Name: 新生大鼠于A气味偏侧学习模型解剖神经回路托换记忆的形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学习利用单侧鼻孔闭塞技术建立新生大鼠偏侧化早期气味偏好学习模型，通过可移除聚乙烯鼻塞实现行为与生物学机制研究。该方法可减少动物间差异，适用于神经可塑性与记忆形成的分子机制探索。

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本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（MOP-102624）对Q. Y.的资助。我们感谢Carolyn Harley博士在研究过程中提供的有益讨论，感谢Qinlong Hou博士、Amin Shakhawat和Andrea Darby-King提供的技术支持。

使用雄性和雌性Sprague Dawley大鼠（Charles River）幼崽。于出生后第1天（PD0为出生日）将每窝幼崽数量调整至12只。母鼠维持在12小时光照/12小时黑暗循环条件下 随意摄取 可自由获取食物和水。实验程序已获纽芬兰纪念大学机构动物护理委员会批准。
1. 鼻塞构建
注意：本实验步骤改编自 Cummings et al. (1997)35。
<ol>
	<li>获取聚乙烯-20导管和3-0丝线缝合线。</li>
	<li>将一段聚乙烯-20导管剪成约0.8 mm的小段。</li>
	<li>将丝线缝合线穿过已准备好的导管，使导管两端均留有缝合线。</li>
	<li>在导管外一端的缝合线上打一个结。</li>
	<li>将导管段沿缝合线拉下，覆盖住线结。线结应卡在导管内部。</li>
	<li>修剪缝合线的两端，使其中一端的导管外露出约2 mm的线头（见图1A）。</li>
</ol>
2. 训练前鼻腔封闭
<ol>
	<li>将幼鼠从母鼠身边取出，放入一个装有常规垫料的容器中，并确保其安全。</li>
	<li>使用棉签蘸取局部麻醉凝胶（2% 利多卡因），涂抹于需要堵塞的鼻孔处。</li>
	<li>让幼鼠在容器中静置约 3 分钟。</li>
	<li>用非惯用手轻轻但稳固地握住幼鼠。</li>
	<li>用惯用手拿起鼻塞，将相同的局部麻醉凝胶涂抹在无缝线伸出的一端尖部。该凝胶既可麻醉插入鼻塞时可能引起的轻微疼痛，也可作为鼻孔内的润滑剂。注意：利多卡因的作用在数分钟内开始，持续 20–30 分钟。幼鼠在涂抹利多卡因凝胶后通常对鼻塞插入耐受良好（挣扎和发声最少）。</li>
	<li>在牢固握住幼鼠的同时，轻柔地旋转鼻塞并施以极轻的推力，缓慢将其插入，直至鼻塞完全进入，仅留 2 mm 缝线从鼻孔中露出（见图 1B）。此过程不应引起任一鼻孔出血。若插入鼻塞时出现出血，应排除该幼鼠并将其送回母鼠身边。</li>
	<li>让动物在此容器中静置 5 分钟，以适应鼻塞的存在。</li>
	<li>将幼鼠从适应容器中取出，开始条件化范式24。</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物胡须修剪；感觉剥夺方法；包含示意图和实例。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 鼻塞装置的制作。A）制作鼻塞装置的步骤示意图。将一根细线穿过聚乙烯管；打结后将结拉入管子中部以阻塞管道；将两端剪断，其中一端在管外保留2 mm残端。B）一只大鼠单侧鼻孔插入鼻塞后的正面和侧面视图。
3. 带气味垫料的制备
<ol>
	<li>佩戴新的手套并在通风橱内操作，以防止气味污染，将 500 ml 木屑垫料放入一个塑料袋中。</li>
	<li>使用注射器吸取 0.3 ml 薄荷提取物，并将其均匀喷洒在塑料袋内的垫料上。</li>
	<li>扎紧袋口，用力摇晃袋子，然后让垫料在袋中静置 5 分钟。</li>
	<li>将带有气味的垫料放入一个透明的浅层丙烯酸训练盒（20 x 20 x 5 cm3，图 2A）中，不加盖，在通风橱内放置 5 分钟后再使用。垫料准备完毕后，丢弃这些手套，并确保这些手套不再接触动物。</li>
	<li>将无气味的垫料放入另一个相同的透明塑料盒中，确保其不与带气味的垫料或使用过的手套接触。</li>
</ol>
4. 气味条件化范式（见图2A）
幼鼠在出生后第6天（PD 6）接受一次条件化训练，或在出生后第3至6天（PD 3-6）每天进行一次、共多次的训练。
<ol>
	<li>将已适应的幼鼠置于带有气味的垫料上。对于仅暴露于气味（O/S-）的对照组幼鼠，在垫料上停留10分钟，然后跳至步骤4.5。对于实验组气味+触觉刺激（O/S+）幼鼠，继续执行本节中的以下步骤。</li>
