Name: 在小鼠B淋巴细胞染色体畸变所PNA-FISH快速分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习使用PNA-FISH技术在小鼠B淋巴细胞中定量分析染色体畸变，通过荧光显微镜观察端粒信号以评估基因组不稳定性。该方法有助于深入理解DNA修复通路在维持基因组稳定性中的作用机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R00 CA160574（SFB）以及罗格斯大学生物技术培训项目奖学金（授予SMM）支持。

该实验程序已获得新泽西州立罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。小鼠的处理遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》。科研人员应咨询本国及本机构的动物管理组织，以获取已确立并获批准的指导原则。
开始之前，准备好表1中列出的溶液。
1. B细胞的分离与激活
使用 CO2 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。将小鼠置于体侧向左的位置，用70%乙醇喷洒小鼠直至毛发湿润。解剖取出脾脏，并置于含2 ml洗涤缓冲液的35 mm组织培养皿中。在超净工作台内，用5 ml注射器的平头端轻轻研磨组织培养皿中的脾脏，使其分散。
<ol>
	<li>将70 μm尼龙滤网插入50 ml离心管中，并将2 ml洗涤缓冲液中的脾脏样本转移至尼龙滤网上。使用注射器的平头端轻轻研磨滤网中的脾脏组织以使其充分分散。</li>
	<li>用8 ml洗涤缓冲液冲洗注射器背面和35 mm培养皿，并将液体通过70 μm尼龙滤网过滤。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除并弃去上清液，将沉淀重悬于3 ml ACK裂解缓冲液中。轻轻吹打数次以分散细胞团块，室温孵育5分钟。加入10 ml洗涤缓冲液，再次在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸除并弃去上清液，通过轻弹管底使沉淀松散，随后加入1 ml洗涤缓冲液并用移液器吹打混匀。加入50 μl抗CD43 MACS磁珠，冰上孵育30分钟。加入10 ml洗涤缓冲液，轻轻混匀后在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。再次加入10 ml洗涤缓冲液，轻轻混匀，于4 °C条件下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>将Mini-MACS柱置于MACS磁铁上以组装分离装置，在柱下方放置一个标记好的15 ml尖底离心管。向柱中加入1 ml洗涤缓冲液，使其自然流过并收集至15 ml管中。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml洗涤缓冲液中。待洗涤缓冲液完全流尽后，将细胞悬液加载至Mini-MACS柱中。</li>
	<li>待样品完全通过色谱柱后，加入1 ml洗涤缓冲液洗涤柱子。同时，向15 ml收集管中的流出液直接加入7 ml洗涤缓冲液。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据需要取足够体积的细胞悬液，使每孔含有5,000,000个细胞，并转移至50 ml离心管中。在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。在B细胞培养基中添加LPS（1:500）和IL-4（1:1,000）。</li>
	<li>吸除上清液，加入适量已补充因子的B细胞培养基，调整细胞终浓度为1,000,000个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞以每孔5 ml、浓度为1,000,000个细胞/ml接种于6孔板中，置于37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中培养。</li>
</ol>
2. B细胞固定
<ol>
	<li>向含有 5 ml B 细胞的培养孔中加入 50 μl 秋水仙胺（终浓度为 100 ng/ml），在 37 °C 下孵育 1 小时。将 75 mM KCl 溶液在 37 °C 水浴中预热。将 B 细胞转移至已标记的 15 ml 离心管中。用胶带覆盖标签，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过移液重悬沉淀。逐滴加入 5 ml 预热的 KCl 溶液，同时轻敲或脉冲式涡旋振荡。</li>
	<li>加入 10 ml KCl 溶液，通过倒置混匀。在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。加入 5 滴新鲜固定液，通过倒置混匀。在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过反复吹打重悬沉淀。</li>
	<li>逐滴加入 5 ml 新鲜固定液，同时轻敲或脉冲式涡旋振荡。再加入 10 ml 固定液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 1 ml 液体于管中，通过移液重悬沉淀。加入 14 ml 新鲜固定液，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 2.7 两次。</li>
