Name: 老鼠胎儿整肠文化系统前体内信号通路和绒毛开发的三维实时成像的操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学习小鼠胎儿整肠培养系统，通过三维实时成像技术观察信号通路调控对绒毛发育的影响。该方法利用药理学抑制剂或重组蛋白处理胚胎肠道，结合共聚焦显微镜成像，为研究器官发育机制提供重要工具。

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我们衷心感谢 Deborah L. Gumucio 博士担任我们的指导老师，并在确定培养和成像方法方面提供了宝贵的支持。我们还要感谢 Jim Brodie 博士、Hong-Xiang Lu 博士、Charlotte Mistretta 博士和 Ann Grosse 博士，他们为全肠类器官培养系统的建立做出了贡献。Chip Montrose 博士、Michael Czerwinski 和 Sasha Meshinchi 在成像方面的有益讨论提供了极好的建议。所有成像工作均在密歇根大学显微镜与图像分析实验室完成。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 DK065850 项目的资助支持。

注意：所有小鼠均按照密歇根大学医学院实验动物医学中心批准的方案以及动物使用与护理大学委员会的指南进行人道处理。
1. 全器官培养系统
<ol>
	<li>培养基和培养板的制备
	<ol>
		<li>在组织培养超净台中，从储备瓶中取出5 ml BGJb培养基，加入5 ml青霉素-链霉素双抗溶液。通过向49 ml含双抗的BGJb培养基中加入1 ml 5 mg/ml抗坏血酸，配制50 ml圆底离心管中的工作浓度培养基。</li>
		<li>在每个transwell下方加入1 ml培养基，准备6孔培养板。 
		注意：若未使用全部6个transwell，应将多余的transwell转移至新的无菌6孔板中以备后续使用。向三个10 cm无菌培养皿中各加入3 ml工作浓度BGJb培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖前准备
	<ol>
		<li>将解剖器械浸泡于70%乙醇中，并确保操作过程中器械保持清洁。</li>
		<li>准备好解剖区域，放置一个较大的冰桶，将6孔培养板和含BGJb培养基的10 cm培养皿置于冰上。在解剖及肠道组织准备过程中应尽可能在冰上操作。</li>
		<li>在通过颈椎脱位法处死成年雌性小鼠以获取胎鼠肠道前，先在异氟烷（100 µl）麻醉舱中对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>从母鼠体内取出胎鼠后，根据Theiler分期图表13仔细对每只胎鼠进行分期。不应仅依赖交配后天数来判断胎鼠年龄，因为在同一窝胎鼠中，发育阶段的差异通常可达24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胎鼠肠道的解剖
	<ol>
		<li>在取出肠道前，通过断头法处死胎鼠。</li>
		<li>在1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中解剖每一段肠道，随后将其转移至含工作浓度BGJb培养基的10 cm培养皿中。</li>
		<li>小心地将脾脏从胃部分离，并将胰腺从胃和上段十二指肠区域分离。</li>
		<li>轻柔地分离大网膜，尽可能保留其与肠道的连接，仅分离必要的连接点以使肠道伸直。 
		注意：对于发育阶段晚于E14.5或培养时间超过24小时的肠道，应轻柔地将其分为三个等长片段，以便管腔内容物能够通过肠道并从切口端排出。但对于在E13.5之前开始培养的样本，应在培养24小时后再将肠道分为三段，以允许浆膜层充分覆盖整个肠段。</li>
		<li>使用口吸管将肠段转移至培养板的transwell上（1.1.2）。</li>
		<li>根据需要轻柔调整肠道位置，使其横跨transwell并保持平直。 
		注意：一旦肠道开始推动管腔内容物通过肠管，任何弯曲或折叠都会导致内容物回流并损伤肠道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养与处理
	<ol>
		<li>移除transwell下方的培养基，在其下方加入700 μl处理用培养基（含重组蛋白或药理学抑制剂的工作浓度培养基）。</li>
		<li>将300 μl处理用培养基以滴加方式加至肠道上方，使其缓慢渗透过transwell膜。根据需要重新调整肠道位置。</li>
		<li>每天至少更换一次处理用培养基，更换频率可根据处理试剂的半衰期适当增加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备蛋白负载的琼脂糖微珠以提供局部处理试剂来源
	<ol>
		<li>重悬储存容器中的琼脂糖微珠，取100 µl转移至1.5 ml微量离心管中。</li>
		<li>用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）补满管内剩余体积，混匀微珠进行洗涤。将离心管置于管架上静置数分钟，待微珠沉降后吸除上层PBS。再次用无菌1×PBS充满离心管，并重复洗涤两次。</li>
		<li>将目标蛋白配制成所需处理浓度的两倍浓度。</li>
		<li>将5 µl洗涤后的琼脂糖微珠与5 µl 2倍浓度蛋白溶液混合，并轻柔振荡使微珠充分吸附蛋白。将离心管置于冰上孵育1小时，每隔10–15分钟轻柔混匀一次。</li>
		<li>在将微珠放置于肠道前，用无菌1×PBS短暂漂洗一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖微珠的放置
	<ol>
		<li>使用拉制毛细玻璃针连接的口吸管，轻柔地将琼脂糖微珠放置于肠道表面。操作时需格外小心，粗暴操作会损伤肠道，导致受损区域绒毛无法正常发育。</li>
		<li>放置的微珠数量应为分析所需数量的两倍，因为培养期间肠道会发生蠕动，约有一半的微珠会在培养过程中从肠道表面滚落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养后肠道的固定
	<ol>
		<li>小心移除transwell下方的处理用培养基，让肠道在空气中干燥3分钟。</li>
		<li>在transwell下方加入1 ml固定液固定2分钟，随后在肠道上方覆盖2 ml固定液继续固定。使用4%多聚甲醛在4°C过夜或室温下固定2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 固定肠道的成像
<ol>
	<li>整体成像
	<ol>
		<li>将整个肠道（具有内源性荧光）置于载玻片上，加入 100 µl 1x DPBS。用镊子轻轻排列肠道。</li>
		<li>用实验室擦拭纸小心去除DPBS，立即加入100 µl 70%甘油，以提高组织透明度并增加成像可能深度。 
		注意：如果需要进一步增强肠道的通透性，可不使用70%甘油封片，而是将肠道浸泡于数滴Focus Clear溶液中10–30分钟。用移液器吸去Focus Clear溶液，然后使用Mount Clear封片。</li>
		<li>将盖玻片的四个角分别浸入油灰中，蘸取少量油灰作为载玻片与盖玻片之间的间隔物，以防止盖玻片压平肠组织。</li>
		<li>用棉签将熔化的VALAP涂抹在盖玻片边缘，将其封固于载玻片上。</li>
		<li>在直立或倒置共聚焦显微镜上对肠道进行成像。更多细节请参见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定肠道的振动切片（用于观察肠结构的横截面）
	<ol>
		<li>将肠道包埋于小型塑料模具（10 × 10 × 15 mm）中的7%琼脂糖中，静置冷却并使其凝固。</li>
