Name: 增强Northern印迹检测小RNA种类的果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习增强Northern印迹技术检测Drosophila melanogaster小RNA表达的方法。本方案通过RNA提取、丙烯酰胺凝胶电泳分离、化学交联固定及放射性探针标记，实现低分子量RNA的高灵敏度检测，适用于胚胎、细胞和组织样本的RNA生物学研究。

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本工作由法国国家健康与医学研究院、法国国家科学研究中心、斯特拉斯堡大学、斯特拉斯堡医院、癌症研究协会、法国国家癌症研究所、法国国家科研署以及阿尔萨斯大区资助。
Pietro Laneve 获得了法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale）的支持。目前，他获得意大利技术研究院（Istituto Italiano Tecnologia, IIT）的博士后奖学金。出版费用由Neurex网络（TriNeuron – 上莱茵河地区Interreg IV项目）资助。

1. 样品采集
<ol>
	<li>脱离半贴壁的Schneider’s 2细胞（1-5 × 106 细胞（平均），用移液管吹打混匀后，通过离心（100 × g）收集&#160;1分钟）。如果出现 体外 培养的贴壁细胞，在标准条件下用胰蛋白酶消化，或使用细胞刮刀将细胞直接从培养板上收集至适量的RNA提取试剂中。</li>
	<li>用于胚胎收集，培养 果蝇 在果蝇培养笼中培养品系，并让胚胎在产卵板上聚集。用毛笔在蒸馏水（dH₂O）中将胚胎刷下。2O），通过筛网过滤去除碎片，冲洗后将胚胎收集至小瓶中48.</li>
	<li>作为替代技术，可手动解剖组织或器官。从样本中分离睾丸（piRNA分析的优选系统） 果蝇 在立体显微镜（20倍放大）下，使用解剖针或镊子，在磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖腹部，如Sullivan所示 等49.</li>
	<li>研钵杵&#160;加入0.5体积的RNA提取试剂后立即均质化样品。</li>
</ol>
2. RNA 提取/分析
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用商业试剂进行RNA提取。注意！ RNA提取试剂通常具有毒性和腐蚀性。或者，可采用基于蛋白酶K的RNA提取方案50，步骤如下：
	<ol>
		<li>将样品稀释至400 μl终止液（Stop Mix）中，在室温&#160;下孵育15分钟。</li>
		<li>通过标准的苯酚:氯仿:异戊醇和氯仿抽提，以及乙醇（EtOH）沉淀/洗涤，回收水溶性组分。将样品空气&#160;干燥后，重悬于经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的双蒸水（ddH2O）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过紫外分光光度法测定RNA浓度。同时，根据A260/A280 比值确认RNA纯度是否较高，理想值接近2.0。</li>
	<li>通过变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA制备质量，步骤如下：
	<ol>
		<li>在洁净烧杯中，加入1.2 g琼脂糖溶于82 ml DEPC处理的双蒸水（DEPC-ddH2O）中，持续搅拌，加热至完全溶解。</li>
		<li>待胶液冷却；当温度降至60 °C时，加入10 ml 10X 4-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液至终浓度为1X（FC），并加入8 ml 37%甲醛至终浓度为3%（FC）。注意！&#160;甲醛为致癌物。</li>
		<li>将凝胶倒入水平电泳槽中，在通风橱中静置至少1小时使其完全凝固。凝固后，将凝胶浸入1X MOPS缓冲液中。</li>