	<li>使用小型画笔对幼鼠进行30秒的轻柔刷拭。主要在幼鼠后部区域以快速环形动作进行。</li>
	<li>让幼鼠静息30秒。</li>
	<li>重复步骤4.2和4.3，共持续10分钟（即 触觉刺激与气味配对共10次）。</li>
	<li>将幼鼠从条件化箱中取出，移除鼻塞，并将其放回母鼠身边。</li>
</ol>
5. 侧化气味偏好测试（见图2B）
测试在不同时间点进行（例如，末次训练后24或48小时）进行测试。测试在不锈钢测试箱（30 × 20 × 18 cm）中进行3），该装置置于两个训练箱（训练箱见3.4）之上，两箱之间由一个2 cm的中性区域隔开。其中一个训练箱内装有薄荷味垫料，另一个训练箱内则装有干净无气味的垫料。测试箱的底部为金属网格，其上覆盖一层可拆卸的塑料网片（图2B).
<ol>
	<li>按照第3节的要求，分别准备一份薄荷味和一份无香味的垫料，将每盒垫料置于测试箱的相对两侧，相距2 cm。将塑料网置于测试箱的金属网格地板上。</li>
	<li>将幼鼠从母鼠身边取出，在训练期间闭塞的鼻孔上涂抹少量无味硅脂。在首次测试过程中根据需要重新涂抹硅脂。 
注：为避免偏差，可考虑在训练和测试期间随机选择闭塞的鼻孔。</li>
	<li>将幼鼠置于测试箱的中性区域。</li>
	<li>让幼崽在箱体内自由探索1分钟，记录幼崽在箱体两侧各自停留的时间（即 薄荷味或无味垫料上</li>
	<li>让幼鼠在带盖的塑料暂养室中静置 1 min。</li>
	<li>重复步骤 5.2 &amp; 5.3 总计 10 分钟即 5 次测试试验之间穿插 5 次休息试验，通过改变幼鼠在实验箱中的初始朝向，以控制方向偏好。</li>
	<li>测试结束后立即擦去鼻孔周围的油脂。</li>
	<li>按照第2节所述，将聚乙烯鼻塞插入对侧鼻孔，并让动物休息10分钟。</li>
	<li>再次按照5.3–5.6步骤测试幼鼠，取下堵塞物，将幼鼠放回母鼠身边。用95%乙醇移除并清洁测试室中的塑料网，待液体挥发后，将网放回原位，再对下一只幼鼠进行测试。 
	注意：在测试期间首次堵塞鼻孔时涂抹硅脂，可防止因插入鼻塞导致的出血和应激反应。</li>
</ol>
<img alt="小鼠行为训练与测试装置，含薄荷味垫料选择实验。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 早期气味偏好训练与测试。A) 采用气味结合轻抚范式进行早期气味偏好训练。B) 双选择气味偏好测试，一侧为含薄荷味的垫料，另一侧为对照无味垫料，中间设置 2 cm 的中性区域。
6. 测试单侧鼻孔闭塞的有效性
本实验旨在确定单侧鼻孔闭塞是否会导致嗅觉系统的侧化激活。
<ol>
	<li>按照第2节所述方法对出生第6或第7天的幼鼠进行单侧鼻孔封闭。</li>
	<li>经过约5分钟适应后，将幼鼠放入一个带盖的塑料容器中，并暴露于30 µl浸润在滤纸片上的纯薄荷油气味中，持续10分钟。</li>
	<li>在薄荷气味暴露结束后，立即通过腹腔注射（i.p.）给予水合氯醛（400 mg/kg）作为全身麻醉剂，或注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）。</li>
	<li>待幼鼠完全麻醉（对尾部或足部夹捏无反应）后，经心脏灌注冰冻的生理盐水（0.9%）约1分钟，随后灌注4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液PBS中）。</li>
	<li>多聚甲醛灌注10分钟后，取出脑组织并置于4%多聚甲醛中4 °C过夜固定，然后将脑组织转移至蔗糖溶液（20%溶于PBS）中继续浸泡24小时。</li>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织切成30 μm厚的冠状切片，收集嗅球和梨状皮层切片，贴附于明胶包被的载玻片上，随后按照标准流程进行pCREB抗体的免疫组织化学染色21,25,30。</li>
</ol>
7. 单侧鼻孔阻塞可逆性的检测
本实验检测在移除鼻塞后24小时，阻断效应是否可逆。
<ol>
	<li>按照第2节所述方法，对出生后第6或第7天的幼鼠进行单侧鼻孔封闭。</li>
	<li>15分钟后（相当于训练期间鼻孔封闭的持续时间——5分钟适应期 + 10分钟训练期），移除鼻塞并将幼鼠放回母鼠身边。</li>
	<li>24小时后，将幼鼠置于带盖塑料容器中，暴露于薄荷气味中10分钟，操作方法如6.2节所述。</li>
	<li>按照第6.3–6.6节中的相同步骤进行操作。</li>
</ol>

