多模态光学显微镜方法在加勒比海礁珊瑚显示息肉组织形态和结构

以下实验的总体目标是对 1 到 2 毫米厚的珊瑚息肉进行 3D 成像，以了解精细结构以及珊瑚色素及其定位。这是通过首先将样品包埋在蜡中，然后使用切片机将样品切成 1 微米的切片来实现的。接下来，使用定制设计的连续块面技术对珊瑚息肉进行成像并重建 3D 图像。

使用多个 2D 图像，获得的结果表明该技术能够在不影响其结构完整性的情况下解析珊瑚组织的精细结构细节。演示程序。今天将是 Maunde Siva guru 博士，他是我研究小组的合作者。

为了准备预过滤蜡，将 3.6 克阉牛熔化在热板上的玻璃烧杯中。接下来，加入 400 毫克苏丹。4 为了尽量减少蜡背景荧光，充分混合并等待获得红色半透明溶液。

然后加入 81 克石蜡并充分混合。随后，加入 15 克白色颗粒状 VI 棒，并在同一个烧杯中完全融化。融化后，再次混合以获得完全混合的蜡溶液。

现在将混合物加入玻璃瓶中，并用盖子松散地关闭。将玻璃瓶放入 60 摄氏度的对流烤箱中，以保持成分处于液态并发生所有渗透。该溶液可制成 200 毫升，并分装成两个 100 毫升的瓶子。

一个用于渗透，一个用于最终嵌入加勒比珊瑚礁建造珊瑚样本，从 AU 收集，并在野外用对位甲醛固定。为了将珊瑚组织嵌入 SBFI，首先清洗在田间收集的珊瑚息肉，并将它们在 4 摄氏度下储存在对位甲醛中。之后，当准备好成像时，将它们在 PB S3 中洗涤 5 次，每次 5 分钟。

在 ex Cal 2 溶液中对息肉脱钙 24 小时或直到息肉完全不含碳酸钙。将几个脱钙的珊瑚息肉作为一个块在 25、50、75 和 100% 乙醇系列中孵育，然后孵育一个 x 二甲苯。每次 30 分钟以使样品脱水。

接下来，将加工过的息肉放入 100% 二甲苯中。在 65 摄氏度的烤箱中替代 30 分钟。然后，更换为新鲜溶液并再孵育 30 分钟。

调整息肉的方向，使顶部朝下，表面尽可能平坦。制作 2 对 1、1 对 1 和 1 对 2 的解决方案。二甲苯替代品和预过滤蜡。

在 50 毫升 Falcon 试管中，将珊瑚息肉与这三种浓度递增的预过滤蜡一起孵育，然后在 100% 预过滤蜡中孵育 3 次，每次 30 分钟至 1 小时。现在将样品转移到包埋蜡中。30 分钟后去除包埋蜡，然后换上新鲜的包埋蜡，并在 65 摄氏度下继续孵育至少 4 小时。

之后，拍摄街区。这是必要的，因为一旦嵌入蜡中，样品的位置就会变得不可见，因为嵌入的红色蜡是不透明的。接下来，将小滴高熔点蜡放在新的预热不锈钢包埋模具周围，并让它冷却。

从第二份试样中倒入少量新鲜融化的床上用品蜡，然后将珊瑚息肉正面朝下快速放在白色蜡点上。然后将塑料样品架放在不锈钢托盘上，倒入更多的包埋蜡，使蜡浮到塑料模具的表面。现在将整个装置从 65 摄氏度的烤箱中取出，让它在长凳或凉爽的表面上冷却，直到蜡完全变硬。

之后，将干燥的块放入 4 摄氏度的冰箱中，避光长期存放以切块。首先，修剪并切下一微米的截面。使用切片机捕获包含样品的光滑块面的图像。

每次。去除切片后，当白色蜡开始消失时，样品就会出现。然后用单色相机使用合适的荧光滤光片捕获图像，以从每个样品中采集发色团或珊瑚息肉图像的自发荧光，即三到四个脱钙核心。

要进行双光子荧光成像，请使用 780 纳米的双光子激光以两种不同的放大倍率对 3 到 4 个息肉进行 10 倍物镜，将洗涤过的珊瑚息肉核心倒置在 4% 对甲醛中。接下来，使用平铺扫描模式在 XY 中以 10 或 20 微米的间隔收集每个焦平面大约 25 到 100 张图像。然后以 50 或 100 微米的间隔通过 Z 轴收集 20 到 20 张图像，每个珊瑚息肉总共大约 5， 000 到 10， 000 张图像。

在该图像之后，三到四个息肉区域代表核心和珊瑚物种。然后将所有图像以原始数据格式存储在系统的硬盘上。在此过程中，通过使用方形裁剪工具聚焦单个息肉来裁剪 2D 数据以减小文件大小，并将其编译为单个 TIF 文件。

在采集软件中。在体积算法项目下的 EMERIS surpass 程序模块中打开 SBFI 数据的组装文件或两个光子光学切片的平铺多个 Z 堆栈，SBFI 数据以 3D 形式呈现。使用阴影投影，创建等值表面模式，其中体素是创建实体表面图案的阈值。

在 XY xz 和 YZ 正交模式下使用裁剪普通算法可视化 3D 投影，以揭示珊瑚的 3D 结构和形状。然后使用关键帧动画模块对投影进行动画处理。在同一个 erris 程序中，生成压缩率为 5% 的视频文件，并使用体积 3D 和等值面模态生成 VI 格式的影片剪辑。

以下是来自 M Anis 和 M fa Lata 的珊瑚息肉的两张光子荧光 3D 图像。这两张图像是使用两个光子激光器的 780 纳米激发和从 450 到 700 纳米收集的光信号捕获的，没有分量光谱分离，并且这两个图像是用相同的激发收集的，但同时使用两个光电倍增管探测器来收集来自两个分量的数据， 一个从 500 到 550 纳米，另一个从 650 到 720 纳米。这些是深度涂层图像。

红色是 2D 中最浅的分量，蓝色是最深的分量。是的。在尝试此程序时，请务必记住正确制备红蜡包埋样品。连续块面部成像和双脚荧光显微镜相结合，可以在各种晶状体尺度上分析珊瑚色素沉着和细胞结构。

看完这个视频后，你应该对如何处理和成像造礁珊瑚及其三维光谱特性有了很好的了解。