		<li>取2 μg RNA样品和1 μg分子量标记物（若需精确&#160;评估，请使用RNA标记物），分别加入3倍体积的琼脂糖上样染料（ALD）。于70 °C加热5分钟，立即置于冰上冷却。&#160;注意！&#160;ALD中的组分（溴化乙锭和甲酰胺，见材料部分）分别为诱变剂和腐蚀性物质。</li>
		<li>上样后，在约50 V电压下电泳约1小时，期间可循环更换缓冲液。通过紫外成像或凝胶成像系统观察RNA的分离情况。应可见对应于28S和18S rRNA以及tRNA的清晰条带（见图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可继续进行Northern杂交分析，或将RNA于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 变性丙烯酰胺凝胶制备
<ol>
	<li>使用小型垂直电泳装置进行此分离步骤（板尺寸约为 8 cm × 9 cm，梳子厚度 0.75 mm）。</li>
	<li>将洁净的玻璃板在制胶架中组装在一起。</li>
	<li>在 MOPS 1× 缓冲液中配制 10 ml 含 10% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）和 7 M 尿素的溶液。在灌胶前立即加入 100 μl 10% 过硫酸铵和 10 μl TEMED，并迅速混匀。 注意！ 丙烯酰胺具有神经毒性和致癌性。</li>
	<li>将凝胶溶液灌注于玻璃板之间，并小心插入加样梳，避免产生气泡。室温下静置至少 45 分钟，待其充分聚合后再使用。或者，可将凝胶包裹于浸湿的滤纸中，再用保鲜膜密封，于 4°C 过夜保存备用。</li>
</ol>
4. 样品制备
<ol>
	<li>每个样品取 0.5–20 μg 总 RNA。若体积超过 3–4 μl，真空浓缩&#160;干燥样品。</li>
	<li>为确定片段大小，将放射性标记的低分子量ladder取一份等分试样（20–30 cps）与样品平行运行，作为标记（参见第4.3和4.4节的制备方法）。按照步骤4.5所述，将其与样品平行处理。</li>
	<li>梯度标记物：使用0.1 μg的10 bp阶梯标记物建立磷酸化正向反应。37 °C孵育30分钟，通过加入乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度20 mM终止反应。</li>
	<li>通过乙醇沉淀/洗涤纯化，晾干&#160;干燥后用ddH₂O重悬2O&#160;（约100 μl）。 警告！ 32P 是一种放射性源。</li>
	<li>向每个样品中加入等体积的丙烯酰胺蓝染料（ABD）。在80 °C加热5分钟以变性，然后置于冰上冷却至加载前。 警告！ 甲酰胺（ABD 中的成分）具有腐蚀性。</li>
</ol>
5. 电泳分离
<ol>
	<li>从制胶支架上取下玻璃板，并将其正确组装到电泳槽中。向内槽和外槽加入足量的电泳缓冲液（RB）。</li>
	<li>轻轻取出梳子，在200 V&#160;条件下预电泳10分钟。&#160;上样前，用注射器将少量RB冲洗加样孔，以去除尿素沉积物。</li>
	<li>使用平口吸头小心地将步骤4.5中的样品逐层加至每个加样孔底部。检查阳极和阴极连接，避免反向电泳。样品在100 V&#160;条件下进入凝胶5分钟后，将电压升至200 V。</li>
	<li>若分离长度约为7 cm，运行45分钟即可。注意避免溴酚蓝（ABD中的示踪染料）溢出凝胶。</li>
	<li>可选步骤：通过溴化乙锭（EtBr）染色在凝胶上直接观察分离的长链RNA：
	<ol>
		<li>切去凝胶顶部约2 cm，用ddH2O短暂漂洗凝胶片。</li>
		<li>将凝胶片置于RB中，加入终浓度为0.5 μg/ml的EtBr，在室温下轻轻振荡孵育15分钟。</li>
		<li>在RB中脱色15分钟，通过紫外照射或凝胶成像系统观察长链rRNA。检查RNA上样量及质量（见图&#160;1，图示7）。注意！溴化乙锭具有致突变性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>同时，对含有小RNA种类的凝胶下部进行转膜操作。</li>