		<li>从塑料模具中取出琼脂糖块，并使用速干胶将琼脂糖块粘附至振动切片机的样品台。</li>
		<li>用预冷的1×DPBS填充收集板。</li>
		<li>切片厚度为100–150 µm。对于较厚的切片，使用透明溶液（见2.1.2节）以实现对横截面更深层结构的观察。</li>
		<li>将振动切片机切下的切片从收集阶段倒入6孔板的一个孔中，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定组织振片切片的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将5-12个振动切片机切片放入24孔板的每孔中，每孔加入1x DPBS。</li>
		<li>吸除 1x DPBS，每孔加入 500 µl 透化溶液。室温下轻轻振荡孵育 25 分钟。</li>
		<li>透化后，用1×PBS将样品洗涤3次。</li>
		<li>在500 µl封闭液中封闭样品至少30分钟。</li>
		<li>封闭后，将封闭液更换为500 µl用封闭液稀释的一抗溶液，4 °C孵育过夜。 
		注意：适用于冰冻切片和石蜡切片的一抗稀释比例通常也适用于振动切片，但需要进行核抗原修复的抗体通常不适用于本方案例如， BrdU</li>
		<li>次日，用封闭液将样品洗涤3次，每次15分钟。</li>
		<li>洗涤后，加入500 µl用封闭液稀释的二抗。用铝箔纸包裹24孔板，避免荧光染料暴露于光照，并在室温下孵育45分钟至2小时，同时轻轻振荡样品。</li>
		<li>用1×PBS清洗样品3次，每次15分钟，然后按照第2.4节所述方法将振动切片机切取的组织切片装载到载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>振动切片机切片的封片
	<ol>
		<li>通过裁剪双面胶带成细条，并将其沿载玻片的长边放置，为振动切片机包埋制备载玻片。</li>
		<li>将5-10个振动切片置于载玻片上双面胶带之间的100 µl 1x PBS液滴中，小心放置。</li>
		<li>展开所有部分，并将其平铺成单层分布于载玻片上。</li>
		<li>去除多余的琼脂糖或不平整的部分，以免影响盖玻片平稳放置。</li>
		<li>使用实验室纸巾小心吸去振动切片周围多余的1x PBS。</li>
		<li>在振动切片上滴加一滴水溶性封片剂，然后加盖盖玻片。</li>
		<li>用棉签将融化的VALAP涂抹在盖玻片边缘，将其密封固定于载玻片上。</li>
		<li>在正置或倒置共聚焦显微镜上对振动切片机切片进行成像。有关成像系统选择的更多细节，请参见讨论部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 全肠活体成像
在 E12.5 之后取自胎鼠的肠组织，保留相连的网膜完整，利用上述系统在体外培养中可成功发育出绒毛。因此，这种 ex vivo 系统能够获取发育中肠组织的活体 z 轴层析图像，并可重建以随时间观察形态发生的三维结构。
<ol>
	<li>设置活体成像
	<ol>
		<li>使用瞬干胶将单个聚碳酸酯膜粘附到细网筛上。这可提供一个支撑支架，用于在直立式共聚焦显微镜的浸入物镜下方固定肠道。有关活体成像显微镜选择的更多细节，请参见讨论部分。</li>
		<li>将网筛置于培养板的中央孔中。</li>
		<li>将解剖好的肠道放置在聚碳酸酯膜上，并在两端各加一滴瞬干胶。仅使用足够固定肠道的胶量，切勿完全覆盖肠道！</li>
		<li>在培养板中央孔的聚碳酸酯膜下方加入不含酚红的培养基。</li>
		<li>向培养板外圈加入水，以提供湿度环境。</li>
		<li>由于胎鼠肠道在体外培养中会自发产生类似蠕动的收缩波，可在3 ml培养基中加入100 μl 1:5稀释的赛拉嗪（xylazine）PBS（1×）溶液，以在成像期间控制肠道运动。该剂量可在不影响绒毛发育的情况下抑制肠道运动约8–10小时。</li>
		<li>若需获得肠道的横截面视图，可将活体肠道包埋于3–4%琼脂糖溶液中，并使用振动切片机（vibratome）切取厚切片（150–500 µm）。琼脂糖的硬度应与所切肠道组织的硬度相匹配，并根据发育阶段经验性确定。通常，3%琼脂糖适用于E14.5之前的肠道，而4%琼脂糖适用于E15–E16阶段的肠道。</li>
		<li>将振动切片机制备的切片用胶粘附至已固定在网筛上的聚碳酸酯膜（如步骤3.1.1所述），并按照步骤3.1.2–3.1.6所述条件进行培养。</li>
		<li>使用配备可调平台的直立式双光子共聚焦荧光显微镜（激发激光波长范围为690–1,040 nm）进行活体成像。</li>
		<li>将双光子激光调至900 nm可实现最佳GFP信号的深层组织穿透，同时减少成像过程中的组织损伤。此外，将激光功率设置为尽可能低的水平可进一步减少组织损伤。通常，为获得良好的GFP激发效果，建议双光子激光功率设置为12%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium%3A+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li>
<li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li>
<li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+endoderm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li>
<li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Kaibogaku+zasshi+Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li>
<li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li>
<li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li>
<li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li>
<li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li>
<li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).</li>
<li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li>
<li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-%28alpha%29+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li>
<li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li>
<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+house+mouse.+Development+and+normal+stages+from+fertilization+to+4+weeks+of+age%22">The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age</a>. , 2, Springer-Verlag. (1989).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li>
</ol>