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<li>Kucharski, D., Hall, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+change+in+the+access+to+olfactory+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental change in the access to olfactory memories.</a> Behav Neurosci. 102, 340-348 (1988).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在关键时间窗口内，Hall 及其同事首次建立了大鼠幼崽偏侧化嗅觉学习与记忆模型。在一系列研究中33,34,36，他们发现，在出生后第6天（PD 6）对大鼠幼崽的一侧鼻孔进行气味与牛奶配对，可诱导产生偏侧化的气味偏好记忆。当训练和测试期间保持同一侧鼻孔开放时，偏好记忆表现显著；而当封闭的鼻孔被打开并用于测试时，则未观察到该记忆。然而，在出生后第12天（PD 12），当前连合通路从前嗅皮层开始发挥功能时32，未经训练的鼻孔单独即可支持在 PD 6 获得的气味偏好的表达。若损毁前连合，则恢复了记忆的偏侧化特性，使其无法再通过未经训练的鼻孔表达33。该偏侧化学习模型已被成功复制于气味与抚触结合的范式中24,25,31。在 PD 6 期间采用单侧鼻孔封闭并结合气味与抚触训练，可在 PD 7 观察到偏侧化记忆31。在 PD 3 至 PD 6 期间重复进行单侧鼻孔封闭，可产生持续至少48小时的更长久的偏侧化记忆24。
偏侧化嗅觉学习方案可在单个动物体内产生“裂脑”模...