</ol>
6. 凝胶印迹
<ol>
	<li>裁剪6张与印迹区域大小相匹配的滤纸，以及一张相应尺寸的不带电荷的尼龙膜。将滤纸、尼龙膜和两块印迹垫在RB缓冲液中浸湿。通过在RB缓冲液中反复挤压，确保彻底浸透印迹垫。</li>
	<li>从电泳装置中取出凝胶，用刮刀小心分开玻璃板。使用干净的切刀切除加样孔。将一张湿润的Whatman滤纸贴在凝胶表面，轻轻揭起凝胶。</li>
	<li>将尼龙膜贴在凝胶的自由面上，标记一个角以指示样品加样方向。在凝胶两侧各放置三层湿滤纸，完成“三明治”结构。用塑料滚轮在印迹表面滚动，以去除所有可能的气泡。</li>
	<li>将“三明治”结构夹在两块印迹垫之间，然后放入印迹夹心中。将夹心放入电转模块中，向腔室内加入RB缓冲液，并检查方向是否正确（尼龙膜必须位于凝胶与正极之间）。</li>
	<li>以20 V电压转移20分钟。注意：为确保转移条件均一，10分钟后打开电转模块，将“三明治”结构旋转180°，再继续完成剩余转移。</li>
</ol>
7. 膜交联
<ol>
	<li>配制 6 ml 新鲜的交联溶液（XLS）。用 XLS 浸透一块 10 cm&#160;× 10 cm（大于尼龙膜）的 blotting 纸。注意！ HCl（XLS 的组分之一）具有强腐蚀性。</li>
	<li>拆开印迹装置，将膜置于湿润的 3MM 滤纸上。注意：RNA 不得直接接触浸透溶液的纸。将滤纸和膜夹在两块玻璃板之间，并用保鲜膜包裹。</li>
	<li>在 60 °C 下加热膜 2 小时&#160;，随后用 ddH2O 洗涤。可于 -20 °C 保存，或直接进行&#160;杂交反应。</li>
</ol>
8. 膜预杂交
<ol>
	<li>如果已进行RNA上样量检测（可选步骤5.5），则直接进入杂交步骤。否则，从尼龙膜顶端剪去1 cm，以避免探针与&#160;长链RNA组分</li>
	<li>将10 ml杂交液（HS）预热至37 °C。将1 mg鲑鱼精子DNA于95 °C变性5分钟，冰上冷却后加入HS中。</li>
	<li>将滤膜置于HS中，在杂交炉中37˚C、旋转条件下孵育至少1小时。确保滤膜的RNA面朝向HS。</li>
</ol>
9. 探针合成
<ol>
	<li>按照4.3节所述，对10 pmol的特异性反义寡核苷酸进行磷酸化正向反应。</li>
	<li>向反应体系中加入5倍体积的Tris-EDTA-NaCl（TEN）缓冲液，并通过G-25 Sephadex凝胶过滤层析柱（也可采用乙醇沉淀法）将标记的引物与未掺入的核苷酸分离。探针活性可通过液体闪烁计数器进行检测。</li>
</ol>
10. 膜杂交
<ol>
	<li>用新配制并补充完全的 10 ml 新鲜 HS 替换已耗尽的 HS。将探针在 95 °C 下加热 10 分钟，置于冰上冷却后加入新的 HS 中。将滤膜在 37 °C 下过夜孵育。</li>
</ol>
11. 膜的洗涤
<ol>
	<li>回收杂交溶液，并将其在放射性屏蔽盒中于 -20 °C 保存。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（WB）冲洗滤膜，并在室温下彻底洗涤 10 分钟。</li>
	<li>使用盖革-米勒探测器检测滤膜角落的残留放射性。当本底辐射约为 5 cps 时，进行膜曝光。</li>
</ol>
12. 信号检测
<ol>
	<li>将滤膜置于放射自显影胶片或分子成像仪屏幕上进行曝光。通过 photographic processing 或数字转换显示信号。</li>
	<li>使用专用定量软件（ImageJ 或 Optiquant）分析条带强度。</li>
</ol>
13. 膜剥离
<ol>
	<li>为了去除初级信号，将膜浸入500 ml煮沸的洗脱液中，然后在室温下孵育1分钟。接着进行新的（预）杂交，或将滤膜在-20 °C保存。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

