Name: 微流体为基础的电化学生物芯片的无标记的DNA杂交分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学习基于微流控电化学生物芯片的无标记DNA杂交检测方法，利用电化学阻抗谱测量杂交事件引起的电荷转移电阻变化。该技术检测限达3.8 nM，适用于癌症研究和遗传疾病诊断。

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作者感谢 Robert W. Deutsch 基金会、国防威胁降低局（DTRA）以及国家科学基金会前沿研究与创新新兴计划（EFRI）提供的经费支持。作者同时感谢马里兰纳米中心及其制造实验室（Fablab）提供的洁净室设施支持。

1. 微流控芯片的微加工
<ol>
	<li>制备电化学芯片
	<ol>
		<li>图案化金电极
		<ol>
			<li>用丙酮、甲醇和异丙醇冲洗一片空白的4英寸硅片（优等品级）（“AMI”清洗法）。随后用去离子水（DI）冲洗硅片上的异丙醇，再用氮气吹干2 枪</li>
			<li>生长一层 1 µm 厚的 SiO2 使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备沉积钝化层。随后使用直流溅射设备沉积一层200 Å厚的铬，再沉积一层2,000 Å厚的金。</li>
			<li>旋涂“PR1”正性光刻胶（旋转参数：3,000 rpm，加速度 1,000 rpm/sec，时间 30 秒），形成约 1.6 µm 厚的均匀薄膜。将晶圆置于热板上，在 100 °C 下预烘 1 分钟。</li>
			<li>用 190 mJ/cm 的能量曝光晶圆2 在405 nm波长下通过光掩模曝光。将晶圆在352显影液中显影30秒，用去离子水冲洗，并用氮气吹干。2 枪</li>
			<li>用金刻蚀液刻蚀金1.5分钟。用铬刻蚀液刻蚀铬约30秒。用去离子水冲洗晶圆，并用氮气吹干。2 枪</li>
			<li>使用“AMI”清洗程序剥离光刻胶。 
			注意：强氧化剂，可能爆炸。</li>
			<li>用 4:1 的 H 清洁晶圆2SO4：H2O2 混合液（“Piranha”清洗）处理1分钟。用去离子水冲洗晶圆，并用氮气吹干2 枪</li>
		</ol>
		</li>
		<li>铂金图案电极
		<ol>
			<li>旋涂“PR2”正性光刻胶（旋涂参数：3,000 rpm，加速度 1,000 rpm/sec，30 秒），形成厚度约 1.4 µm 的均匀薄膜。在热板上于 100 °C 预烘 1 分钟。</li>
			<li>用 30 mJ/cm 的剂量曝光晶圆2 在405 nm波长下通过光掩模进行曝光。将晶圆在热板上于125 °C烘烤45秒。用1,000 mJ/cm²的光强对晶圆进行全域曝光。2 在405 nm波长下无光掩模曝光。将晶圆置于6:1 AZ400K显影液中显影2分钟，用去离子水冲洗晶圆，并用氮气吹干。2 枪</li>
			<li>使用电子束蒸发系统沉积一层400 Å厚的钛，随后沉积一层1,600 Å厚的铂。</li>
			<li>在超声波处理的丙酮浴中剥离光刻胶5分钟，随后用丙酮和异丙醇冲洗。用去离子水冲洗晶圆，并用氮气吹干2 枪</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备检测通道
	<ol>
		<li>准备用于检测通道的模具
		<ol>
			<li>用“AMI”洁净程序冲洗一片空白的4英寸硅片（测试级质量），然后用去离子水冲洗掉硅片上的异丙醇，再用氮气吹干2 枪</li>
			<li>以“PR3”负性光刻胶进行匀胶（两步旋涂参数：第一步——600 rpm，加速度120 rpm/sec，持续10秒；第二步——1,150 rpm，加速度383 rpm/sec，持续27秒），形成厚度约100 µm的均匀薄膜。将晶圆置于热板上进行前烘（两步烘烤参数：第一步——以300 °C/hr的升温速率从室温升至65 °C，并在此温度下保持10分钟；第二步——以300 °C/hr的升温速率升至95 °C，并在此温度下保持30分钟）。</li>
			<li>用 2,500 mJ/cm 照射晶圆2 在405 nm波长下通过光掩模进行曝光。将晶圆以300 °C/hr的升温速率升至95 °C，并在热板上保持该温度10分钟进行后烘。在丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）显影液中显影10分钟。用异丙醇冲洗晶圆，并用N₂吹干2 枪</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备检测通道
