老鼠胎儿整肠文化系统前体内信号通路和绒毛开发的三维实时成像的操作

该程序的总体目标是在体外培养小鼠胚胎肠道的全器官培养物，从而允许调节细胞信号通路。这是通过在胚胎第 12.5 至 18.5 天之间首先从胎儿中收获小鼠肠道来实现的。第二步是将肠道置于 transwell 培养或活成像培养板中。

接下来，用细胞信号通路或位置的药理学抑制剂制备的培养基处理肠道。用重组蛋白浸泡的 aro 加速以改变肠道顶部的细胞信号传导。最后一步是将培养的肠道成像为厚 viome 切片或孔安装。

最终，共聚焦成像后进行三维重建，用于可视化细胞信号通路的调节如何影响绒毛形成过程中组织层的发育。这种方法的视觉演示至关重要，因为胚胎组织非常脆弱，在解剖和处理过程中需要非常小心。为了准备解剖，将解剖工具浸泡在 70% 乙醇中。

将六孔培养板和装有 BGJB 培养基的 10 厘米培养皿置于冰上。然后从安乐死的胎儿中取出肠道。在一 X-D-P-B-S 中一一剖析它们。

小心地从胃中取出脾脏，然后从胃和十二指肠上部取出胰腺。之后，轻轻分离网膜，尽可能多地保持连接，并将连接分开，只允许肠道伸直。然后将样品放入装有工作 BGJB 培养基的 10 厘米培养皿中。

接下来，使用口腔移液器将肠块转移到培养板的 transwell 上。从 transwell 下方取出培养基。然后在反式下加入 700 微升处理培养基。

随后，在肠道上滴加 300 微升处理培养基，并使其浸透 transwell。根据处理试剂的半衰期，每天至少更换一次或更频繁地更换处理介质。或者，使用带有拉动毛细管针的口腔移液器轻轻地将农用珠子放在肠道上。

放置珠子时要格外小心，因为粗暴处理会损坏肠道并防止受伤区域出现绒毛。在此过程中，将肠道嵌入小塑料模具中的 7%aros 中，并让 aros 块冷却和凝固。然后，从塑料模具中取出 aros 块。

用即时胶水将 aros 块粘在 Vibram 收集台上。接下来，用冰冷的 X-D-P-B-S 填充收集阶段。以 100 至 150 微米的厚度切割切片。

然后将切片从收集阶段转移到六孔板的孔中，以便在 4 摄氏度下储存。要准备安装载玻片，请沿每张载玻片的长载玻片粘贴双面胶带。在上面滴一滴 XPBS。

然后小心地将 5 到 10 个部分放在载玻片上。展开所有部分并将它们摊到一个图层上。穿过滑梯。

去除任何多余的 aros 或不均匀的碎片，以防止盖玻片平躺。小心地使用实验室纸巾从切片周围吸收多余的 XPBS。接下来在切片顶部滴一滴水性封固剂。

然后将盖玻片盖在上面，并用融化的 vap 将其密封在载玻片上。然后，在正置或倒置共聚焦显微镜上对 viome 切片进行成像。现在使用速溶胶将单个聚碳酸酯膜粘附到细网筛上。

将网筛放在培养板的中心孔中。然后将解剖的肠道放在聚碳酸酯膜上，并在每一端滴入速溶胶。接下来，在培养板中心孔的聚碳酸酯膜下方添加不含酚红的培养基。

在培养板的外缘加水以提供湿度。由于胎儿肠道在培养中经历蠕动波状收缩波，因此将 100 微升甲苯噻嗪溶液添加到板中心孔的 3 毫升培养基中，以控制成像时肠道的运动。在直立支架上使用双光子共聚焦荧光显微镜进行实时成像。

此处显示的是新鲜收获的 E 14、E 15 和 E 16 十二指肠组织的横截面，用 ecat 和 dpi 染色。该肠段在 E 14 收获并培养两天。在 E 14 时，未建模的上皮仍然是伪分层的。

两天后，可以看到 VII，尽管与 VII 相比略有延迟。在 E 16 处，这是 E 14 十二指肠中 pcam 染色脉管系统光学切片的三维重建，该图显示了来自抗体免疫荧光染色的 E 15.5 viome 切片肠道共聚焦图像的三维重建。看完这个视频，你应该对如何解剖胚胎组织、设置肠道进行全器官培养以及为组织进行高质量的三维成像做准备有了很好的了解。