尽管我们对RNA调控神经发生过程中复杂交织机制的理解在不断深入，但基于RNA的调控网络在影响神经干细胞生物学、神经元分化/功能整合、神经系统病理及肿瘤发展中的作用机制仍待探索。这些网络在不同生物界中的保守性凸显了遗传系统在该领域的潜在重要性 黑腹果蝇 对于揭示尚未探索的细胞通路具有重要作用，其中短链非编码RNA和转录因子被视为关键的分子参与者。在此背景下，候选小RNA表达水平的分析是开展精确功能研究的前提：我们近期的研究结果即为一例，表明 Dmel-miR279 调节 gcm/glide 命运决定因子 体内，通过改进的Northern印迹分析法作为表达分析工具来实现。
自1977年首次开发以来51，Northern印迹（NB）一直被视为RNA分析的参考方法。尽管该检测方法存在一些固有的局限性，例如难以转换为多重检测格式或信号定量时可能出现误差，但RNA分子生物学领域的最新突破重新确立了这一传统技术作为“快速且简洁”系统的价值，可用于检测小核糖核酸的内源性表达，或验证功能获得或功能缺失实验策...

近年来，RNA 生物化学领域取得了显著进展1。随着强效非编码核糖调控因子的发现2、新型RNA介导调控机制的揭示3,4以及对已知转录后事件更深入的表征5，我们对RNA在基因表达调控中潜力的认识得到了极大拓展。这些研究共同推动了RNA生物学的迅速崛起，使其成为当前科学领域中的重要研究主题。特别是近年来，我们逐渐认识到“RNA世界”对分子神经生物学6这一现代生命科学中最活跃的研究领域之一所产生的广泛影响。在上个世纪的最后十年，RNA干扰现象7,8以及小调控RNA9,10的发现彻底改变了整个科学格局，尤其是微小RNA（microRNA）11——这类内源性表达的小分子非编码RNA，作为基因表达的多效性与组合性调控因子，几乎参与调控所有细胞功能。
在 Ambros 和 Ruvkun 实验室首次于Caenorhabditis elegans中发现 miRNA 近十年后，随着在Drosophila和人类细胞中鉴定出大量 miRNA，该领域重新受到广泛关注12-15。自那时起，得益于多种转基因技术的应用，Drosophila melanogaster已成为深入研究 miRNA 生物合成及其功能的重要生物学体系。Drosophila中的miRNA被发现参与调控多种昆虫特异性或进化上保守的生物学过程，涵盖从衰老、代谢、信号通路、行为到神经发生等各个方面。沿着这一研究方向，我们近期揭示了主调控基因gcm/glide与RNA通路之间存在一种新的关联16。果蝇转录因子Gcm/Glide17-19是决定细胞命运的一个独特范例，它可决定多能性果蝇神经前体细胞向胶质细胞或神经元命运的分化选择20。过去二十年对该基因的研究明确表明，多种且相互重叠的基因表达调控机制共同作用于gcm/glide21-28，以建立必要的阈值水平，从而在神经系统发育过程中精确平衡神经元与胶质细胞之间的比例。
我们发现，Dmel-miR279 靶向调控代表了参与gcm/glide表达转录后精细调控的又一控制层级16。总体而言，这些研究方向需要特定的方法学改进：多年来，多种最初用于分析传统RNA的技术已被改造用于定量小非编码RNA，例如RNase保护实验、cDNA芯片29-31、实时PCR方法32-35以及测序技术36,37。另一方面，技术方法的重新校准推动了该领域的持续进步。
Northern印迹分析（NB，或RNA凝胶印迹分析）是一个典型实例：该方法广泛用于分析RNA的积累情况，因其既能定量表达水平，又能确定RNA分子大小。然而，该方法固有的灵敏度较低，限制了其在丰度极低的基因表达调控因子（如小RNA）研究中的应用。其不利后果是需要使用大量的总RNA，使得该技术难以应用于某些特定的生物样品。基于上述原因，已开发出多种专门用于小RNA检测的NB变体方法38-40：我们在阐明Dmel-miR279与gcm/glide之间上述相互作用时，采用了经过优化的Northern印迹技术41（ENB，增强型Northern印迹）。
该方法依赖于碳二亚胺衍生物[1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，EDC]的化学交联步骤，将核酸固定在固相载体上。碳二亚胺是一种多功能交联剂，已知可催化活化的羧基或磷酸基团与氨基之间形成酰胺键42。这一特性可用于将小分子RNA通过其单磷酸化的5′-羟基与尼龙膜表面的氨基共价偶联。由此形成的固定化构型提高了固定化核酸的可及性，进而增强探针与靶标的杂交效率，从而显著提升检测灵敏度43。
该技术在黑腹果蝇（Drosophila）的分子研究中具有特殊意义，因为目前正不断发现新型且独特的非编码小RNA类别44。其中，rasiRNA45,46 是一类与Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA47）的特定亚型，参与序列特异性的基因沉默。本文随后将针对微小RNA Dmel-miR279 和 Dmel-miR286 的分析，首次对一种rasiRNA（rasi4）的分析，对该方法的操作细节进行完整描述和可视化展示。我们对该方法进行了极致优化，使其能够在极少量RNA（少于1 μg）中检测到表达水平极低的目标分子。