		<ol>
			<li>配制10:1的聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物（20 g弹性体，2 g固化剂），并在真空腔中完全脱气20分钟。</li>
			<li>用铝箔在模具晶圆周围围成一个围挡，然后缓慢地将未固化的PDMS倒在模具上。</li>
			<li>将带有PDMS的模具放入箱式炉中烘烤（两步烘烤参数：第一步——从室温在5分钟内升至80 °C；第二步——在80 °C下保持17分钟）。</li>
			<li>将PDMS从模具上剥离并置于铝箔上。使用外科手术刀切割检测芯片，并用活检打孔工具定义孔洞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组装设备
<ol>
	<li>手动将 PDMS 检测通道与电化学芯片上的工作电极对齐。PDMS 与电游戏副本贴合良好，可密封通道并防止泄漏。</li>
	<li>使用一段短的柔性管作为接头（外径 0.1875’’，内径 0.0625’’），将一根柔性管（外径 0.087’’，内径 0.015’’）连接至塑料弯头或直通接头。将接头分别连接至装置中打孔的各个入口。</li>
	<li>在管路的另一端连接一个注射器，并将注射器放入注射泵中。根据第 3 节中所需的实验步骤及其对应的溶液，交替更换注射器、管路和接头的组合。</li>
</ol>
3. 分析 DNA 杂交
注意：将每种溶液以 200 µl/hr 的流速缓慢引入通道，直至整个通道充满。
<ol>
	<li>用不同的ssDNA探针序列对每个垂直微通道进行功能化处理（对3个独立的垂直微通道并行操作）：
	<ol>
		<li>向每个微通道中加入不同的ssDNA探针孵育溶液（10 mM磷酸盐缓冲液，100 mM NaCl，10 µM三(2-羧乙基)膦（TCEP）和1 µM探针ssDNA），孵育1小时，随后用PBS冲洗微通道。</li>
		<li>向微通道中加入含有1 mM 6-巯基-1-己醇（MCH）的溶液（缓冲液组成为10 mM PBS、100 mM NaCl和1.395 mM TCEP），孵育1小时，随后用PBS冲洗微通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取下PDMS，将其旋转90°至水平方向并放置，以暴露包含独立行反应腔室的区域，每行均含有独立的对电极和参比电极（图S1）。</li>
	<li>向微通道中加入4倍浓缩的盐-柠檬酸钠（SSC）缓冲液作为对照测量溶液，并孵育20分钟。</li>
	<li>背景测量：向微通道中加入含5 mM铁氰化钾 / 5 mM亚铁氰化钾的PBS溶液，使用连接至工作电极、对电极和参比电极的电化学工作站记录不同频率下的阻抗值（电化学阻抗谱；EIS）（EIS参数：频率范围从1 MHz到0.1 Hz，每十倍频10个数据点，振幅25 mV，相对于参比电极施加5 mV偏压）。对微通道中的每个工作电极重复此测量。</li>
	<li>检测DNA杂交（对每种非互补和互补的ssDNA靶序列分别进行）。
	<ol>
		<li>向微通道中加入含1 µM靶ssDNA的4倍浓缩SSC缓冲液作为靶ssDNA测量溶液，孵育20分钟。按照步骤3.4测量DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的实验流程展示了基于微流控的电化学生物芯片的制备及其在DNA杂交事件分析中的应用。通过高产率的可控微加工工艺，我们开发出一种集成了微尺度通道与电化学传感器阵列的装置。我们采用迭代方法，为电化学芯片的光刻工艺以及微流控通道模具的加工参数制定了可控的处理方案。这些步骤为今后其他微型化分析装置的构建提供了指导。尤为重要的是，它们提供了一种优化多种生物传感参数（如信噪比、稳定性和灵敏度）的方法。在完成器件制备后，我们以单链DNA（ssDNA）探针对电化学传感器进行功能化修饰，作为生物识别元件，赋予其特定的分析功能。尽管这些实验流程表现出较低的器件失效率，但在器件组装后以及进行DNA杂交检测过程中，溶液泄漏仍是一个主要问题。对这类器件中键合失效问题的进一步研究，将有助于提高制备产率，并使其更适用于微流控生物系统的研究。
在我们的研究中，我们展示了生物芯片准确且特异性地检测DNA杂交事件的能力。作为新型分析微装置设计参数的一部分，应考虑装置的制造，这需要采用迭代方法来优化制备参数（例如，光刻参数、微通道尺寸、沉积金属的类型）。为了高效检测DNA杂交事件，还需优化单链DNA...

