在小鼠睾丸活体显微注射和电穿孔

本文介绍了显微注射和小鼠睾丸中电在体内的睾丸小鼠细胞转染技术，研究精子的独特工艺。所提出的方案涉及以下步骤：玻璃毛细管制备，经由输出管显微注射，并通过电穿孔转染。

该程序的目的是将基因构建体显微注射到小鼠睾丸中，然后进行 InVivo 电穿孔。这允许进行全面的基因分析，重点是精子发生和睾丸功能。这是通过首先通过 PrepU 腺体正上方的腹部切口进入睾丸来实现的。

第二步是通过从脂肪组织中释放血管来准备睾丸附着的传出管进行显微注射。接下来，用加载的显微注射移液管穿刺耳鼻喉导管，并将染色基因构建体溶液施用到睾丸铁小管。最后一步是睾丸的多侧电穿孔转染。

最终，在三天后提取转染的睾丸，以便根据所利用的报道基因构建体通过荧光显微镜或光度计测量来评估转染。这种用于小鼠睾丸的显微注射智能作技术作为瞬时转染方法的组合肯定会比现有方法（如转基因动物或敲除小鼠）提供许多优势。它确保了快速的性能、低成本，并且只需要适度的技术技能。

这种方法有望明智地利用男性生育研究领域的可用技术。它可能对解决有关实验生殖器和生育过程的广泛问题至关重要。当使用这种方法以获得所有功能丧失实验的形式进行遗传分析时，这将特别可能。

据推测，它对于研究例如精子发生特异性基因的调控元件也非常有用。要开始该程序，用 10% 氯胺酮和 2% 甲苯噻嗪的一对一混合物皮下麻醉 6 至 8 周龄的雄性小鼠。然后通过捏脚趾确保鼠标处于深度麻醉状态。

在它的眼睛上涂抹药膏以防止干燥。接下来，用电动剃须刀去除腹毛，然后对手术区域进行消毒。在腹部中央的 PrepU 腺体正上方做一个腹侧切口。

为此，拉动皮肤并进行小的横向皮肤切割。然后继续沿着腹部肌肉层。小心地拉起腹部脂肪垫，露出附着的睾丸，并将其放在腹部的无菌纸上。

随后，使用立体显微镜找到用于显微注射的耳鼻喉导管。它是睾丸和附睾之间的细血管交界处，位于睾丸动脉附近。用细镊子去除覆盖耳鼻喉导管的脂肪组织。

之后，将释放导管放在无菌纸条上，确保导管容易看到而不会损害周围环境。进一步，将之前已加载有色质粒溶液的显微注射移液管连接到显微纵器注射器单元。之后，将微型注射针平行于 EENT 导管放置，尖端指向 REIT 睾丸。

然后使用细镊子将管道剥离在显微注射移液管上。确保移液器在拉过来时与管道保持平行。小心地将针头对准睾丸，并在它直接穿透白膜下方的 REIT 睾丸时停止。

接下来，设置微型喷油器的参数。随后，开始注射基因构建体溶液。通过观察睾丸充盈状态来监控整个注射过程。

在有色质粒溶液的帮助下，构建睾丸最多只有其体积的三分之二。实现有效的电穿孔。将镊子电极浸泡在一次 PBS 中，以确保足够的电导。

然后将测试物稍微挤压在湿电极之间，并用 electro parata 测量电阻。接下来，充分设置电信号，确保电流可以以总共 8 个方形脉冲施加到睾丸。在四个不同的睾丸部位，对整个睾丸进行全面电穿孔。

电穿孔完成后，将睾丸放回腹部，尽可能靠近其原始位置。所以内肌层是可吸收的手术缝合线。然后用缝合夹闭合皮肤。

让鼠标从麻醉中恢复。在一个无菌盒子里，用 37 摄氏度的加热垫加热，用一些纸巾准备。垫应确保仅加热笼子的一半，从而产生热量梯度。

此外，用另一张纸巾盖住鼠标以进一步减轻压力。动物完全醒来后，将其转移到一个新的干净、设备齐全的笼子里。但要进一步恢复，请监控恢复过程，直到您最终将鼠标送回动物设施。

该图显示了整个 Mount 睾丸在体内电穿孔后 3 天通过荧光检测，转染的 C 57 黑色六小鼠的睾丸显示增强的绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。以下是睾丸的组织学切片。用 PE EEG、FPC one 单侧电穿孔 3 天后，转染的生精管状细胞用绿色荧光及其典型的球形组织结构表示。

他们的细胞核用蓝色的 2 个 pro 3 复染。当您执行此程序时，重要的是要记住识别耳鼻喉导管及其脂肪组织释放的过程非常复杂。因此，在完成真正的体内体验之前，您可以先在死去的动物上练习。

在微注射电穿孔和最终测试收获的反程序之后，可以进行许多技术，如 Q-R-T-P-C-R ship 和 Western blotting。因此，测试基因的 xining 是蛋白质表达模式以及翻译后修饰是理所当然的。因此，通过这些工具，各种各样的主题可能会受到攻击，例如精子发生，及其潜在的复杂机制和调节。