<table><tbody><tr><td>最终组成/名称</td><td>公司</td><td>目录号（库存）</td><td>备注</td></tr><tr><td colspan="4">通用要求</td></tr><tr><td>离心机，5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>去污剂，RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>适用于玻璃器皿/塑料器皿，擦拭后冲洗</td></tr><tr><td>RNase抑制剂，DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>危险物质 //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">样品制备</td></tr><tr><td>体视显微镜，M60</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA提取/分析</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统，ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>水平电泳仪，Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂，TRIzol试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>危险物质</td></tr><tr><td>PCA（25:24:1），提取时1:1使用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>氯仿，提取时1:1使用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇，沉淀用2.5体积，洗涤用70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>终止混合液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc，pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1× RSB溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% 十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>切勿冷却SDS，以防&amp;nbsp;沉淀 //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml 蛋白酶K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10× 网织红细胞标准缓冲液（RSB）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>变性琼脂糖凝胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% 琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>让凝胶凝固至少1小时 //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10× MOPS缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M MOPS钠盐，pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>切勿将MOPS钠盐与MOPS混淆 //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>琼脂糖上样染料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× MOPS缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>危险物质 //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% 甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>危险物质 //// 75-12-7</td></tr><tr><td>溴化乙锭（EtBr）30 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>危险物质 //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>溴酚蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">小RNA分级分离</td></tr><tr><td>平头凝胶上样吸头</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac浓缩仪</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>垂直电泳仪，Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>变性丙烯酰胺凝胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>危险物质。使用前让凝胶聚合45分钟</td></tr><tr><td>1× TBE缓冲液（或1× MOPS缓冲液）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M 尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% 过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder（10 bp步长）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>标记0.1 &amp;mu;g，如&quot;探针标记&quot;反应中所述</td></tr><tr><td>丙烯酰胺蓝色染料&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% 甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>危险物质 //// 75-12-7</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电泳缓冲液（RB）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× MOPS缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>替代RB：1× TBE缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× TBE缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5× TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM 硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>凝胶染色液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭 0.5 &amp;mu;g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>危险物质 //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1× RB</td><td></td><td></td><td>用EtBr染色15分钟，无EtBr去染15分钟</td></tr><tr><td colspan="4">转膜</td></tr><tr><td>3MM Whatman滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>中性尼龙膜，Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>感光</td></tr><tr><td colspan="4">交联</td></tr><tr><td>交联溶液（XLS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-甲基咪唑（v/v）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>务必每次新鲜配制XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>危险物质 //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1% EDC（w/v）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">（预）杂交</td></tr><tr><td>液体闪烁计数器&amp;nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>剪切鲑鱼精DNA，0.1 mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4反义探针</td><td></td><td></td><td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'</td></tr><tr><td>5s-rRNA反义探针</td><td></td><td></td><td>5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'</td></tr><tr><td>Dmel-miR279反义探针</td><td></td><td></td><td>5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'</td></tr><tr><td>Dmel-miR286反义探针</td><td></td><td></td><td>5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'</td></tr><tr><td>纯化试剂盒，Illustra MicroSpin G-25柱</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>（预）杂交溶液（HS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5× Denhardt溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20× SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M 磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA（pH 8.0）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&amp;nbsp;60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50× Denhardt溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400（w/v）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% 聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1× TEN缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl（pH 8.0）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA（pH 8.0）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>探针标记</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &amp;mu;M 寡核苷酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &amp;mu;l Ci/&amp;mu;l [&amp;gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>危险物质 //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1× T4多核苷酸激酶缓冲液</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶 0.5单位/&amp;mu;l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">洗涤</td></tr><tr><td>盖革-米勒探测器</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &amp;ndash; EM77021</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液（WB），2× SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>严格洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2× SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2× SSPE，0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2× SSPE，0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">信号检测</td></tr><tr><td>PharosFX Plus系统</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>免费提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantity One</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X射线胶片，BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>感光</td></tr><tr><td>X射线胶片显影液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>X射线胶片定影液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">剥离</td></tr><tr><td>剥离溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>煮沸后加入SDS以避免起泡 //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