作者没有需要披露的财务利益冲突。

发育中肠道的动态特性及其复杂的组织相互作用需要三维可视化，才能充分理解这些形态发生事件。随着成像技术的进步，对绒毛形态发生进行详细观察的能力正在不断发展和完善，从而极大地增强了对器官发生过程中空间通讯与相互作用的理解。
尽管已尝试过其他培养完整肠道的替代方法，但Transwell系统在较长时间培养以及维持正常的细胞簇和绒毛模式方面仍是最为可靠的方法。三维培养系统（如Matrigel或胶原蛋白）适用于较年轻肠道（E12.5-E15.5）的短期培养（少于24小时），但一旦肠道开始出现类似蠕动的运动，并向管腔内分泌酶和代谢废物，三维基质便难以维持结构完整性。液体悬浮培养的肠道组织也能发育，但由于缺乏支撑或空间定位参考，自由漂浮的培养方式似乎会改变细胞簇和绒毛的正常排列模式。因此，研究细胞簇模式形成以及绒毛的出现与延伸时，优先选用Transwell系统。
另一种对活体样本进行整体成像的方法设置要求较低，可使用 minutien 针将胎鼠肠道固定在35 × 10 mm 培养皿底部一层薄薄的7%琼脂糖上。虽然该方法设置更为简便，<stro...