	<li>加入 14 ml 新鲜固定液。用 Parafilm 封口膜密封管盖，并在 -20 °C 下过夜保存。</li>
</ol>
3. 中期染色体铺片的制备
<ol>
	<li>将可控环境室设置为22.9 °C和52%湿度。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心固定后的B细胞10分钟。吸除固定液，保留70 μl于管中，通过移液重悬细胞。</li>
	<li>将标记好的载玻片以35°角放置于湿盒中。每张载玻片上滴加35 μl重悬的B细胞，每个样本滴加两张载玻片。在湿盒中静置干燥30分钟，然后将载玻片放入载玻片盒中，并在37 °C下保存。</li>
</ol>
4. 端粒PNA荧光原位杂交
<ol>
	<li>探针制备
	<ol>
		<li>将去离子甲酰胺预热至 37 °C。取 2 μl 端粒 PNA 探针与 7 μl 预热的去离子甲酰胺混合，于 37 °C 振荡孵育 1 小时。</li>
		<li>将 FISH 主混合液预热至 37 °C。向步骤 4.1.1 的混合物中加入 7 μl 预热的 FISH 主混合液，于 37 °C 孵育 1–3 小时。</li>
		<li>在 80 °C 下变性探针混合物 8 分钟。随后于 37 °C 预退火 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色体玻片预处理
	<ol>
		<li>将含有 50 ml 0.01 M HCl 的玻璃玻片染色缸置于水浴中，预热至 37 °C。</li>
		<li>将玻片放入另一含有 2x SSC 的玻璃玻片染色缸中，室温下处理 5 分钟。</li>
		<li>向已预热的玻璃玻片染色缸中加入 2 μl 胃蛋白酶储备液，通过倒置混匀。将玻片转移至该染色缸中，于 37 °C 孵育 90 秒。</li>
		<li>将玻片在另一含有 1x PBS 的玻璃玻片染色缸中洗涤 2 次，每次 5 分钟，室温振荡。随后在含有 1x PBS/MgCl2 的染色缸中室温振荡洗涤 5 分钟。</li>
		<li>将玻片转移至含有新鲜配制的 1% 甲醛/1x PBS/MgCl2 的玻璃玻片染色缸中，室温处理 10 分钟。</li>
		<li>将玻片在另一含有 1x PBS 的玻璃玻片染色缸中室温振荡洗涤 5 分钟。</li>
		<li>准备乙醇脱水系列：分别准备含有 70%、90% 和 100% 乙醇的独立玻璃玻片染色缸。</li>
		<li>将玻片依次转移至各染色缸中，每缸 3 分钟，顺序为 70% 乙醇、90% 乙醇，最后为 100% 乙醇。使用完毕后将乙醇染色缸置于 -20 °C 保存。</li>
		<li>轻拍玻片以去除多余乙醇，并将玻片以 35° 角倾斜放置，使其自然晾干。干燥后，使用金刚石笔在玻片背面标记出 18 × 18 mm 的杂交区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FISH 实验中的玻片变性
	<ol>
		<li>在 24 × 60 mm 盖玻片上加入 120 μl 70% 去离子甲酰胺/2X SSC。将玻片与盖玻片接触，于 80 °C 热板上变性 90 秒。</li>
		<li>迅速而小心地滑落盖玻片，将玻片依次浸入冰浴的 70% 乙醇、90% 乙醇和 100% 乙醇中，每种乙醇中各 3 分钟。随后让玻片自然晾干。</li>
		<li>准备一个湿盒：使用带紧密盖子的塑料盒，并在内部铺上湿润的纸巾。纸巾应保持潮湿，但不得过量浸水。</li>
		<li>在湿盒中，将步骤 4.1.3 中预退火的探针混合物加至玻片的标记区域，覆盖 18 × 18 mm 盖玻片，于 37 °C 孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育后洗涤
	<ol>
		<li>将 50% 甲酰胺/2x SSC、1x SSC 和 4x SSC/0.1% Tween-20 置于 45 °C 水浴中预热。</li>
		<li>小心移除盖玻片，将玻片在预热的 50% 甲酰胺/2x SSC 中避光振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后在预热的 1x SSC 中振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。最后在预热的 4x SSC/0.1% Tween-20 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在避光的玻璃玻片染色缸中用 DAPI 染色 3 分钟。</li>
		<li>将玻片在 2x SSC 中振荡洗涤 5 分钟。加入 35 μl Mowiol 封片介质，覆盖 24 × 60 mm 盖玻片，于 4 °C 保存玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 染色体的显微镜分析
<ol>
	<li>使用标准的落射荧光显微镜分析中期染色体玻片。为获得最佳结果，建议采用配备自动载物台的成像平台，例如 MetaSystems Metafer 平台。针对每个中期分裂相，分别采集一幅 DAPI 荧光图像以显示染色体，以及一幅来自端粒探针的荧光信号图像。例如，Cy3- 其他荧光染料也可用且效果同样好。</li>
	<li>使用图像分析程序对图像进行叠加并分析。</li>
</ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