果蝇（drosophila melanogaster）中微小rna种类的增强型northern印迹检测

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

近几十年来，人们对 RNA 水平基因表达调控机制的科学兴趣迅速增长。分子生物学这一分支的发展在很大程度上得益于非编码 RNA 被发现为转录后调控中的关键参与者。这一革命性观点的形成和推动，伴随着用于分析短链 RNA 表达的强有力技术的发展，这些技术既可用于高通量层面（全基因组范围鉴定），也可用于单个候选分子的分析（特定物种的稳态积累）。尽管目前已有多种前沿策略可用于定量或可视化这些不稳定的 RNA 分子，Northern Blot 检测仍是分子生物学中快速且准确评估 RNA 表达的合适方法。它是在应用更复杂、更昂贵技术之前的第一步，在许多情况下，仍是一种优先选择的方法，可简便地深入了解 RNA 生物学特性。本文概述了一种高效的检测低丰度表达 microRNA（或其他小型调控性 RNA 物种）的实验方案（增强型 Northern Blot） 黑腹果蝇 完整胚胎、人工解剖的幼虫/成体组织或 体外 培养的细胞。所需RNA量极少，也可考虑使用流式细胞术分选的细胞材料。

按照文中所述并以图1示意图表示的整体实验流程，我们评估了不同来源的复杂RNA样品中的小RNA表达。在图1所示实验中，通过蛋白酶K提取法从黑腹果蝇（Drosophila）Schneider 2细胞中分离RNA，通过变性琼脂糖凝胶电泳（可选步骤）检测其完整性，随后进行双份上样。其中一半凝胶样品转移至中性膜并使用EDC进行化学交联；另一半则转移至带正电荷的尼龙膜，随后进行紫外线交联（1.2 × 105 μJ/cm2）。在两种条件下均验证了属于Dmel-miR279家族的两个内源性miRNA（Dmel-miR279本身及Dmel-miR28615）的表达。改进后的方法（ENB）相较于标准方法（SNB）具有更高的检测灵敏度。
两种方法之间的效率差异在图2和图3中表现得更为明显。实验设计原理同上：此处展示了对从成年果蝇睾丸中...

本出版物旨在对从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎、细胞和组织中提取的RNA进行增强型Northern印迹实验的操作步骤进行可视化展示与讨论。该实验方案特别适用于高效检测小RNA分子。