嗅觉是啮齿类动物的主要感觉方式，若缺乏嗅觉，它们将无法在环境中成功地导航或生存。对于新生幼崽而言，嗅觉尤为重要，因为在出生后的第一周内，它们既看不见也听不到，必须依靠嗅觉来寻找母体以获得食物1。因此，可以通过简单的实验操作对新生大鼠幼崽进行条件化训练，使其对特定气味产生偏好。已有多种刺激被用作非条件刺激（UCS），以在新生个体中诱导对新异气味（条件刺激，CS）的条件化反应，包括巢穴环境2,3、吸吮乳汁4-6、抚摸或触觉刺激7-12、尾部夹捏13、母体唾液13、轻度足部电击14-18以及颅内脑刺激19。本研究采用一种已建立的早期气味偏好范式，即将一种气味（此处为薄荷）与触觉刺激结合，以在24小时&#160;后产生对薄荷气味的偏好10,11,20。这些气味记忆依赖于完整的嗅觉环路，主要包括嗅球（OB）21-23和前梨状皮层（aPC）24,25。
对早期气味偏好学习的实验研究加深并拓展了我们对哺乳动物记忆分子与生理机制的理解。该哺乳动物模型在研究记忆机制方面具有多项优势。首先，已确定非条件刺激信号的神经来源。上述各种刺激均可激活蓝斑去甲肾上腺素的释放26，进而激活嗅球（OB）和前梨状皮层（aPC）中的多种肾上腺素能受体，引发支持学习的细胞和生理效应22,27,28其次，支持记忆的机制发生在结构明确的层状神经结构中。新生大鼠嗅觉通路结构简单，为研究人员提供了理想的研究框架，可用于揭示与突触可塑性相关的复杂过程。嗅上皮中的嗅觉感觉神经元（OSN）投射至嗅球中的僧帽细胞/簇状细胞，而这些僧帽细胞/簇状细胞又同侧投射至梨状皮层（PC）。 通过 侧嗅束（LOT）以及其他结构29嗅觉神经元在嗅球中的突触30,31 以及LOT突触24,25 在aPC中已鉴定出对支持学习和记忆的突触改变至关重要的关键位点。第三，在大鼠的早期年龄阶段，嗅觉输入容易产生侧化。每个aPC均可获取双侧的气味信息 通过 前联合在出生后第12天（PD12）白质完全形成时32在出生后第12天之前，可通过单侧鼻孔闭塞将气味输入局限于同侧嗅球和前嗅皮层24,25,31,33,34单侧鼻孔闭塞允许来自开放鼻孔的气味记忆形成，但在出生后12天（PD 12）之前阻止来自闭塞鼻孔的相同记忆形成。33嗅觉记忆定位于同侧半球，包括嗅球（OB）和前嗅皮层（aPC）。因此，每只幼鼠均可作为自身学习及其潜在生理机制的对照。
在本研究中，介绍了偏侧化的早期气味偏好学习方案。该方法通过提供动物个体内的对照24,25,31 ，成为研究气味学习神经机制的有力工具，从而减少了所需实验动物的数量并降低了整体变异。鼻孔封闭是可逆的，封堵剂或鼻塞可被施加和移除，对动物造成的应激或损伤极小。本文首先详细描述了早期气味偏好训练与检测的具体操作步骤，重点介绍使用单侧鼻孔封闭结合鼻塞的偏侧化方案；随后展示实验结果，以证明单侧鼻孔封闭在隔离气味输入和形成偏侧化气味记忆方面的有效性；最后探讨了利用该偏侧化学习模型研究嗅觉系统中产生学习行为并支持记忆表达的生理变化的潜力。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯 20 管</td><td>Intramedic</td><td>427406</td><td>非放射显影性，无毒</td></tr><tr><td>3-0 丝线缝合线</td><td>Syneture</td><td>Sofsilk</td><td>不可吸收</td></tr><tr><td>硅脂</td><td>Warner Instrument</td><td>64-0378</td><td>无味</td></tr><tr><td>2% 利多卡因凝胶</td><td>AstraZeneca</td><td>产品编号 061</td><td>盐酸利多卡因凝胶，可在当地药店购买</td></tr><tr><td>画笔</td><td>Dynasty</td><td>206R</td><td>类似尺寸或其他品牌亦可使用</td></tr><tr><td>薄荷提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W284807</td><td>其他品牌也可使用</td></tr><tr><td>训练箱</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>丙烯酸箱（20 × 20 × 5 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;），见 &lt;b&gt;图 2A&lt;/b&gt;。箱子的参数和材料并非关键，可进行修改。所用材料应无味且不吸附气味</td></tr><tr><td>测试室</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>不锈钢材质（30 × 20 × 18 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;），见 &lt;b&gt;图 2B&lt;/b&gt;。测试室的参数和材料并非关键，可进行修改。例如，可用丙烯酸材质的测试室替代不锈钢材质</td></tr><tr><td>pCREB 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9198</td><td>Ser 133 (87G3) 兔单克隆抗体</td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8383</td><td>N/A</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>N/A</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

