Name: Microstereolithography和静电结合，以产生膜配备有利基的角膜再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 了解微立体光刻与静电纺丝结合技术，用于制备具有微孔结构的PLGA角膜再生膜。该方法通过创建不可降解模板并电纺生物可降解膜，模拟天然干细胞微环境，为组织工程和角膜再生研究提供新途径。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们衷心感谢惠康信托印度平价医疗项目对本研究的资助，以及工程与物理科学研究委员会为伊莉达·奥尔特加提供的景观研究员项目资助，同时感谢The Electrospinning Company Ltd.的贡献。

伦理声明：本研究中使用的眼球均遵循动物研究公开性声明：
1. 制备带有微口袋的PLGA可生物降解膜
<ol>
	<li>环形支架通过微立体光刻与静电纺丝技术相结合的方法制备而成31本质上，该过程可概括为2&#160;部分（i）通过微立体光刻技术制备PEGDA模板，以及（ii）在模板上进行静电纺丝以复制底层PEGDA结构（本例中为微加工环状结构）。以下将详细描述这两个步骤。图1 和 2).
	<ol>
		<li>利用微立体光刻技术（microSL）制备PEGDA模板
		<ol>
			<li>使用2制备环状结构&#160;层状模型，其中第一层（L1）为结构的基底，第二层（L2）具有6个马蹄形微腔，尺寸范围为300–500 µm。该研究团队近期已描述了PEGDA环的制备方法22.
			<ol>
				<li>使用任何合适的绘图程序绘制一个直径为1.2 cm的黑色圆形，创建L1。</li>
				<li>以相同方式创建 L2，但包含 8 个白色的 0.5 × 0.35 mm 马蹄形结构。将这些白色小马蹄形分布在黑色圆形结构内。</li>
				<li>将L1和L2保存为JPEG格式。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>在避光的玻璃小瓶中，将聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，Mn = 250 g/mol）与1%（w/w）光引发剂樟脑醌置于磁力搅拌器上混合，持续搅拌20分钟。</li>
			<li>使用望远镜式透镜组扩束微立体光刻装置的激光束，然后将其投射至计算机可编程的数字微镜器件（紫外光兼容DMD开发套件）上。注意：DMD通过焦距为10 cm的管镜将图像（本例中为环形）反射至一面镜上，该镜再将图像导入含有光固化聚合物（PEGDA）的小瓶中。</li>
			<li>调节并仔细清洁微立体光刻装置的光学元件。</li>
			<li>将300 µl PEGDA混合物加入12孔细胞培养板的一个孔中。确保孔预先包被有聚四氟乙烯（Teflon）或其他防粘材料，以便在固化后易于取出结构。</li>
			<li>打开蓝色激光器（MBL-III 473 nm；150 mW），并将L1导入先前安装在计算机上的ALP3-basic软件中。照射第一层60秒。注：ALP3-basic是一种USB接口，用于连接计算机与数字微镜装置。</li>
			<li>向孔中再加入 250 µl PEGDA，按上述方法加载 L2，并对 L2 照射 60 秒。</li>
			<li>去除未固化的聚合物，并用异丙醇过夜清洗环状物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>利用静电纺丝技术制备可生物降解的PLGA膜 
		注意：PEGDA 环用作模板，在其表面进行PLGA的静电纺丝，PLGA在纺丝过程中复制了模板的底层形貌。纺丝完成后，将PLGA聚合物膜从收集器上剥离。最终的PLGA膜中不含PEGDA环，PEGDA环仍附着在金属收集器上。
		<ol>
			<li>将聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）环分布在电镀铝板（12 cm × 20 cm）上，以制备静态静电纺丝收集器。</li>
			<li>使用导电碳胶带固定环状物。注意：这些环状物一旦制成，可作为静电纺丝的模板重复使用。</li>
			<li>配制用于纺丝的聚合物溶液。将PLGA（50/50 DL-丙交酯（52 mol%）：乙交酯（48 mol%），44 kg/mol）溶于二氯甲烷（DCM）中，配制成20% w/w浓度的溶液。</li>
			<li>使用前搅拌过夜。</li>
			<li>放置 4&#160;胰岛素注射器（钝头，内径0.8 cm针头）连接至注射泵。注意：使用四个注射器比单个注射器可实现更快的静电纺丝。</li>
			<li>每个注射器中装入2.5 ml PLGA溶液。</li>
			<li>使用30 µl/min的流速和12至15 kV的电压进行电纺。针头与收集器之间的距离保持15 cm。</li>
			<li>电纺1小时30分钟，最后小心地将PLGA电纺膜从支撑PEGDA环的收集器上剥离。</li>
			<li>使用圆形打孔器将电纺支架切割成直径为22 mm的圆片，并使环状结构位于中心位置。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PLGA 微加工膜的长期储存
注意：PLGA 环由经认证的外部公司制备并灭菌；样品在外部接受 25–40 KGy 的辐照剂量范围进行辐照。
<ol>
	<li>将膜固定在一个小型容器（塑料培养皿）中，并将其放入医用级包装袋内。</li>
	<li>使用滤纸制作干燥剂的小型滤纸袋。制作方法为：将滤纸（直径125 mm）对折成半圆形，再将半圆形剪成两半；然后用胶带将两端密封。
	<ol>
		<li>分别在三个滤纸袋中装入1 g&#160;橙色硅胶、氯化钴(II)和硫酸铜(II)。</li>
		<li>将三个干燥剂袋与静电纺丝膜一同放入医用级包装袋中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在袋内加入一张市售的六点湿度指示卡，用于检测储存期间是否出现湿气积聚。</li>
	<li>使用真空热封机对包装袋进行抽真空并密封。</li>
	<li>将环形膜送至外部公司进行γ射线辐照灭菌。</li>
	<li>将经γ射线辐照的PLGA膜储存在含5% CO2的培养箱中的潮湿环境中，储存温度范围为-20 °C至+37 °C。</li>
	<li>储存结束后，检查湿度指示卡，确认湿度水平低于30%。</li>
	<li>采用扫描电子显微镜（SEM）评估纤维结构的完整性。</li>
</ol>
3. 角膜缘外植体的分离
从饲养用于食用的兔子所获取的眼睛中分离出兔角膜缘组织块。
<ol>
	<li>使用3%的消毒液对兔眼进行消毒。</li>
	<li>清除角膜周围多余的组织，清洁眼睛。</li>
	<li>在解剖显微镜下分离角膜缘区域（识别为角膜（透明）与巩膜（白色）之间的一圈细环形区域）与其余角膜组织。</li>
	<li>在解剖显微镜下将组织切成约1.5 cm长的片段。</li>