每个肠绒毛由两个主要组织区室构成：上皮表面层和间充质核心。小鼠的小肠在胚胎第10天形成，此时内胚层片层闭合并密封，形成由间充质细胞包围的上皮管状结构3。这一扁平的上皮管迅速增殖，长度和周长均增加，并经历涉及细胞形态动态变化的显著重构过程1。与此同时，周围的间充质也经历多种发育过程，包括血管网的形成、平滑肌的分化以及肠神经元的募集4。在胚胎第14.5天，小肠近端出现对Hedgehog和PDGF有反应的细胞聚集（簇状结构），开始在上皮旁形成2,5。间充质细胞簇的形成持续沿肠道长度方向扩展，至胚胎第16.5天时覆盖整个小肠2。随着间充质细胞簇的形成，紧邻这些簇的上皮细胞开始退出细胞周期，而其他上皮细胞则继续增殖。位于间充质细胞簇正上方、已退出细胞周期的上皮细胞开始改变形状，新生绒毛随之向管腔内弯曲凸起。绒毛的进一步生长部分依赖于新生绒毛之间上皮细胞的持续增殖。间充质细胞簇紧密附着于生长中的绒毛上皮，并持续表达多种信号分子。绒毛的出芽过程随着间充质细胞簇的形成而沿小肠长度方向传播。随着肠道继续生长，绒毛间区域在新生绒毛之间延伸，新的间充质细胞簇在绒毛间上皮旁形成，从而引发新一轮的绒毛出芽与生长6。
上皮和间充质的同步发育对绒毛形态发生至关重要。信号分子由其中一层分泌，被另一层的受体接收并转导信号，从而协调上皮与间充质之间的发育过程。间充质细胞簇作为信号中心，表达多种发育相关的形态发生素7-10。若细胞簇的形成或模式受到破坏，将导致绒毛无法出现及其模式缺失。抑制血小板源性生长因子（PDGF）信号通路会导致细胞簇和绒毛数量减少，且所形成的绒毛形态异常，与异常的细胞簇分布相对应11。 Hedgehog 信号通路的缺失则导致细胞簇完全无法形成，绒毛亦不能启动发育2,12。综上所述，这些数据表明细胞簇在协调绒毛上皮与其间充质核心的发育过程中起关键作用。
利用这种全器官培养系统，我们能够调控上皮-间充质细胞簇之间相互作用所涉及的信号通路，从而确定这些信号在绒毛形态发生中的作用。通过双光子共聚焦光学切片与三维重建技术，可以实现对细胞簇形成及绒毛出现过程的三维可视化，更深入地理解间充质细胞簇与其上方上皮层之间的空间关系。将该培养系统扩展至四维，我们能够随时间连续采集发育中细胞簇和绒毛的z轴堆叠图像，动态观察这些相互作用。最终，以这种方式追踪绒毛发育过程，并观察信号通路改变所引发的变化，将彻底革新人们对绒毛形态发生过程中上皮-间充质相互作用的理解。