一种用于解析记忆形成神经环路的新生大鼠偏侧化嗅觉学习模型

A Lateralized Odor Learning Model in Neonatal Rats for Dissecting Neural Circuitry Underpinning Memory Formation

出生后关键期（≤ 10 天）的大鼠幼崽容易对与模拟母体照料刺激相关联的气味形成偏好。这种偏好记忆可持续数小时、数天，甚至终生，具体持续时间取决于训练参数。早期气味偏好学习为我们提供了一个模型，其中自然学习形式的关键变化发生在嗅觉神经回路中。该模型另一个使其成为分析记忆过程强大工具的特征是，在关键期内可通过单侧鼻孔堵塞实现嗅觉学习的偏侧化。via 单鼻孔堵塞实现。这是因为在这一早期阶段，两侧嗅脑之间尚未发育成熟的前连合连接。本文概述了使用鼻塞进行偏侧化气味学习的行为实验方案。急性、可逆性的鼻孔堵塞可最大程度减少与长期堵塞或更侵入性方法（如烧灼）相关的组织和神经元损伤。偏侧化气味学习模型允许在同一只动物体内进行比较，因此与动物间设计相比显著降低了实验变异。该方法已成功用于探究训练引起的嗅觉系统神经回路变化。未来的研究方向包括利用该偏侧化学习模型探索气味记忆的分子机制，以及将生理变化与记忆强度和持续时间相关联。

本文回顾了部分先前已建立的研究结果24，以证明鼻孔闭塞法在将嗅觉输入和学习限制于单侧大脑半球方面的有效性，以及该方法的可逆性。
在早期气味偏好训练期间进行单侧鼻孔封闭会导致侧化的气味记忆24。该记忆局限于未封闭的鼻孔（图3）。当幼鼠在测试时使用与训练期间相同的鼻孔封闭方式时，它们对条件化气味（例如，薄荷）表现出偏好；而当测试时使用对侧鼻孔封闭时，它们则不再表现出对该条件化气味的偏好。这些结果共同表明，气味偏好记忆仅通过经历气味+抚触联合训练的未封闭鼻孔形成并表达。
<img alt="嗅觉训练实验；示意图及显示气味偏好测试结果的柱状图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51808/51808fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="178763...

本方案介绍了利用急性单侧鼻孔闭塞在大鼠中建立偏侧化早期气味偏好学习的方法。偏侧化学习允许在同一批动物体内考察行为学结果及其潜在的生物学机制，从而减少个体间实验设计所引起的变异。该方案可用于研究早期气味学习背后的分子机制。