	<li>将角膜缘片段置于1.5%消毒液中消毒1分钟。</li>
	<li>用手术刀片将角膜缘片段切割成小块（100–500 µm）。</li>
	<li>将组织小块保存在培养基（DMEM+Glutamax: Ham´s F12 (1:1)，10%胎牛血清，1 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，2.5 µg/ml两性霉素，10 ng/ml EGF，以及5 µg/ml胰岛素）中，于37 °C、5% CO2 条件下保存至使用（不超过60分钟）。</li>
</ol>
4. 角膜缘外植体细胞的生长
将兔角膜缘组织块分别置于新制备的微加工膜以及经真空包装并在 -20 °C 下储存 6 个月的微加工膜上。
<ol>
	<li>使用细胞刮刀将15 µl纤维蛋白胶（人血浆纤维蛋白原与人血浆凝血酶按1:1比例混合，纤维蛋白原浓度为18.75 mg/ml，凝血酶浓度为2.5 U/ml）均匀涂布于环形支架上。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用25 G&#160;针头将组织外植体直接放置于PLGA微孔中。</li>
	<li>轻柔加入细胞培养基，避免外植体脱落。
	<ol>
		<li>每3天更换一次培养基（培养基配方见第3.7节），在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用3.7%缓冲甲醛固定样品10分钟&#160;，随后用PBS洗涤3次。</li>
	<li>在室温下用1 µg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或碘化丙啶（PI）孵育10分钟&#160;进行复染。</li>
	<li>用PBS洗涤3次，将样品用铝箔覆盖后保存。</li>
	<li>使用荧光显微镜在543 nm和800 nm（双光子）波长下对样品成像。</li>
</ol>
5. 建立兔角膜损伤三维模型
<ol>
	<li>按上述方法清洁并消毒兔眼。</li>
	<li>将兔眼浸入0.14%氢氧化铵溶液中5分钟，以造成眼部损伤。</li>
	<li>用PBS冲洗眼睛，并用角膜刀刮除上皮层。</li>
	<li>切除并分离角膜-巩膜纽扣组织，去除所有残留组织。</li>
	<li>将角膜上皮面朝下放置于无菌小杯中，并加入用DMEM配制的0.5%琼脂溶液。</li>
	<li>待琼脂凝固后，将角膜上皮面朝上放入小培养皿中，并加入培养基（配方见上文），液面至角膜缘区域即可。注意：不要完全覆盖整个角膜；保持器官培养处于气-液界面状态。</li>
</ol>
6. 兔角膜三维模型中角膜缘外植体的分离及环形支架的包埋
<ol>
	<li>用细胞刮刀按照上述方法，将15 µl纤维蛋白胶（纤维蛋白原浓度为18.75 mg/ml，凝血酶浓度为2.5 U/ml，按1:1比例混合）涂覆于环形膜上。</li>
	<li>使用25 G针头和解剖显微镜，将组织外植体直接放置于PLGA微口袋上。</li>
	<li>将带有组织外植体的环置于去上皮的角膜上，外植体朝上，并置于气-液界面条件下（此条件此前已有描述22）。</li>
	<li>将器官培养模型置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养4周，每2天更换一次培养基。</li>
</ol>
7. 角膜再生与干细胞维持的评估
<ol>
	<li>4&#160;周后，使用3.7%甲醛固定角膜。</li>
	<li>将角膜进行常规组织学处理，制备6 µm厚的石蜡切片。</li>
	<li>用苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色。</li>
	<li>进行免疫细胞化学染色时，将切片在二甲苯中脱蜡（3分钟），然后依次在100%乙醇（1分钟）、70%乙醇（1分钟）和蒸馏水中再水化（2分钟）。</li>
	<li>使用Dako笔标记切片区域，以限定小范围区域并避免抗体过度使用。
	<ol>
		<li>在标记区域内加入0.05%胰蛋白酶（100 µl），37 °C孵育20分钟&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS充分洗涤，加入100 µl 10%山羊血清（封闭液），室温孵育1小时。</li>
	<li>将样品与100 µl小鼠单克隆抗体角蛋白3（CK3）和100 µl p63抗体溶于1%山羊血清中，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>用PBS洗涤后，加入100 µl生物素标记的二抗（抗小鼠抗体，1:1,000稀释于1%山羊血清中），室温孵育1小时。</li>
	<li>加入100 µl FITC标记的链霉亲和素（1:100稀释于1%山羊血清中），室温孵育30分钟。</li>
	<li>按照上述方法用DAPI对样品进行处理。</li>
	<li>使用荧光显微镜在800 nm（双光子）和488 nm波长下对样品成像。</li>
</ol>

<ol><li>Ambati, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+avascularity+is+due+to+soluble+VEGF+receptor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1.</a> Nature. 443, 993-997 (2006).</li>
<li>Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReinach%2C+P+%22Ch+2%2C+Ocular+Transporters%22">Ch 2, Ocular Transporters</a>. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).</li>
<li>Kinoshita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+Human+Ocular+Surface+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).</li>
<li>Fatt, I., Bieber, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady-state+distribution+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+the+in+vivo+cornea%3A+I.+The+open+eye+in+air+and+the+closed+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye.</a> Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).</li>