虽然活化的B淋巴细胞特别适合制备有丝分裂染色体铺片，但其他类型的细胞也可使用。T淋巴细胞具有与B细胞相似的许多优点，因为它们可从脾脏或淋巴结中纯化，并且在含有适当有丝分裂原的培养基中受到刺激后具有较高的有丝分裂指数8。胚胎干细胞（ES细胞）也适用于中期染色体分析9。如果这些细胞不可获得，可使用成纤维细胞，但建议在固定前用秋水仙胺进行较长时间的处理（例如，以10 ng/ml的终浓度秋水仙胺处理16小时），以捕获更多的细胞于中期阶段。
我们发现，在受控湿度环境中滴加固定染色体，例如使用Thermotron CDS-5细胞遗传学干燥舱，可显著提高中期染色体展片制备的一致性；但根据实验室环境的湿度和温度条件，在实验台操作也可获得良好结果。为获得可靠的数据，建议每份样本至少分析100个中期分裂相的染色体畸变。由于在各通道中手动逐个成像每个中期分裂相的过程较为繁琐，我们采用Metasystems Metafer4全自动显微镜系统采集中期分裂相，该系统能够快速定位并准确扫描大量中期染色体。
<p class="jove_con...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

癌症是由影响调控正常细胞生长基因的突变累积所导致的。突变是由于DNA损伤引起基因组结构和序列改变的结果。DNA损伤可通过多种过程发生，包括电离辐射等外源性因素，以及正常细胞代谢的副产物，例如核苷酸碱基的自发脱氨基作用，或与活性氧物质接触所造成的损伤1。
尽管哺乳动物细胞具有一系列能够逆转DNA损伤或在断裂位点恢复序列的修复活性，突变仍会在细胞的整个生命周期中不断积累。此外，DNA损伤还可能导致细胞衰老以及干细胞潜能的丧失，这两个过程均与衰老相关疾病有关2。因此，理解DNA损伤的修复机制对于应对公共卫生领域的两个重大问题至关重要。越来越多的证据表明，哺乳动物的DNA修复通路可能促进癌细胞基因组的演化3,4，这使得在分子水平上深入理解抑制突变的相关过程变得更加迫切。
直接观察染色体畸变是评估特定细胞类型基因组不稳定性程度的一种强大且定量的方法。可通过光镜或荧光显微镜检测处于中期的细胞所分离出的凝缩染色体。此类细胞遗传学方法已应用数十年，可用于揭示易位或与DNA修复功能丧失相关的特定类型染色体畸变。该实验方案具有多种潜在拓展性：染色体可用探针标记以进行光谱核型分析（SKY）或多色荧光原位杂交 原位 杂交（mFISH）以鉴定易位5,6这些技术还可用于确定染色体易位的频率以及复杂染色体易位的结构，从而提供超出本实验方案所能获得的额外信息。此外，可设计并使用序列特异性探针，以检测特定基因组位点上DNA断裂的发生频率。7.
在本实验方案中，我们描述了如何从B淋巴细胞制备中期染色体铺片。使用一种荧光标记的肽核酸（PNA）探针识别端粒重复序列，该探针可高效地标记中期染色体铺片中的端粒。本方案具有多项优势：B细胞可被诱导以高有丝分裂指数增殖，从而能够稳定地制备高质量的染色体铺片；此外，来自基因修饰小鼠的B细胞更少携带可能干扰特定基因对基因组稳定性贡献分析的继发性遗传突变。PNA-FISH方法可在一天内完成，并能更准确地统计染色体断裂情况。通过采用该方法，特别是结合本方案中所述的特定设备，可制备出高度一致且高质量的染色体铺片，并快速分析基因组不稳定的频率和类型。

