的影响。为此，制备一种电化学芯片，以实现电极传感器阵列，并制备一种微流控PDMS芯片。为便于引入微量样品，将两种芯片键合在一起，并用单链DNA探针进行功能化修饰。

随后加入靶向单链DNA进行DNA杂交，由于带负电荷的双链DNA与带负电荷的铁氰化物分子之间产生更强的排斥力，导致电荷转移电阻升高。最终，通过测量电化学阻抗谱的变化即可检测DNA杂交事件。该技术相较于现有方法（如使用酶标仪或J shift分析）的主要优势在于，能够在不牺牲灵敏度和特异性的前提下，以更小的样品体积和更低的成本实现相同检测效果。

该方法可通过快速特异性DNA序列筛选以及单链DNA序列的二元动力学研究，帮助回答癌症研究、流感检测和基因工程中的关键问题。由于这种快速高通量DNA杂交分析方法能够在低样本量条件下进行，且无需复杂的样本前处理步骤，因此该技术的应用可延伸至遗传性疾病、多种癌症或具有特定DNA标志物（如流感）等疾病的诊断。通常，初次接触该方法的研究人员会面临一定困难，因为微装置的开发需要精确控制加工参数，并采用迭代方式来解决溶液泄漏等问题。

组装设备后，将金电极图案化到电化学芯片上：用镊子夹住一片空白的优等四级四英寸硅片，使用洗瓶依次用丙酮、甲醇和异丙醇冲洗硅片两面。此过程在此后称为在去离子水流下进行的 A MI 清洗。用去离子水冲洗掉硅片上的异丙醇，然后使用氮气枪吹干硅片。

将晶圆装入等离子体增强化学气相沉积（P-E-C-V-D）设备中。输入参数，使生成一层厚度为1微米的二氧化硅钝化层，并启动自动化程序。接下来，使用直流溅射设备在晶圆表面沉积一层厚度为200埃的铬层，然后沉积一层厚度为2000埃的金层。将晶圆装载到匀胶机上，用氮气枪吹扫表面灰尘，并使用移液器滴加Spin PR一型正性光刻胶，通过旋涂形成厚度约为1.6微米的均匀薄膜。

然后将晶圆在热板上于100摄氏度预烘烤1分钟。将涂有光刻胶的晶圆装入掩模对准仪设备中。接着在405纳米波长下进行190毫焦每平方厘米的曝光，此时掩模对准仪将打开快门，使光通过带有设计图形的掩模照射到光刻胶上。

曝光后，将晶圆浸入盛有3 5 2显影液的玻璃皿中，轻轻振荡孵育30秒。然后用去离子水冲洗晶圆，并如前所述用氮气枪吹干。接着，将晶圆浸入盛有金蚀刻溶液的玻璃皿中，轻轻振荡孵育1.5分钟。

然后将晶圆转移至含有前述铬的玻璃皿中，并在轻微摇动下孵育，直至晶圆上的铬标记消失，此过程大约需要30秒。用去离子水冲洗晶圆，并用镊子夹住晶圆，用氮气枪吹干。

使用 MI 清洗程序去除光刻胶。然后用去离子水冲洗，并佩戴两层手套使用氮气枪吹干。将晶圆浸入装有 piranha 清洗液的聚四氟乙烯（Teflon）容器中，持续一分钟。

然后用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。接下来，为了制备铂电极图案，将晶圆装载到匀胶机上。用氮气枪吹去表面灰尘，使用移液枪在表面滴加PR2正性光刻胶，然后旋转以形成约1.4微米厚的均匀薄膜。

将晶圆置于100摄氏度的加热板上，预烘烤1分钟。预烘烤后，通过光掩模在405纳米波长下以30毫焦每平方厘米的剂量对晶圆进行曝光。然后将晶圆置于125摄氏度的加热板上，烘烤45秒。

取下掩模，进行准直和泛光曝光。在无光掩模的情况下，使用波长为405纳米、能量为1000毫焦每平方厘米的光照射晶圆。曝光后，将晶圆浸入盛有Z 400 K显影液（显影液与去离子水体积比为6:1）的玻璃皿中进行显影。

轻轻摇动，孵育两分钟。然后用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。使用电子束蒸发系统在晶圆上沉积一层400埃厚的钛，随后再沉积一层1600埃厚的铂。

将晶圆放入盛有丙酮的玻璃皿中，并将玻璃皿置于超声波清洗仪中清洗五分钟，以去除光刻胶。然后用镊子夹住晶圆，使用洗瓶用丙酮冲洗晶圆的两面，再用异丙醇冲洗。

用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。为制备检测通道的模具，采用MI Clean程序清洗一片空白的四英寸测试级质量硅晶圆。同前，用去离子水冲洗晶圆上的异丙醇，随后用氮气枪吹干。

将晶圆装在旋转涂布仪上，用氮气枪吹扫晶圆表面，并使用移液枪在表面滴加三层负性光刻胶（PR），以形成约100微米厚的均匀薄膜。将晶圆置于加热板上，采用两步加热程序进行预烘烤。首先，以每小时300摄氏度的升温速率，将温度从室温升至65摄氏度。

