小鼠B淋巴细胞染色体畸变的PNA-FISH快速分析

以下实验的总体目标是定量小鼠B淋巴细胞中的基因组不稳定性。首先通过分离B细胞进行原代细胞培养，随后固定细胞，以制备中期染色体铺展样本。

最后，进行端粒PNA荧光原位杂交以可视化荧光标记的端粒。最终，可通过荧光显微镜定量分析各类染色体畸变的水平。该技术的应用可拓展我们对DNA修复通路的理解，因为它有助于鉴定在目标小鼠模型中促进基因组稳定性的基因。

尽管该方法可用于研究染色体断裂及其他大型染色体重排，但也可经调整用于检测其他形式的基因组不稳定性，例如易位。分离B细胞时，首先在超净工作台中将新鲜分离的脾脏置于含有2毫升洗涤缓冲液的35毫米组织培养皿中。然后使用5毫升注射器的推杆末端轻轻研磨脾脏。

接下来，使用活塞将组织匀浆液通过70微米尼龙滤网过滤至50毫升离心管中，轻轻按压较大的组织块使其通过滤网。用8毫升洗涤缓冲液冲洗培养板和注射器，并将洗涤液一并通过滤网过滤。随后离心收集细胞，再用3毫升CK裂解缓冲液反复吹打沉淀数次。

五分钟后，加入10毫升洗涤缓冲液以终止反应。然后再次离心细胞，轻敲管底使沉淀重悬，并向细胞中加入1毫升洗涤缓冲液。接着，将细胞与50微升抗CD43 Max微珠在冰上孵育。

30分钟后，用10毫升洗涤缓冲液轻柔地洗涤细胞。在离心过程中，将一个minimax柱置于磁铁上，并在柱下方放置一个已标记的15毫升锥形管。然后向柱中加入1毫升洗涤缓冲液，收集流出液于管中。

将细胞沉淀重悬于1毫升洗涤缓冲液中，然后将细胞上样至层析柱。待样品完全流过柱子后，用1毫升洗涤缓冲液冲洗柱子，并向收集的样品中直接加入7毫升洗涤缓冲液。计数收集的细胞后，将其转移至50毫升离心管中进行离心。随后，为激活B细胞，将细胞沉淀以每毫升含1×10⁶个细胞的密度重悬于添加补剂的B细胞培养基中，并将细胞接种于6孔板，每孔5毫升，在37°C、5% CO₂的加湿细胞培养孵箱中孵育以活化B细胞。

随后向每个孔中加入50 µL的smid。在37°C孵育1小时后，将B细胞转移至已标记的15 mL离心管中。用胶带覆盖标签，并离心收集细胞。

然后吸除上清液，仅保留约1毫升，通过移液吹打重悬沉淀。逐滴加入5毫升37摄氏度的氯化钾溶液，同时在涡旋振荡器上脉冲振荡。随后再加入额外的10毫升氯化钾溶液，通过倒置混匀细胞悬液。

接下来，将细胞置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。然后加入五滴新鲜固定液，通过反复颠倒混匀。再次悬浮沉淀于1毫升上清液中后，于涡旋振荡的同时逐滴加入5毫升新鲜固定液，混匀后离心沉淀细胞，并将细胞在额外10毫升固定液中室温孵育。

30分钟后，离心收集细胞，并除去上清液，仅保留1毫升固定液。随后用15毫升固定液将细胞洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于70微升上清液中。现在将标记好的载玻片以35度角放置于湿度控制在52%、温度设定为22.9摄氏度的湿盒中。

每张载玻片上滴加 35 微升重悬的 B 细胞，每个样本准备两张载玻片。在湿盒中静置干燥 30 分钟后，将载玻片置于载玻片盒中，在 37 摄氏度下保存直至完全干燥。干燥后，使用金刚石笔在每张载玻片背面标记一个 18 毫米 × 18 毫米的区域，用于后续 FISH 实验中的杂交和变性步骤。

接下来，将120微升70%的去离子甲酰胺溶液加到24毫米×60毫米的盖玻片上，然后将每张载玻片与盖玻片接触。在80°C的加热板上使载玻片变性90秒，然后迅速而小心地依次将盖玻片滑落。将载玻片依次放入冰浴的70%、90%和100%乙醇中，各浸泡3分钟。待载玻片干燥后，将其放入湿盒中，并在载玻片的标记区域加入预杂交探针混合液。

用 18 × 18 毫米的盖玻片覆盖探针混合液，将载玻片在 37 °C 下孵育 1 小时。随后在预热的 2×SSC 缓冲液中振荡洗涤载玻片。5 分钟后，向载玻片上滴加 35 µL 的莫耶尔封片剂。

用 24 毫米 × 60 毫米的盖玻片覆盖培养基，并将载玻片置于 4°C 保存。最后，使用标准的落射荧光显微镜分析中期载玻片。源自一只小鼠细胞的中期染色体应形成一个包含 40 条染色体的独立簇。

每条染色体一端有一个着丝粒，靠近两个端粒信号，而在染色体的另一端还有另外两个端粒信号。染色单体断裂是指构成每条中期染色体的两条姐妹染色单体中其中一条发生断裂。在某些情况下，可在同一中期分裂相中观察到染色体断裂末端形成的带有端粒信号的片段。

放射性染色体是涉及两条染色体的复杂重排。染色体还可能连接在一起形成双着丝粒染色体，表现为两条染色体首尾融合，且两端均含有着丝粒。罗伯逊易位是一种发生在两条染色体着丝粒之间的易位，表现为四条姐妹染色单体臂连接于同一个着丝粒上。

在最后一张图像中，显示了一个没有端粒信号的中期分裂相。端粒信号的缺失可能是由于探针制备过程中的错误，或杂交过程中盖玻片下存在气泡所致。完成此操作后，还可采用其他方法，如细胞周期分析和染色体信息分析，以回答更多问题，例如基因组不稳定性增加是否会影响细胞活力。