<table><tbody><tr><td>精细解剖镊&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;11254-20</td><td>2 对</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× 无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>&amp;nbsp;451007</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 板，24 mm 插件，8.0 mm 聚碳酸酯膜</td><td>Corning Costar&amp;nbsp;</td><td>3428</td><td>每板 6 个插件</td></tr><tr><td>BGJb 培养基</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep，10,000 U/ml 青霉素；10,000 mg/ml 链霉素）</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;15140</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A0278</td><td>配制成 5 mg/ml 储存液，过滤，分装并保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>口吸移液管（Drummond 1-15 英寸吸管组件）</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;21-180-10</td><td>移除吸管组件，并替换为 1,000 &amp;micro;l 移液枪头，作为适配器连接 6 英寸玻璃巴斯德移液管。</td></tr><tr><td>6 英寸玻璃巴斯德移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>拉制成针头</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td></td><td></td><td>用 1× PBS 配制，调 pH 至 7.3</td></tr><tr><td>培养板</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>细密不锈钢筛网</td><td>在五金店购买</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜</td><td>Thomas scientific&amp;nbsp;</td><td>4663H25</td><td>或可从 Corning Costar 3428 Transwell 支持物上切割获取</td></tr><tr><td>瞬干胶</td><td>在五金店购买</td><td>优选凝胶型</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 培养板</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>7% 琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A9414</td><td>用 1× DPBS 配制（w/v），在水浴中加热溶解</td></tr><tr><td>显微销钉（minutien pins）</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>酚红-free 培养基（DMEM）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine，100 mg/ml）</td><td>AnaSed&amp;nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>基底膜基质，生长因子减少型，不含酚红</td></tr><tr><td>3-4% 琼脂糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414</td><td>用 1× DPBS 配制（w/v），在水浴中加热溶解</td></tr><tr><td>固定肠道的成像</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料/设备名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注/说明</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>在药房购买</td><td></td><td>用于制备 VALAP：等量的凡士林、羊毛脂和石蜡</td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>L7387</td><td>用于制备 VALAP：等量的凡士林、羊毛脂和石蜡</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>用于制备 VALAP：等量的凡士林、羊毛脂和石蜡</td></tr><tr><td>70% 甘油（溶于 1× PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear 和 Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&amp;nbsp;F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>模型黏土</td><td>在美术用品店购买</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料模具（10 mm × 10 mm × 5 mm）</td><td>Tissue Tek&amp;nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室擦拭纸</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>无尘精细操作擦拭纸</td></tr><tr><td>Theiler 分期图表&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Leica SP5X 共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>用于进行活体成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 显微镜支架&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>用于进行活体成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水性封片剂（Prolong Gold）</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>材料/设备名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注/说明</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Costar</td><td>&amp;nbsp;3524</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td>用于配制通透液：0.5% Triton X-100 溶于 1× PBS</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td></td><td></td><td>用于配制封闭液：4% 山羊血清，0.1% Tween20 溶于 1× PBS</td></tr><tr><td>Tween20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胎儿全肠培养系统 离体 信号通路调控与绒毛发育的三维活体成像

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

胎儿肠道中的大多数形态发生过程均通过固定组织的切片推断得出，这些切片仅提供了发育不同阶段的静态图像。由于难以对连续切片进行完美重建并保持组织在连续切片间的正确取向，从薄层连续切片中获取三维信息具有较大挑战性。近期Grosse的研究发现 等，2011 年的研究强调了三维信息在理解肠道发育过程中绒毛形态发生中的重要性1单标记肠细胞的三维重建显示，大多数肠上皮细胞同时接触顶面和基底面。此外，对上皮顶面肌动蛋白细胞骨架的三维重建表明，肠腔是连续的，而次级腔室是切片过程中产生的假象。结合肠上皮中存在细胞核周期性迁移的现象，上述两点确立了发育中的肠上皮为假复层上皮，而非先前认为的复层上皮。1三维观察上皮的能力对于证明这一点并重新定义胎儿肠道上皮形态发生具有开创性意义。随着多光子成像技术和三维重建软件的发展，对完整发育器官进行可视化的能力正在迅速提升。双光子激发能够以高分辨率深入组织内部，且对组织的损伤更小。通过对整个胎儿小鼠肠道进行双光子成像和三维重建，在Walton 等，2012 年的研究有助于明确绒毛外凸生长的模式2在此，我们描述了一种可实现全器官培养的系统 离体 绒毛的发育及该培养系统的拓展，以实现肠道在发育过程中进行三维成像。

胎儿肠道全组织外植体培养可用于分析协调肠道发育的信号分子的位置、分布及持续时间，该系统可通过药理学试剂或重组蛋白对信号通路进行操控。Transwell 培养系统（图1A，转载自 Walton 等, 2012)2 提供气液界面，使得可将浸有药物或蛋白质的琼脂糖凝胶珠放置于组织上，从而建立局部信号源（图1B）。在E10至E18.5阶段从胚胎中获取的肠段可在Transwell培养系统中存活，并表现出类似蠕动的波动性运动。从E13.5开始培养的肠段可存活约10天，或大致至出生后第3天（P3），即小鼠发育过程中首次观察到隐窝形成的时间点。尽管早期肠段可在体外培养中存活，但在E12.5之前获取的肠段通常无法稳定形成绒毛，这可能是因为浆膜尚未完全覆盖肠管。在E12.5、E13.5或E14.5开始培养的肠段中，间充质细胞簇形成，绒毛开始出现并逐渐伸长，但其发育进程相较于未培养的同阶段对照组略有延迟。图1，转载自 Walton 等, 2012)2无论培养开始时肠道处于哪个阶段...