<table><tbody><tr><td>50% 硫酸葡聚糖</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶 (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &amp;mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA 端粒探针</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>秋水仙胺</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) 微珠</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 细胞遗传学干燥室</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠b淋巴细胞染色体畸变的pna-fish快速分析

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA修复缺陷会导致基因组不稳定性增加，这是引发肿瘤发生的突变的根本原因。通过分析不同类型细胞中染色体畸变的频率和类型，可揭示DNA修复通路中的缺陷。哺乳动物DNA修复生物学的研究在很大程度上得益于特定基因敲除小鼠模型的建立。本实验方案的目标是定量评估小鼠B淋巴细胞中的基因组不稳定性。利用PNA-FISH探针（肽核酸-荧光原位杂交）对端粒进行标记， 原位 杂交）有助于快速分析中期染色体铺展中的基因组不稳定性。相较于成纤维细胞，B细胞具有特定优势，因其具有正常的倍性且有较高的有丝分裂指数。因此，B细胞的短期培养能够对一种原代细胞群体中的基因组不稳定性进行精确测量，这类细胞群体所携带的继发性基因突变可能少于转化的成纤维细胞或患者细胞系中通常所见。

来自一个细胞的中期染色体应形成一个包含40条染色体的独立簇（若使用小鼠细胞）（图1A）。每条染色体的一端都有一个着丝粒，在图像中显示为浅蓝色球体。在正常染色体中，每条染色单体末端可见两个端粒信号，每个着丝粒旁也有两个信号。载玻片上也会存在间期细胞核，表现为蓝色球体，带有红色端粒信号，但无凝缩的染色体（例如见图1B）。在量化基因组不稳定性时，可忽略间期细胞核。
可以观察到多种不同类型的染色体畸变。染色单体断裂是指构成每条中期染色体的两条姐妹染色单体中的一条发生断裂。当观察者发现某条染色单体出现不连续，或染色体一端缺失单个端粒信号时，即可记为染色单体断裂（见图1B中的示例）。染色体断裂通过观察染色体一端是否缺失端粒信号来识别（见图1C中的示例）。在某些情况下，可在同一中期分裂相中观察到染色体断裂端形成的带有端粒信号的片段（如图1C所示）；而在其他情况下，断裂的染色体末端可能不可见。
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DNA修复通路对于维持基因组完整性以及防止突变和癌症的发生至关重要。本实验方案的目标是通过直接观察小鼠B细胞有丝分裂中期 spreads 中的染色体畸变，利用荧光方法定量基因组不稳定性。 原位 端粒DNA重复序列的荧光原位杂交（FISH）