微流控芯片实验室（LOC）设备在临床诊断、环境监测和生物医学研究中具有诸多优势。这些设备利用微流控通道将流体输送到芯片的特定区域，在这些区域可进行多种操作，包括试剂混合、基于亲和力的结合、信号转导以及细胞培养1-4。与传统的临床诊断工具（如微孔板读数仪或电泳迁移率变动分析）相比，微流控技术具有多项优势。微流控设备执行类似检测所需的试剂用量减少2至3个数量级（纳升级而非微升级）。此外，由于物种在通道内受到更小空间的限制，某些生物事件的发生速度可得以加快5,6。第三，可通过光刻和蚀刻技术将传感器集成到微流控设备中，实现无标记检测。最后，这些设备生产成本低廉，操作时对技术人员的工作量要求也较低7-10。
无标记检测通常使用光学或电学换能器进行。由于光学器件对样品中分析物的干扰较低，因此可提供更优的传感性能。然而，当样品背景的共振波长与传感器相同时，其检测性能会受到影响。11在微流控系统中使用电信号进行生物和化学检测具有诸多优势。由于这类传感器通常仅需图案化的电极即可工作，其制备过程本质上更为简单。此外，电信号可直接与大多数测量设备连接，而其他类型的信号则可能需要通过换能器将信号进行转换。12-15. 电学传感器通常测量阻抗的变化16,17电容18，或氧化还原活性19然而，随着这些系统的微型化，新的挑战也随之出现。其中最重要的挑战包括：样品制备与流体混合（由于样品体积小且雷诺数低）、物理与化学效应（包括毛细作用力、表面粗糙度、构建材料与分析物之间的化学相互作用）、信噪比较低（由表面积和体积减小所致）20-23，以及复杂生物样本中电活性分析物可能产生的干扰（例如血液和唾液）。对这些效应的进一步研究将形成准确、可重复地制造和操作这些设备的指导规范，从而提升其整体性能。
DNA杂交检测被广泛用于诊断遗传性疾病24,25和多种癌症26。每年，临床患者中多种流感病毒株的鉴定均依赖于DNA杂交技术所得结果27。仅流感病毒在美国每年就导致约36,000人死亡28。上述应用若能采用一种可在实验台上操作的微流控装置，以低样本量、低成本实现与酶标仪或凝胶迁移实验相当的检测灵敏度与特异性，将大为受益。由于无标记电化学传感具有诸多优势，其已被广泛应用于DNA杂交事件的检测29,30。通过将宏观尺度电极（毫米量级）浸入盛有待测溶液的烧杯中，该方法可提供单链DNA序列与其互补序列结合动力学的高灵敏度数据。近年来，在微流控系统中集成电化学传感以检测DNA杂交方面已取得若干进展。已有研究探讨了微流控通道内DNA杂交动力学31以及传感器的集成检测应用15。然而，目前仍亟需一种能够并行分析DNA杂交事件、无需复杂样品前处理步骤的快速高通量微流控装置。
本研究中介绍的装置提供了一个可并行筛选多种相互作用且无需复杂样品前处理步骤的平台。我们的实验方案描述了如何采用微机电系统（MEMS）技术32,33对基于微流控的电化学生物芯片进行微加工制造。我们详细阐述了由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流控芯片以及包含电极阵列的电化学芯片的制备过程。同时，本文还介绍了利用单链DNA（ssDNA）探针对生物芯片进行化学功能化的方法。最后，验证了该生物传感器特异性检测和分析单链DNA靶标的性能。总体而言，基于微流控的电化学生物芯片是一种快速、高通量的分析技术，可用于研究生物分子与导电换能器之间的相互作用，并适用于多种芯片实验室（lab-on-a-chip）应用。

<table><tbody><tr><td>4'' 硅片</td><td>Ultrasil</td><td>4-5664</td><td>单面抛光；P型；硼掺杂；晶向1-0-0；厚度500微米；电阻率10-20欧姆&amp;middot;cm</td></tr><tr><td>Shipley 1813 光刻胶（&quot;PR1&quot;）</td><td>Microchem</td><td></td><td>正性光刻胶</td></tr><tr><td>AZ5214 光刻胶（&quot;PR2&quot;）</td><td>Hoechst Celanse</td><td></td><td>正性光刻胶</td></tr><tr><td>SU-8 50 光刻胶（&quot;PR3&quot;）</td><td>Microchem</td><td></td><td>负性光刻胶</td></tr><tr><td>金刻蚀液</td><td>Transene</td><td>TFA</td><td>无需稀释</td></tr><tr><td>铬刻蚀液</td><td>Transene</td><td>1020AC</td><td>无需稀释</td></tr><tr><td>PDMS 