一种用于解析记忆形成神经环路的新生大鼠偏侧化嗅觉学习模型

本方案介绍了利用急性单侧鼻腔阻塞在大鼠中建立偏侧化早期气味偏好学习的方法。首先需制备可移除的聚乙烯鼻塞，第二步是在行为训练前阻塞目标侧鼻孔。

接下来，准备带有气味的垫料，然后在用画笔轻刷动物的同时，在该垫料中对其进行训练。最后一步是使用双选择测试装置检测动物对气味的偏侧化偏好。最终，通过检测磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB）的免疫组织化学结果，证明单侧鼻腔封闭导致神经元活动的单侧沉默，以及该方法的可逆性。

与现有的动物对照方法相比，本技术的主要优势在于，通过动物体内自身对照的实验设计，可在出生后第11层之前减少实验变异性及动物使用数量。由于此时成熟的主嗅前连合纤维投射尚未形成，两个嗅觉半球之间尚未连接，因此我们能够通过单侧鼻孔封闭独立地操控其中一个半球，而被封闭的半球则作为动物体内的自身对照。

尽管该技术主要关注新生大鼠的嗅觉学习，但其意义将使我们能够回答有关学习与记忆过程中神经活动的基本问题，例如突触可塑性、突变可塑性及其潜在的分子机制。通过该方法获得的研究结论可推广至学习与记忆的基本原理以及哺乳动物（尤其是出生后关键时期）的相关研究。这将有助于为与病理生理状态相关的记忆障碍的潜在治疗策略建立富有前景的研究基础。

该方法也高度适用于其他与嗅觉相关的过程，例如气味感知和气味包被。鼻塞由聚乙烯20规格导管和三条零号丝线缝合线构成。首先，截取一小段聚乙烯22规格材料，长度约为0.8厘米。

然后将丝线缝合线穿过已准备好的导管，使导管两侧均有线头。在线头位于塞子外侧的一端打结。将导管段沿缝合线向下拉至结处。

结应卡在导管内部。修剪线的两端，使导管一端露出约两毫米的线头。开始此操作时，将幼鼠从母鼠身边取出，并放入一个装有常规垫料的牢固培养皿中。

使用棉签蘸取局部麻醉凝胶（2%利多卡因），涂抹于待阻塞的耳部。将幼鼠置于培养皿中静置约三分钟。对幼鼠进行麻醉是本操作中最关键的步骤。

插入鼻塞时应小心操作，以防止出血和组织损伤。接下来，用非惯用手轻轻但稳固地抓住幼鼠，用惯用手拿起鼻塞，将局部麻醉凝胶涂抹在未露出线头的一端尖端周围。该凝胶既可起到麻醉作用，减轻插入鼻塞时可能产生的轻微疼痛，也可作为鼻腔内的润滑剂。

轻轻插入鼻塞：牢固握住幼鼠，缓慢旋转鼻塞并施加极轻柔的推力，直至鼻塞完全插入，仅露出两毫米螺纹部分从鼻孔中伸出。此过程中任一鼻孔均不应出现出血。若幼鼠在插入鼻塞时发生出血，则不能用于实验。

将动物放入培养皿中静置5分钟，以适应插头环境。为防止气味污染，在开始训练前，应在通风橱内准备带气味的垫料，并佩戴新手套，将500毫升木屑垫料放入塑料袋中。使用注射器吸取0.3毫升薄荷提取物，并将其均匀喷洒在塑料袋内的垫料上。扎紧袋口，剧烈摇晃塑料袋，使气味充分扩散，然后让垫料在袋中静置5分钟。之后将带气味的垫料转移至一个透明的、浅底的、20厘米×20厘米×5厘米的亚克力训练盒中，不加盖，在通风橱内静置5分钟后再使用。