果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

近几十年来，科学界对RNA水平上基因表达调控机制的研究兴趣激增。这一分子生物学分支……

本实验的总体目标是实现对黑腹果蝇胚胎、组织或细胞中少量 RNA 表达的检测。首先从选定的生物样本中提取 RNA，以完成该目标。第二步是通过丙烯酰胺凝胶电泳对 RNA 进行分级，以分辨低分子量 RNA 的迁移模式。接下来，将RNA分子转移并化学交联至中性固相支持物上。最后一步是通过与特异性反义探针退火来标记候选分子。最终，利用放射自显影技术揭示反映被分析分子表达水平的信号。这种未解答的北方区组方法无法回答RNA生物学领域中的关键问题，例如完全表达的RNA分子的稳态水平。首先，将果蝇Schneider 2细胞培养至密度为每毫升1×10⁶至5×10⁶个细胞。随后通过移液使半贴壁细胞脱落，并在100 × g条件下离心1分钟。或者，将胚胎收集到产卵板上。用毛笔和蒸馏水将胚胎洗下，通过双层筛网过滤，然后冲洗并将胚胎收集到离心管中，加入100 µL RNA提取试剂和研杵，充分匀浆样品。按照制造商说明书进行RNA提取。接着，使用紫外分光光度计测定RNA浓度，并根据A260/A280读数确保RNA纯度接近2.0。然后制备变性琼脂糖凝胶，并让凝胶溶液冷却。当温度降至60摄氏度时，加入10毫升10×MOPS缓冲液和8毫升37%甲醛。将凝胶倒入水平电泳槽中。凝胶凝固后，在通风橱中静置一小时，随后将凝胶浸入500毫升1×MOPS缓冲液中。接下来，取两微克RNA样品和一微克DNA标记物，向RNA和DNA标记物中各加入三倍体积的Aros上样染料。将样品在 80 摄氏度下加热 5 分钟，然后立即置于冰上冷却。上样后，在 50 伏电压下电泳运行 1 小时，并间歇性循环缓冲液。在 1× MOPS 缓冲液中配制 10 毫升 10% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，加入 7 摩尔尿素、100 微升 10% 过硫酸铵和 10 微升四甲基乙二胺，立即迅速混匀。将凝胶倒入洁净的玻璃板之间，小心插入加样孔梳子，避免产生气泡。室温下静置45分钟，使凝胶充分聚合后再使用。随后，取每个样品0.5至20微克的总RNA，向每个样品中加入等体积的丙烯酰胺蓝色染料。然后将样品在80摄氏度加热5分钟以进行变性，并在上样前置于冰上冷却。从制胶支架上取下玻璃板，并将其组装到电泳槽中。用500毫升电泳缓冲液（rb）填充内槽和外槽。接下来，轻轻取出梳子，并在200伏电压下预电泳凝胶10分钟。然后用注射器吸取RB缓冲液冲洗加样孔，以去除尿素沉积物。随后使用平头吸头，从每个加样孔底部小心地分层加入样品。样品进入凝胶后，以100伏电压电泳5分钟。随后将电压升至200伏。裁剪六张与转印区域大小相匹配的滤纸，以及一块相同大小的未带电尼龙膜。用转移缓冲液（RB）润湿滤纸和膜，并反复挤压使其充分浸透。接着，从装置中取出凝胶，用刮刀小心打开玻璃板。使用干净的切刀切去加样孔。将一张湿润的沃特曼滤纸放在凝胶上，轻轻抬起凝胶。将尼龙膜置于凝胶的游离面上，并

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科研

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生物学

增强Northern印迹检测小RNA种类的果蝇

RNA干扰技术已被证明在分析Drosophila气管发育中基因功能方面非常有效。本文展示了姜实验室用于将dsRNA注射到果蝇胚胎中以敲低基因表达的详细实验方案。该技术有望用于筛选Drosophila组织和器官发育所必需的基因。...

通过向Drosophila胚胎注射dsRNA进行RNAi干扰

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本文介绍了一种利用分子信标、转盘共聚焦显微镜和开源分析软件，在活体黑腹果蝇（Drosophila...

在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室

本方法展示了利用Northern杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。...

植物微小RNA的检测与定量分析：RNA印迹分析法

Drosophila 是研究调控肌生成关键分子的成熟模型。然而，现有方法尚不足以确定合胞体内部 mRNA...

在单分子尺度上研究肌肉转录动态 黑腹果蝇

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

该方案描述了一种对单核苷酸多态性敏感的荧光原位杂交（SNP-FISH）方法，用于区分源自黑腹果蝇（Drosophila...

单核苷酸多态性敏感的FISH检测法用于果蝇（Drosophila melanogaster）位点特异性核糖体RNA转录的检测

本文介绍了一种高效且节省试剂的成虫盘解剖与抗体染色方案，便于对少量成虫盘进行操作和处理。...

果蝇（Drosophila melanogaster）眼部-触角及翅成虫盘的小规模解剖与抗体染色

学习增强Northern印迹技术检测Drosophila melanogaster小RNA表达的方法。本方案通过RNA提取、丙烯酰胺凝胶电泳分离、化学交联固定及放射性探针标记，实现低分子量RNA的高灵敏度检测，适用于胚胎、细胞和组织样本的RNA生物学研究。

果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

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