出生后关键期（≤ 10天）的大鼠幼仔容易对与模拟母体刺激相关联的气味形成偏好

本方案介绍了利用急性单侧鼻腔阻塞在大鼠中建立偏侧化早期气味偏好学习的方法。首先需制备可移除的聚乙烯鼻塞，第二步是在行为训练前阻塞目标侧鼻孔。接下来，准备带有气味的垫料，然后在用画笔轻刷动物的同时，在该垫料中对其进行训练。最后一步是使用双选择测试装置检测动物对气味的偏侧化偏好。最终，通过检测磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB）的免疫组织化学结果，证明单侧鼻腔封闭导致神经元活动的单侧沉默，以及该方法的可逆性。与现有的动物对照方法相比，本技术的主要优势在于，通过动物体内自身对照的实验设计，可在出生后第11层之前减少实验变异性及动物使用数量。由于此时成熟的主嗅前连合纤维投射尚未形成，两个嗅觉半球之间尚未连接，因此我们能够通过单侧鼻孔封闭独立地操控其中一个半球，而被封闭的半球则作为动物体内的自身对照。尽管该技术主要关注新生大鼠的嗅觉学习，但其意义将使我们能够回答有关学习与记忆过程中神经活动的基本问题，例如突触可塑性、突变可塑性及其潜在的分子机制。通过该方法获得的研究结论可推广至学习与记忆的基本原理以及哺乳动物（尤其是出生后关键时期）的相关研究。这将有助于为与病理生理状态相关的记忆障碍的潜在治疗策略建立富有前景的研究基础。该方法也高度适用于其他与嗅觉相关的过程，例如气味感知和气味包被。鼻塞由聚乙烯20规格导管和三条零号丝线缝合线构成。首先，截取一小段聚乙烯22规格材料，长度约为0.8厘米。然后将丝线缝合线穿过已准备好的导管，使导管两侧均有线头。在线头位于塞子外侧的一端打结。将导管段沿缝合线向下拉至结处。结应卡在导管内部。修剪线的两端，使导管一端露出约两毫米的线头。开始此操作时，将幼鼠从母鼠身边取出，并放入一个装有常规垫料的牢固培养皿中。使用棉签蘸取局部麻醉凝胶（2%利多卡因），涂抹于待阻塞的耳部。将幼鼠置于培养皿中静置约三分钟。对幼鼠进行麻醉是本操作中最关键的步骤。插入鼻塞时应小心操作，以防止出血和组织损伤。接下来，用非惯用手轻轻但稳固地抓住幼鼠，用惯用手拿起鼻塞，将局部麻醉凝胶涂抹在未露出线头的一端尖端周围。该凝胶既可起到麻醉作用，减轻插入鼻塞时可能产生的轻微疼痛，也可作为鼻腔内的润滑剂。轻轻插入鼻塞：牢固握住幼鼠，缓慢旋转鼻塞并施加极轻柔的推力，直至鼻塞完全插入，仅露出两毫米螺纹部分从鼻孔中伸出。此过程中任一鼻孔均不应出现出血。若幼鼠在插入鼻塞时发生出血，则不能用于实验。将动物放入培养皿中静置5分钟，以适应插头环境。为防止气味污染，在开始训练前，应在通风橱内准备带气味的垫料，并佩戴新手套，将500毫升木屑垫料放入塑料袋中。使用注射器吸取0.3毫升薄荷提取物，并将其均匀喷洒在塑料袋内的垫料上。扎紧袋口，剧烈摇晃塑料袋，使气味充分扩散，然后让垫料在袋中静置5分钟。之后将带气味的垫料转移至一个透明的、浅底的、20厘米×20厘米×5厘米的亚克力训练盒中，不加盖，在通风橱内静置5分钟后再使用。铺好垫料后，丢弃使用过的手套。切勿让手套接触动物。将500毫升无味垫料放入另一个干净的丙烯酸训练箱中，并确保其不与带香味的垫料或使用过的手套接触。通过将已适应的幼崽放置在带有实验性气味的垫料上，开始进行气味条件化范式。对于接受阳性气味刺激（OS）的幼崽给予抚触。每次抚触幼崽持续30秒。使用小型画笔，在蛹的后部区域主要进行快速的环形运动。刺激可诱导去甲肾上腺素释放至嗅球和嗅觉皮层，此过程作为非条件刺激。让幼鼠休息 30 秒。