铺好垫料后，丢弃使用过的手套。切勿让手套接触动物。将500毫升无味垫料放入另一个干净的丙烯酸训练箱中，并确保其不与带香味的垫料或使用过的手套接触。

通过将已适应的幼崽放置在带有实验性气味的垫料上，开始进行气味条件化范式。对于接受阳性气味刺激（OS）的幼崽给予抚触。每次抚触幼崽持续30秒。

使用小型画笔，在蛹的后部区域主要进行快速的环形运动。刺激可诱导去甲肾上腺素释放至嗅球和嗅觉皮层，此过程作为非条件刺激。

让幼鼠休息 30 秒。重复进行 30 秒抚摸，随后再休息 30 秒，总共持续 10 分钟。当抚摸与气味的 10 次配对完成后，将幼鼠从条件化箱中移出。

取下鼻塞，将幼崽放回母鼠身边作为对照。仅对有气味的嗅觉系统阴性幼崽进行操作。将已适应的幼崽置于有气味的垫料上，持续10分钟，期间不进行任何触碰。

10 分钟后，将幼崽从条件化箱中取出。取下鼻塞，将幼崽放回母鼠身边。在最后一次训练结束后，在不同时间点进行偏侧化嗅觉偏好测试。

测试在一个30厘米×20厘米×18厘米的不锈钢测试舱内进行，该测试舱放置在两个由2厘米中立区域隔开的丙烯酸训练箱上方。一个训练箱内装有带气味的垫料，另一个训练箱内装有干净无气味的垫料。按先前所示准备一份薄荷味垫料和一份无气味垫料，并将每个箱子置于测试舱的相对两侧下方。

相距两厘米。将塑料网放置在测试室的金属网格地板上。取下坝上的P，然后在被阻塞的白羊座上涂抹少量无味硅脂。

训练过程中，可根据需要在首次测试过程中随时重新涂抹润滑剂。将幼鼠置于测试箱的中性区域，让其自由探索箱体环境1分钟，记录幼鼠在测试箱两侧区域（即薄荷味或中性气味垫料区域）各自停留的时间。

将幼崽转移至一个带盖的塑料暂养室中，并静置一分钟。重复测试过程，总共持续10分钟，期间需调换幼崽在暂养室内的初始朝向，以排除方向偏好带来的影响。测试结束后，立即用纸巾擦去Aries设备上的油脂。

按照之前演示的相同 RY 隔离步骤，将聚乙烯鼻塞插入另一侧 Aries，让动物休息 10 分钟。随后对幼崽进行偏侧化气味偏好测试。再次进行测试后，取出鼻塞并将幼崽放回母体。

在气味加抚触训练期间，单侧鼻孔封闭会导致嗅觉记忆的侧化，且该记忆仅局限于未封闭的鼻孔。当幼崽在测试中使用与训练期间相同的单侧鼻孔封闭方式进行测试时，它们表现出对条件化气味的偏好。而在使用对侧鼻孔封闭方式进行测试时，则未观察到这种偏好。

相比之下，无论哪一侧鼻孔被堵塞，气味对照组均未表现出对气味的偏好。在测试过程中，单侧化气味训练导致在气味暴露期间嗅觉系统的单侧化激活；对嗅球（OB）和前梨状皮层（aPC）进行免疫组织化学分析显示，与对侧未堵塞半球相比，堵塞半球在气味暴露后磷酸化Creb显著减少。尼氏染色显示，两侧半球的嗅球僧帽细胞层以及梨状皮层锥体细胞层中的细胞体数量相当。

在移除鼻塞后24小时，对嗅球（OB）中的僧帽细胞和梨状皮层（PC）中的锥体细胞进行检测，发现气味暴露后两侧半球（阻塞侧与未阻塞侧）的豌豆蟹表达水平相当。这表明单次鼻孔封闭的影响是短暂且可逆的，不会造成明显的长期神经元损伤，因而不会影响测试期间的气味感知及神经元对气味的激活反应。一旦掌握操作技巧，正确实施的鼻孔封闭可在五分钟内完成。

进行此操作时，堵住鼻孔需格外小心。任何过度用力或操作不当都可能导致出血，从而在操作后对鼻孔造成损伤。此外，还可采用离体电生理学和分子生物学等技术来进一步探究突触可塑性的相关问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用暂时性单侧窄缝阻断来实现气味学习的侧化，并解析支撑记忆形成的神经环路。