弹性体</td><td>Dow Corning</td><td>3097366 1004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 固化剂</td><td>Dow Corning</td><td>3097358 1004</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔工具</td><td>Healthlink</td><td>BP20</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 柔性管</td><td>Cole Parmer&amp;nbsp;</td><td>R 3603</td><td>0.015&quot;</td></tr><tr><td>Tygon 柔性接头</td><td>Cole Parmer&amp;nbsp;</td><td>06417-41</td><td>0.0625&quot;</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>一碱磷酸钾</td><td>Fluka</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>无水二碱磷酸钾</td><td>Sigma</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦</td><td>Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>6-巯基-1-己醇</td><td>Aldrich</td><td>451088</td><td></td></tr><tr><td>20倍浓缩的氯化钠-柠檬酸钠缓冲液</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>六氰合铁(III)酸钾</td><td>Aldrich</td><td>455946</td><td></td></tr><tr><td>互补单链DNA #1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-GGGACGTCCACGGAGCGCTA&lt;br/&gt; TCGGAGCTTT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>靶向单链DNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA&lt;br/&gt; ATCGATGAGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>互补单链DNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-ACTCATCGATTCGTCAATGA&lt;br/&gt; CCTGACCCGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>靶向单链DNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA&lt;br/&gt; CCCATGATGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>互补单链DNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA 寡核苷酸</td><td>5&amp;rsquo;-TCATCATGGGTCTAACTACT&lt;br/&gt; GGATCTAGGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>等离子体增强化学气相沉积（PECVD）</td><td>Oxford Instruments</td><td>PlasmaLab System 100</td><td>腔室压力1,000 mTorr，温度200 &amp;#176;C，射频功率20 W，气体：a) N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 流速710 sccm；b) 5% SiH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 混合气体流速170 sccm，SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 生长速率690 &amp;#197;/min。