小鼠B淋巴细胞染色体畸变的PNA-FISH快速分析

DNA修复缺陷会导致基因组不稳定性增加，这是引发肿瘤发生的突变的根本原因。对……频率的分析

以下实验的总体目标是定量小鼠B淋巴细胞中的基因组不稳定性。首先通过分离B细胞进行原代细胞培养，随后固定细胞，以制备中期染色体铺展样本。最后，进行端粒PNA荧光原位杂交以可视化荧光标记的端粒。最终，可通过荧光显微镜定量分析各类染色体畸变的水平。该技术的应用可拓展我们对DNA修复通路的理解，因为它有助于鉴定在目标小鼠模型中促进基因组稳定性的基因。尽管该方法可用于研究染色体断裂及其他大型染色体重排，但也可经调整用于检测其他形式的基因组不稳定性，例如易位。分离B细胞时，首先在超净工作台中将新鲜分离的脾脏置于含有2毫升洗涤缓冲液的35毫米组织培养皿中。然后使用5毫升注射器的推杆末端轻轻研磨脾脏。接下来，使用活塞将组织匀浆液通过70微米尼龙滤网过滤至50毫升离心管中，轻轻按压较大的组织块使其通过滤网。用8毫升洗涤缓冲液冲洗培养板和注射器，并将洗涤液一并通过滤网过滤。随后离心收集细胞，再用3毫升CK裂解缓冲液反复吹打沉淀数次。五分钟后，加入10毫升洗涤缓冲液以终止反应。然后再次离心细胞，轻敲管底使沉淀重悬，并向细胞中加入1毫升洗涤缓冲液。接着，将细胞与50微升抗CD43 Max微珠在冰上孵育。30分钟后，用10毫升洗涤缓冲液轻柔地洗涤细胞。在离心过程中，将一个minimax柱置于磁铁上，并在柱下方放置一个已标记的15毫升锥形管。然后向柱中加入1毫升洗涤缓冲液，收集流出液于管中。将细胞沉淀重悬于1毫升洗涤缓冲液中，然后将细胞上样至层析柱。待样品完全流过柱子后，用1毫升洗涤缓冲液冲洗柱子，并向收集的样品中直接加入7毫升洗涤缓冲液。计数收集的细胞后，将其转移至50毫升离心管中进行离心。随后，为激活B细胞，将细胞沉淀以每毫升含1×10⁶个细胞的密度重悬于添加补剂的B细胞培养基中，并将细胞接种于6孔板，每孔5毫升，在37°C、5% CO₂的加湿细胞培养孵箱中孵育以活化B细胞。随后向每个孔中加入50 µL的smid。在37°C孵育1小时后，将B细胞转移至已标记的15 mL离心管中。用胶带覆盖标签，并离心收集细胞。然后吸除上清液，仅保留约1毫升，通过移液吹打重悬沉淀。逐滴加入5毫升37摄氏度的氯化钾溶液，同时在涡旋振荡器上脉冲振荡。随后再加入额外的10毫升氯化钾溶液，通过倒置混匀细胞悬液。接下来，将细胞置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。然后加入五滴新鲜固定液，通过反复颠倒混匀。再次悬浮沉淀于1毫升上清液中后，于涡旋振荡的同时逐滴加入5毫升新鲜固定液，混匀后离心沉淀细胞，并将细胞在额外10毫升固定液中室温孵育。30分钟后，离心收集细胞，并除去上清液，仅保留1毫升固定液。随后用15毫升固定液将细胞洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于70微升上清液中。现在将标记好的载玻片以35度角放置于湿度控制在52%、温度设定为22.9摄氏度的湿盒中。每张载玻片上滴加 35 微升重悬的 B 细胞，每个样本准备两

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在小鼠B淋巴细胞染色体畸变所PNA-FISH快速分析

本文介绍了在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的单细胞FISH探针选择、卵裂球细胞核铺展技术、原位杂交以及信号判读方法。...

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染色体组学, 染色体异常, FISH检测, OctoChrome, 人类染色体, 数目变异, 结构重排, 分子细胞遗传学, 染色体分析, 荧光原位杂交

染色体可从活细胞（如淋巴细胞或皮肤成纤维细胞）以及包括人类和小鼠在内的生物体中分离。这些染色体标本可进一步用于常规G显带及分子细胞遗传学实验，例如荧光原位杂交 原位...

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本实验方案描述了多重荧光技术的应用价值 原位 杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）在识别小鼠全身照射后骨髓细胞中染色体间稳定畸变中的应用...

通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

这种曲细精管压片技术的目的是在保持细胞完整性的前提下，快速评估发育中鼠类精母细胞的细胞学特征。该方法可用于研究精子发生的各个阶段，并可方便地与其他生物化学和分子生物学方法结合，用于小鼠减数分裂的研究。...

一种利用小鼠模型进行精子发生细胞学分析的生精小管压片技术

核表面铺展技术是研究减数分裂过程中染色体事件不可或缺的工具。本文中，我们展示了一种制备和可视化斑马鱼精母细胞减数分裂前期 I...

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本文介绍了一种利用小鼠派伊尔集合淋巴结中的生发中心B细胞，对免疫球蛋白重链基因位点内的体细胞高频突变进行定量检测的方法。...

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染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

学习使用PNA-FISH技术在小鼠B淋巴细胞中定量分析染色体畸变，通过荧光显微镜观察端粒信号以评估基因组不稳定性。该方法有助于深入理解DNA修复通路在维持基因组稳定性中的作用机制。

小鼠B淋巴细胞染色体畸变的PNA-FISH快速分析

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