然后在 65 摄氏度下保持 10 分钟。以每小时 300 摄氏度的速率升至 95 摄氏度，随后保持 30 分钟。通过光掩模在 405 纳米波长下以 2,500 毫焦耳每平方厘米的剂量照射晶圆。

然后将晶圆放置在加热板上，以每小时300摄氏度的升温速率从室温升至95摄氏度，进行后烘烤，并在95摄氏度下保持10分钟。将晶圆浸入盛有丙二醇单甲醚醋酸酯（P-G-M-E-A）显影液的玻璃皿中，显影10分钟。

用异丙醇冲洗晶圆，并用氮气枪吹干，以制备检测通道。用铝箔将模具晶圆周围围成一个封闭区域，然后缓慢地将未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒入模具上。将带有PDMS的模具放入箱式炉中，采用两步烘烤程序进行固化：温度在5分钟内从室温升至80摄氏度，并在80摄氏度下保持17分钟。模具冷却后，将PDMS从模具上剥离，并放置于铝箔上。

使用手术刀切割检测芯片，并用穿刺活检打孔工具制备孔洞，如图所示。手动将PDMS检测通道与电化学芯片上的工作电极对齐。PDMS能很好地粘附在电化学芯片上，从而密封通道并防止泄漏。

使用短段柔性管作为适配器，将柔性管路连接至塑料弯头或直通接头，以实现垂直微通道的功能化。将含有单链DNA探针的注射器连接到管路上，并将其放入注射泵中。将接头连接至装置上各个完整的打孔入口。

该实验步骤中最困难的部分是在微通道中流动溶液时避免产生气泡。为确保成功，需非常缓慢地流动溶液。为实现通道的均匀填充，启动泵以每小时200微升的流速，缓慢地将三种不同的单链DNA探针孵育溶液分别注入三个独立的微通道中。孵育一小时后，更换注射器管路和连接头，用PBS冲洗微通道。随后再次更换注射器管路和连接头，将微通道填充入含有1毫摩尔六聚体CAPTO、1毫摩尔乙醇MCH、10毫摩尔PBS、100毫摩尔氯化钠和1.395毫摩尔TCEP的溶液，并孵育一小时。

然后使用镊子按照之前的方法用 PBS 清洗。将 PDMS 旋转 90 度至水平方向并取下，以暴露不同的反应腔室行，每行包含用于 DNA 杂交分析的独特对电极和参比电极。

更换注射器、管路和连接件，用对照测量溶液（即浓缩的福雷斯生理盐水柠檬酸钠缓冲液，SSC缓冲液）填充微通道，孵育20分钟。孵育结束后，更换注射器，用含5毫摩尔铁氰化物和5毫摩尔亚铁氰化物的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液填充微通道。随后，通过电化学阻抗谱（EIS）记录电化学系统在不同频率下的背景阻抗值：使用探针将电位仪连接至工作电极、对电极和参比电极，将EIS测量参数输入计算机软件，然后启动测量。

对微通道中的每个工作电极重复此测量，以检测每种非互补和互补的单链DNA靶标交换的DNA杂交情况。使用注射器管路和连接器，将含有1微摩尔目标单链DNA的4倍浓缩SSC缓冲液注入微通道，并孵育20分钟。

通过计算机上的软件启动电化学阻抗谱（EIS）测量，对每种目标单链DNA溶液进行测量，以验证生物芯片的电化学活性。在充满电活性氧化还原对——氰化物的微通道中进行遥测测量。此处显示的是九个工作电极的循环伏安遥测图。所有电极图谱具有相似的形状、峰高和峰分离度，表明该生物芯片具有高度可重复性，可有效检测DNA杂交事件。

通过测量三种单链DNA探针与其互补和非互补单链DNA靶标之间杂交事件所引起的电化学阻抗变化，评估了生物传感器的灵敏度。当引入互补的单链DNA靶标并与探针发生杂交时，相较于引入非互补单链DNA靶标，观察到更高的电荷转移电阻变化。向传感探针引入不同浓度的互补单链DNA靶标后，图中显示的是随着靶标单链DNA浓度递增（图中箭头所示）所获得的电化学阻抗谱奈奎斯特图。在较低频率（约15赫兹）下，随着靶标单链DNA浓度升高，阻抗值增加，这是由于双链DNA与铁氰化物/亚铁氰化物分子之间更强的排斥力所致。

总体而言，BIOCHIPS 展现出快速检测 DNA 杂交事件存在的能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何开发和制备用于检测 DNA 杂交事件的微流控电化学装置。在尝试该操作流程时，重要的是要记住优化各种生物传感参数，例如信噪比、稳定性和灵敏度。

还可以采用其他方法，例如引入序列略有不同的单链DNA靶标，以回答有关DNA突变组合与竞争等进一步的问题。请注意，操作微加工工艺溶液可能具有极高危险性，在进行此操作时，务必始终做好身体、眼睛和手部的防护。