</td></tr><tr><td>直流溅射设备</td><td>AJA International</td><td>ATC 1800-V</td><td>铬溅射参数：腔室压力10 mTorr，氩气流速20 sccm，施加直流功率200 W，溅射速率10 nm/min。金溅射参数：腔室压力10 mTorr，氩气流速20 sccm，施加直流功率200 W，溅射速率36 nm/min。</td></tr><tr><td>电子束蒸发系统</td><td>Denton</td><td>定制</td><td>钛蒸发参数：腔室压力 &amp;lt; 2 × 10&lt;sup&gt;-6&lt;/sup&gt; Torr，电子枪供电功率7.5 kW，灯丝电流150-200 mA，蒸发速率6-10 &amp;#197;/秒。铂蒸发参数：腔室压力 &amp;lt; 2 × 10&lt;sup&gt;-6&lt;/sup&gt; Torr，电子枪供电功率7.5 kW，灯丝电流150-200 mA，蒸发速率2-3 &amp;#197;/秒。</td></tr><tr><td>电化学工作站</td><td>CH Instruments</td><td>660D</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS230</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记dna杂交分析

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

将分析用台式实验流程微型化至微米尺度，可在反应时间、成本以及前处理步骤的集成方面带来显著优势。利用此类设备分析DNA杂交事件具有重要意义，因为它提供了一种可在多种疾病即时检测（point-of-care）场景下实时评估生物标志物的技术。然而，当设备尺寸减小时，多种物理效应的影响随之增强，这些效应会影响设备的加工精度和运行可靠性。因此，亟需以可重复的方式精确制造并操作这些设备，以提升整体性能。本文中，我们描述了用于制造和操作基于微流控的电化学生物芯片以实现DNA杂交事件精确分析的实验方案与方法。该生物芯片由两部分组成：一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的含有三条平行微通道的微流控芯片，以及一个3×3阵列的电化学微芯片。DNA杂交事件通过电化学阻抗谱（EIS）分析进行检测。EIS分析能够监测在该尺度下占主导地位的电化学系统特性的变化。通过该生物传感器对电荷转移电阻和扩散电阻变化的监测能力，我们验证了对互补单链DNA（ssDNA）目标序列的选择性，计算出检测限为3.8 nM，并在孵育20分钟&#160;后观察到与其他非互补ssDNA存在13%的交叉反应性。该方法可通过阐明微尺度下扩散行为的规律，并实现对DNA杂交事件的研究，从而提升微型化设备的性能。

实验装置的可控且精确的制造工艺在研究中至关重要。它使研究人员能够获得可重复且高通量的实验结果。本文展示了一种基于微流控的电化学生物芯片的高产率、高重复性微加工工艺（图1）。该工艺失败率低，仅有极少数器件出现键合问题导致溶液泄漏。为了验证生物芯片的电化学活性，在微通道中填充电活性氧化还原对铁氰化物/亚铁氰化物后进行循环伏安法测量。图2展示了芯片上九个不同工作电极的可重复电化学响应。这些结果表明，生物芯片的九个腔室中电化学活性一致，可实现高通量测量。
大多数DNA杂交传感器将单链DNA（ssDNA）探针固定在传感器表面。由于金常被用于微流控器件中传感电极的图案化，巯基（thiols）是与传感器表面形成强共价键的良好候选基团34。一种常见的偶联技术是在单链DNA的一端添加一个功能性的巯基（-SH）基团。S-S二硫键可保护游离巯基免于氧化，直到其准备使用为止。一旦通过加入三(2-羧乙基)膦（TCEP）将二硫键还原，游离的巯基（-SH）即可与金表面结合，从而将DNA固定在金表面。若不使用TCEP，单链D...

我们介绍一种基于微流控技术的电化学生物芯片，用于检测DNA杂交。在单链DNA探针功能化之后，通过互补和非互补的单链DNA靶标研究其特异性、灵敏度和检测限。结果表明DNA杂交事件对电化学系统的影响，检测限为3.8 nM。

