在小鼠B淋巴细胞染色体畸变所PNA-FISH快速分析

以下实验的总体目标是量化小鼠 B 淋巴细胞中的基因组不稳定性。这是通过首先分离 B 细胞进行原代细胞培养来实现的。接下来，固定细胞，促进中期扩散的制备。

最后，进行端粒 PNA 鱼以观察荧光标记的端粒。最终，可以通过荧光显微镜量化各种类型染色体畸变的水平。这项技术的意义可以扩展我们对 DNA 修复途径的理解，因为它可以帮助识别在我们的目标小鼠模型中促进基因组稳定性的基因。

虽然这种方法可以深入了解染色体断裂和其他大型染色体重排，但它也可以用于测量其他形式的基因组不稳定性，例如易位。为了分离 B 细胞，首先将新鲜分离的脾脏放入 35 毫米的组织培养皿中，该培养皿中含有 2 毫升洗涤缓冲液，位于层流罩中。然后使用 5 毫升注射器的柱塞后端轻轻浸渍脾脏。

接下来，使用 70 微米尼龙网过滤器将组织浆液过滤到 50 毫升管中，使用柱塞轻轻地将较大的组织块压入过滤器中。用 8 毫升洗涤缓冲液冲洗板和注射器，并通过过滤器过滤洗涤液。然后，在旋转细胞后，将沉淀物在 3 ml CK 裂解缓冲液中上下移液几次。

5 分钟后，用 10 mL 洗涤缓冲液终止反应。然后，再次旋转细胞后，轻敲管底部以重悬沉淀，并向细胞中加入 1 毫升洗涤缓冲液。接下来，将细胞与 50 μL 抗 CD 43 max 微珠在冰上孵育。

30 分钟后，在 10 mL 洗涤缓冲液中轻轻洗涤细胞。在离心过程中，在磁力架上放置一个 minimax 柱，并在柱下方放置一个标记的 15 ml 锥形管。然后向柱中加入 1 毫升洗涤缓冲液，将 EIT 收集在试管中。

细胞沉淀重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中，然后将细胞加载到柱上样品流过后，用 1 毫升洗涤缓冲液冲洗柱，并将 7 毫升洗涤缓冲液直接添加到收集的样品中。对收集的细胞进行计数后，将它们转移到 50 mL 试管中进行离心。然后，为了激活 B 细胞，将沉淀以每毫升 6 个细胞中的 10 倍重新悬浮在补充的 B 细胞培养基中，并以每孔 5 毫升细胞的速度在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿细胞培养箱中孵育细胞，以固定 B 细胞。

接下来向每个孔中注入 50 微升 smid。在 37 摄氏度下孵育 1 小时后，将 B 细胞转移到标记的 15 毫升试管中。用胶带覆盖标签并旋转细胞。

然后吸出除约 1 毫升上清液外的所有上清液，并通过移液重悬沉淀。加入 5 毫升 37 摄氏度的氯化钾，在漩涡上脉冲时一滴一滴。然后再加入 10 毫升氯化钾，倒置混合细胞溶液。

接下来，将细胞在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。然后再次倒置加入 5 滴新鲜的固定剂混合物。然后在复苏后将沉淀悬浮在 1 毫升上清液中，加入 5 毫升新鲜固定剂，在涡旋上脉冲时逐滴加入细胞，并在室温下孵育细胞和另外 10 毫升固定剂。

30 分钟后，沉淀细胞并去除除 1 毫升外的所有固定剂。然后在洗涤细胞后，在 15 mL 固定剂中再浸泡两次，将沉淀重新悬浮在最后 70 μL 的上清液中。现在将标记的玻片以 35 度角放置在设置为 22.9 摄氏度和 52% 湿度的湿度室中。

将 35 μL 重悬的 B 细胞滴到每张载玻片上，每个样品准备两张载玻片。然后，让玻片在湿度室中干燥 30 分钟后，将玻片存放在 37 摄氏度的玻片盒中，直至完全干燥。干燥后，用金刚石笔在每张载玻片的背面标记 18 x 18 毫米的区域进行杂交，以使载玻片变性以供鱼类使用。

接下来，将 120 微升 70% 去离子形式的酰胺涂抹在 24 毫米 x 60 毫米的盖玻片上，然后将每张玻片接触盖玻片。将载玻片在 80 摄氏度的热板上变性 90 秒，然后快速小心地连续滑下盖玻片。将载玻片分别放入冰冷的 70%、90% 和 100% 乙醇中 3 分钟载玻片干燥后，将载玻片放入潮湿室中，并将预需探针 Mix 涂抹在载玻片上的标记区域。

用 18 x 18 毫米的盖玻片盖住探针混合物，并在 37 摄氏度下孵育玻片 1 小时。然后在预先警告的两个 XSSC 中摇晃洗涤载玻片。5 分钟后，将 35 μL moyal 封固剂涂抹在载玻片上。

用 24 毫米 x 60 毫米的盖玻片覆盖培养基，并将载玻片储存在 4 摄氏度。最后，使用标准落射荧光显微镜分析中期载玻片。来源于一个小鼠细胞的中期染色体应形成一个包含 40 条染色体的离散簇。

每条染色体的一端都有一个着丝粒，靠近两个端粒信号，在染色体的另一端还有两个额外的端粒信号。染色单体断裂是构成每个中期染色体的两个姐妹染色单体之一的断裂。在某些情况下，染色体的断裂端可以观察到为具有相同中期传播的端粒信号的片段。

放射性染色体是涉及两条染色体的复杂重排。染色体也可能连接形成双着丝粒染色体，表现为染色体与两端着丝粒的端到端融合。罗伯逊易位是两条染色体着丝粒之间的一种易位，表现为四个姐妹染色质臂连接到一个着丝粒上。

在最后一张图片中，显示了一个不存在端粒信号的中期。端粒信号的缺失可能是由于探针制备中的错误或杂交过程中盖玻片下的气泡造成的。按照此程序，可以执行其他方法，如细胞周期分析和结肠信息，以回答其他问题，例如基因组不稳定性增加是否会影响细胞活力。