改进的成像技术使得在器官发育过程中进行三维成像成为可能。本文介绍了一种完整的器官培养系统，可实现对胎鼠肠道中发育中的绒毛进行活体成像。

胎儿肠道中的大多数形态发生过程均通过固定组织的薄切片推断得出，这些切片提供了发育变化在不同时间点的静态图像……

本实验的总体目标是在体外培养小鼠胚胎肠道的完整器官，从而实现对细胞信号通路的调控。首先，从小鼠胚胎发育第12.5至18.5天的胎鼠中取出肠道组织；第二步，将肠道组织置于Transwell培养板或活细胞成像培养板中进行培养。接下来，用含有细胞信号通路药理学抑制剂的培养基处理肠道，或将浸泡过重组蛋白的琼脂糖小块置于肠道上方，以调控肠道细胞的信号通路。最后一步是对培养后的肠道进行成像，可采用厚切组织切片或整体封片的方式进行观察。最终，通过共聚焦成像结合三维重建，用于观察细胞信号通路的调控如何影响绒毛形成过程中各组织层的发育。该方法的可视化演示至关重要，因为胚胎组织非常脆弱，在解剖和操作过程中需要格外小心。为解剖做准备时，将解剖工具浸入70%乙醇中。 将六孔培养板和含有 BGJB 培养基的 10 厘米培养皿置于冰上。然后取出安乐死胎儿的肠道，依次在一份 X-D-P-B-S 中进行解剖。小心地将脾脏从胃部剥离，然后将胰腺从胃部和上段十二指肠分离。随后，轻柔地分离大网膜，尽可能保持其附着状态，仅分离足够的连接以使肠道得以伸直。然后将样本置于含有工作浓度BGJB培养基的10厘米培养皿中。接下来，使用口吸管将肠段转移至培养板的Transwell小室中。移除Transwell下方的培养基，然后在下方加入700 µL处理用培养基。随后，将300微升处理培养基逐滴加入肠道组织上，使其透过Transwell膜充分渗透。根据处理试剂的半衰期，至少每天更换一次处理培养基，或更频繁地更换。或者，使用拉制的毛细玻璃针和口吸移液管，轻轻将农杆菌微珠放置于肠道组织上。放置珠子时需格外小心，因为粗暴操作会损伤肠组织，导致受损区域绒毛无法正常发育。在此步骤中，将肠组织置于小型塑料模具中的7%明胶（aros）中包埋，并使明胶（aros）块冷却凝固。随后，将明胶（aros）块从塑料模具中取出。用快干胶将 aros 模块粘接到 Vibram 收集台上。接着，用冰冻的 1×DPBS 填充收集台。以 100 至 150 微米的厚度切片。然后将收集阶段的切片转移至六孔板的一个孔中，于 4°C 保存。为准备载玻片以进行封片，沿每张载玻片的长边贴上双面胶带，并在其上滴加一滴 1× PBS。然后小心地将五到十个切片放置在载玻片上。将所有切片展开，并铺成单层，均匀分布于载玻片表面。去除任何多余的组织或不平整的部分，以免影响盖玻片平整贴合。小心使用实验室纸巾吸去组织周围多余的1×PBS。接着，在组织上滴加一滴水溶性封片介质。然后将盖玻片盖在样品上，并用融化的封片剂将其密封固定在载玻片上。随后，使用正置或倒置共聚焦显微镜对组织切片进行成像。接下来，使用瞬干胶将单个聚碳酸酯膜粘附到细网筛上。将网筛放置于培养板中央孔的中心位置。然后将解剖好的肠段置于聚碳酸酯膜上，并在膜的每一端滴加一滴瞬干胶。接着，在培养板中央孔的聚碳酸酯膜

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科研

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Biology

生物学

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含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

学习小鼠胎儿整肠培养系统，通过三维实时成像技术观察信号通路调控对绒毛发育的影响。该方法利用药理学抑制剂或重组蛋白处理胚胎肠道，结合共聚焦显微镜成像，为研究器官发育机制提供重要工具。

小鼠胎儿全肠培养系统离体信号通路调控与绒毛发育的三维活体成像

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