一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记DNA杂交分析

将分析实验台操作微型化至微尺度，在反应时间、成本和集成性方面具有显著优势……

以下实验的总体目标是利用微流控电化学装置，观察DNA杂交事件对阻抗谱的影响。为此，制备一种电化学芯片，以实现电极传感器阵列，并制备一种微流控PDMS芯片。为便于引入微量样品，将两种芯片键合在一起，并用单链DNA探针进行功能化修饰。随后加入靶向单链DNA进行DNA杂交，由于带负电荷的双链DNA与带负电荷的铁氰化物分子之间产生更强的排斥力，导致电荷转移电阻升高。最终，通过测量电化学阻抗谱的变化即可检测DNA杂交事件。该技术相较于现有方法（如使用酶标仪或J shift分析）的主要优势在于，能够在不牺牲灵敏度和特异性的前提下，以更小的样品体积和更低的成本实现相同检测效果。该方法可通过快速特异性DNA序列筛选以及单链DNA序列的二元动力学研究，帮助回答癌症研究、流感检测和基因工程中的关键问题。由于这种快速高通量DNA杂交分析方法能够在低样本量条件下进行，且无需复杂的样本前处理步骤，因此该技术的应用可延伸至遗传性疾病、多种癌症或具有特定DNA标志物（如流感）等疾病的诊断。通常，初次接触该方法的研究人员会面临一定困难，因为微装置的开发需要精确控制加工参数，并采用迭代方式来解决溶液泄漏等问题。组装设备后，将金电极图案化到电化学芯片上：用镊子夹住一片空白的优等四级四英寸硅片，使用洗瓶依次用丙酮、甲醇和异丙醇冲洗硅片两面。此过程在此后称为在去离子水流下进行的 A MI 清洗。用去离子水冲洗掉硅片上的异丙醇，然后使用氮气枪吹干硅片。将晶圆装入等离子体增强化学气相沉积（P-E-C-V-D）设备中。输入参数，使生成一层厚度为1微米的二氧化硅钝化层，并启动自动化程序。接下来，使用直流溅射设备在晶圆表面沉积一层厚度为200埃的铬层，然后沉积一层厚度为2000埃的金层。将晶圆装载到匀胶机上，用氮气枪吹扫表面灰尘，并使用移液器滴加Spin PR一型正性光刻胶，通过旋涂形成厚度约为1.6微米的均匀薄膜。然后将晶圆在热板上于100摄氏度预烘烤1分钟。将涂有光刻胶的晶圆装入掩模对准仪设备中。接着在405纳米波长下进行190毫焦每平方厘米的曝光，此时掩模对准仪将打开快门，使光通过带有设计图形的掩模照射到光刻胶上。曝光后，将晶圆浸入盛有3 5 2显影液的玻璃皿中，轻轻振荡孵育30秒。然后用去离子水冲洗晶圆，并如前所述用氮气枪吹干。接着，将晶圆浸入盛有金蚀刻溶液的玻璃皿中，轻轻振荡孵育1.5分钟。然后将晶圆转移至含有前述铬的玻璃皿中，并在轻微摇动下孵育，直至晶圆上的铬标记消失，此过程大约需要30秒。用去离子水冲洗晶圆，并用镊子夹住晶圆，用氮气枪吹干。使用 MI 清洗程序去除光刻胶。然后用去离子水冲洗，并佩戴两层手套使用氮气枪吹干。将晶圆浸入装有 piranha 清洗液的聚四氟乙烯（Teflon）容器中，持续一分钟。然后用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。接下来，为了制备铂电极图案，将晶圆装载到匀胶机上。用氮气枪吹去表面灰尘，使用移液枪在表面滴加PR2正性光刻胶，然后旋转以形成约1.4微米厚的均匀薄膜。将晶圆置于100摄氏度的加热板上，预烘烤1分钟。预烘烤后，通过光掩模在405纳米波长下以30毫焦每平方厘米的剂量对晶圆进行曝光。然后将晶圆置于125摄氏度的加热板上，烘烤45秒。取下掩模，进行准直和泛光曝光。在无光掩模的情况下，使用波长为405纳米、能量为1000毫焦每平方厘米的光照射晶圆。曝光后，将晶圆浸入盛有Z 400 K显影液（显影液与去离子水体积比为6:1）的玻璃皿中进行显影。轻轻摇动，孵育两分钟。然后用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。使用电子束蒸发系统在晶圆上沉积一层400埃厚的钛，随后再沉积一层1600埃厚的铂。将晶圆放入盛有丙酮的玻璃皿中，并将玻璃皿置于超声波清洗仪中清洗五分钟，以去除光刻胶。然后用镊子夹住晶圆，使用洗瓶用丙酮冲洗晶圆的两面，再用异丙醇冲洗。用去离子水冲洗晶圆，并用氮气枪吹干。为制备检测通道的模具，采用MI Clean程序清洗一片空白的四英寸测试级质量硅晶圆。同前，用去离子水冲洗晶圆上的异丙醇，随后用氮气枪吹干。将晶圆装在旋转涂布仪上，用氮气枪吹扫晶圆表面，并使用移液枪在表面滴加三层负性光刻胶（PR），以形成约100微米厚的均匀薄膜。将晶圆置于加热板上，采用两步加热程序进行预烘烤。