<li>Shortt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Limbal+Epithelial+Stem+Cell+Niche%3A+Novel+Imaging+Techniques+Permit+In+Vivo+Observation+and+Targeted+Biopsy+of+Limbal+Epithelial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells.</a> STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+crypts%3A+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).</li>
<li>Thoft, R. A., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X%2C+Y%2C+Z+hypothesis+of+corneal+epithelial+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmolog.%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance.</a> Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).</li>
<li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+epithelial+repair%3A+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).</li>
<li>Djalilian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Notch+signaling+during+corneal+epithelial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation.</a> Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).</li>
<li>Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+Stem+Cells+of+the+Corneal+Epithelium.+Survey+of+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Survey%22%5BJournal%5D)">Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology.</a> Survey. 44, 415-425 (2000).</li>
<li>Dravida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomimetic+scaffold+for+culturing+limbal+stem+cells%3A+a+promising+alternative+for+clinical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).</li>
<li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+Stem-Cell+Therapy+and+Long-Term+Corneal+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).</li>
<li>Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivated+corneal+epithelial+stem+cell+transplantation+in+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders.</a> Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).</li>
<li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+cultivating+limbal+derived+corneal+epithelium+on+human+amniotic+membrane+for+clinical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).</li>
<li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+transplantation+for+the+management+of+corneal+epithelial+defects%3A+an+in+vivo+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study.</a> British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).</li>
<li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Stromal+Integration+of+Multilayer+Amniotic+Membrane+Transplantation+in+Corneal+Ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers.</a> American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).</li>
<li>Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane transplantation.</a> British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).</li>
<li>Gicquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Variations+in+Amniotic+Membrane+Used+for+Ex+Vivo+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).</li>