重复进行 30 秒抚摸，随后再休息 30 秒，总共持续 10 分钟。当抚摸与气味的 10 次配对完成后，将幼鼠从条件化箱中移出。取下鼻塞，将幼崽放回母鼠身边作为对照。仅对有气味的嗅觉系统阴性幼崽进行操作。将已适应的幼崽置于有气味的垫料上，持续10分钟，期间不进行任何触碰。10 分钟后，将幼崽从条件化箱中取出。取下鼻塞，将幼崽放回母鼠身边。在最后一次训练结束后，在不同时间点进行偏侧化嗅觉偏好测试。测试在一个30厘米×20厘米×18厘米的不锈钢测试舱内进行，该测试舱放置在两个由2厘米中立区域隔开的丙烯酸训练箱上方。一个训练箱内装有带气味的垫料，另一个训练箱内装有干净无气味的垫料。按先前所示准备一份薄荷味垫料和一份无气味垫料，并将每个箱子置于测试舱的相对两侧下方。相距两厘米。将塑料网放置在测试室的金属网格地板上。取下坝上的P，然后在被阻塞的白羊座上涂抹少量无味硅脂。训练过程中，可根据需要在首次测试过程中随时重新涂抹润滑剂。将幼鼠置于测试箱的中性区域，让其自由探索箱体环境1分钟，记录幼鼠在测试箱两侧区域（即薄荷味或中性气味垫料区域）各自停留的时间。将幼崽转移至一个带盖的塑料暂养室中，并静置一分钟。重复测试过程，总共持续10分钟，期间需调换幼崽在暂养室内的初始朝向，以排除方向偏好带来的影响。测试结束后，立即用纸巾擦去Aries设备上的油脂。按照之前演示的相同 RY 隔离步骤，将聚乙烯鼻塞插入另一侧 Aries，让动物休息 10 分钟。随后对幼崽进行偏侧化气味偏好测试。再次进行测试后，取出鼻塞并将幼崽放回母体。在气味加抚触训练期间，单侧鼻孔封闭会导致嗅觉记忆的侧化，且该记忆仅局限于未封闭的鼻孔。当幼崽在测试中使用与训练期间相同的单侧鼻孔封闭方式进行测试时，它们表现出对条件化气味的偏好。而在使用对侧鼻孔封闭方式进行测试时，则未观察到这种偏好。相比之下，无论哪一侧鼻孔被堵塞，气味对照组均未表现出对气味的偏好。在测试过程中，单侧化气味训练导致在气味暴露期间嗅觉系统的单侧化激活；对嗅球（OB）和前梨状皮层（aPC）进行免疫组织化学分析显示，与对侧未堵塞半球相比，堵塞半球在气味暴露后磷酸化Creb显著减少。尼氏染色显示，两侧半球的嗅球僧帽细胞层以及梨状皮层锥体细胞层中的细胞体数量相当。在移除鼻塞后24小时，对嗅球（OB）中的僧帽细胞和梨状皮层（PC）中的锥体细胞进行检测，发现气味暴露后两侧半球（阻塞侧与未阻塞侧）的豌豆蟹表达水平相当。这表明单次鼻孔封闭的影响是短暂且可逆的，不会造成明显的长期神经元损伤，因而不会影响测试期间的气味感知及神经元对气味的激活反应。一旦掌握操作技巧，正确实施的鼻孔封闭可在五分钟内完成。进行此操作时，堵住鼻孔需格外小心。任何过度用力或操作不当都可能导致出血，从而在操作后对鼻孔造成损伤。此外，还可采用离体电生理学和分子生物学等技术来进一步探究突触可塑性的相关问题。观看本视频后，您应能充分理解如何利用暂时性单侧窄缝阻断来实现气味学习的侧化，并解析支撑记忆形成的神经环路。

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科研

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新生大鼠于A气味偏侧学习模型解剖神经回路托换记忆的形成

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一种用于解析记忆形成神经环路的新生大鼠偏侧化嗅觉学习模型

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