首先，以每小时300摄氏度的升温速率，将温度从室温升至65摄氏度。然后在 65 摄氏度下保持 10 分钟。以每小时 300 摄氏度的速率升至 95 摄氏度，随后保持 30 分钟。通过光掩模在 405 纳米波长下以 2,500 毫焦耳每平方厘米的剂量照射晶圆。然后将晶圆放置在加热板上，以每小时300摄氏度的升温速率从室温升至95摄氏度，进行后烘烤，并在95摄氏度下保持10分钟。将晶圆浸入盛有丙二醇单甲醚醋酸酯（P-G-M-E-A）显影液的玻璃皿中，显影10分钟。用异丙醇冲洗晶圆，并用氮气枪吹干，以制备检测通道。用铝箔将模具晶圆周围围成一个封闭区域，然后缓慢地将未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒入模具上。将带有PDMS的模具放入箱式炉中，采用两步烘烤程序进行固化：温度在5分钟内从室温升至80摄氏度，并在80摄氏度下保持17分钟。模具冷却后，将PDMS从模具上剥离，并放置于铝箔上。使用手术刀切割检测芯片，并用穿刺活检打孔工具制备孔洞，如图所示。手动将PDMS检测通道与电化学芯片上的工作电极对齐。PDMS能很好地粘附在电化学芯片上，从而密封通道并防止泄漏。使用短段柔性管作为适配器，将柔性管路连接至塑料弯头或直通接头，以实现垂直微通道的功能化。将含有单链DNA探针的注射器连接到管路上，并将其放入注射泵中。将接头连接至装置上各个完整的打孔入口。该实验步骤中最困难的部分是在微通道中流动溶液时避免产生气泡。为确保成功，需非常缓慢地流动溶液。为实现通道的均匀填充，启动泵以每小时200微升的流速，缓慢地将三种不同的单链DNA探针孵育溶液分别注入三个独立的微通道中。孵育一小时后，更换注射器管路和连接头，用PBS冲洗微通道。随后再次更换注射器管路和连接头，将微通道填充入含有1毫摩尔六聚体CAPTO、1毫摩尔乙醇MCH、10毫摩尔PBS、100毫摩尔氯化钠和1.395毫摩尔TCEP的溶液，并孵育一小时。然后使用镊子按照之前的方法用 PBS 清洗。将 PDMS 旋转 90 度至水平方向并取下，以暴露不同的反应腔室行，每行包含用于 DNA 杂交分析的独特对电极和参比电极。更换注射器、管路和连接件，用对照测量溶液（即浓缩的福雷斯生理盐水柠檬酸钠缓冲液，SSC缓冲液）填充微通道，孵育20分钟。孵育结束后，更换注射器，用含5毫摩尔铁氰化物和5毫摩尔亚铁氰化物的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液填充微通道。随后，通过电化学阻抗谱（EIS）记录电化学系统在不同频率下的背景阻抗值：使用探针将电位仪连接至工作电极、对电极和参比电极，将EIS测量参数输入计算机软件，然后启动测量。对微通道中的每个工作电极重复此测量，以检测每种非互补和互补的单链DNA靶标交换的DNA杂交情况。使用注射器管路和连接器，将含有1微摩尔目标单链DNA的4倍浓缩SSC缓冲液注入微通道，并孵育20分钟。通过计算机上的软件启动电化学阻抗谱（EIS）测量，对每种目标单链DNA溶液进行测量，以验证生物芯片的电化学活性。在充满电活性氧化还原对——氰化物的微通道中进行遥测测量。此处显示的是九个工作电极的循环伏安遥测图。所有电极图谱具有相似的形状、峰高和峰分离度，表明该生物芯片具有高度可重复性，可有效检测DNA杂交事件。通过测量三种单链DNA探针与其互补和非互补单链DNA靶标之间杂交事件所引起的电化学阻抗变化，评估了生物传感器的灵敏度。当引入互补的单链DNA靶标并与探针发生杂交时，相较于引入非互补单链DNA靶标，观察到更高的电荷转移电阻变化。向传感探针引入不同浓度的互补单链DNA靶标后，图中显示的是随着靶标单链DNA浓度递增（图中箭头所示）所获得的电化学阻抗谱奈奎斯特图。在较低频率（约15赫兹）下，随着靶标单链DNA浓度升高，阻抗值增加，这是由于双链DNA与铁氰化物/亚铁氰化物分子之间更强的排斥力所致。总体而言，BIOCHIPS 展现出快速检测 DNA 杂交事件存在的能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何开发和制备用于检测 DNA 杂交事件的微流控电化学装置。在尝试该操作流程时，重要的是要记住优化各种生物传感参数，例如信噪比、稳定性和灵敏度。还可以采用其他方法，例如引入序列略有不同的单链DNA靶标，以回答有关DNA突变组合与竞争等进一步的问题。请注意，操作微加工工艺溶液可能具有极高危险性，在进行此操作时，务必始终做好身体、眼睛和手部的防护。

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