<li>Connon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variation+in+transparency+of+amniotic+membrane+used+in+ocular+surface+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).</li>
<li>Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+for+Ocular+Surface+Reconstruction%3A+Donor+Variations+and+the+Effect+of+Handling+on+TGF-%CE%B2+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmolog.%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content.</a> Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).</li>
<li>Sitalakshmi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Cultivation+of+Corneal+Limbal+Epithelial+Cells+in+a+Thermoreversible+Polymer+%28Mebiol+Gel%29+and+Their+Transplantation+in+Rabbits%3A+An+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).</li>
<li>Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microfabricated+artificial+limbus+with+micropockets+for+cell+delivery+to+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea.</a> Biofabrication. 5, (2013).</li>
<li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+poly%28lactide-co-glycolide%29+electrospun+scaffolds+to+deliver+cultured+epithelial+cells+to+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea.</a> Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).</li>
<li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).</li>
<li>Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineering+Hydrogels+for+Stem+Cell+Bioengineering+and+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Charlottesv+Va%22%5BJournal%5D)">Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration.</a> Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+Materials+for+Controlling+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate.</a> Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).</li>
<li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li>
<li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li>
<li>Truckenmüller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li>
<li>Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li>
<li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

本研究介绍：（a）一种制备含有内嵌微结构的电纺膜的技术；（b）如何通过真空包装、γ射线辐照及储存等步骤，使此类膜材料达到临床应用要求。在本项具体应用中，我们开发了含有微口袋结构的PLGA膜，该结构可模拟角膜缘干细胞生态位的物理特征。本研究的目的在于：（i）介绍相关方法，使读者能够掌握设计和制备含微结构支架的知识，以开展关于干细胞生态位在组织再生中作用的研究；（ii）帮助读者更好地理解如何长期储存电纺支架材料。
就临床应用而言，环状膜的储存至关重要。本研究中，对环状膜的降解情况进行了为期6个月的观察。膜的降解由水解作用驱动，因此只需保持膜处于无湿气环境，即可中止降解过程。Blackwood 等&#160;报道指出，通过改变聚乳酸（PLA）与聚乙醇酸（PGA）的比例，可改变膜的降解性能32本研究还表明，通过增加聚谷氨酸（PGA）的用量，电纺膜的降解速率也随之提高 体内22在此已证明，将带有微囊的膜与一些干燥剂一同真空包装，经辐照后于低温下保存6个月，纤维完整性和降解程度均未发生改变。目前，对于此类含微囊的膜，我们最长仅研究了6个月的保存效果，但在-20 °C条件下对普通静电纺丝膜的保存数据已有长达1年的报道。22 我们目前已有未发表的数据表明，这些膜在 -20 °C 下保存 2 年未出现任何降解迹象。因此，长期储存建议在 -20 °C 下干燥保存；但在室温下保存也是可行的，即使在印度，至少可稳定保存 6 个月（可能更长时间）。包装中加入湿度指示剂可方便地监测膜是否保持干燥状态，在此情况下，膜仍适用于预期用途。
将角膜缘外植体置于微口袋内时，观察到这些环中的细胞向三维角膜模型迁移。该团队近期报道了细胞向三维角膜模型的转移 体外 通过将角膜组织块置于无环状结构的PLGA膜（即普通PLGA膜）上构建兔角膜模型24利用当前的微加工支架，细胞转移技术已更进一步，现在可将组织外植体精确定位于微结构特征区域内。将外植体直接放置于微环境中的能力，使外科医生能够在手术室内直接使用这些膜材料，从而避免了在洁净室中先行扩增角膜缘干细胞的必要性。尽管本研究工作主要集中于开发用于角膜疾病治疗的装置，但该微加工技术亦可应用于开发多种其他用途的医疗器械。未来的研究将探索用于皮肤、骨骼等其他组织再生的构建物的制备。
尽管PEGDA微结构的设计和初始制备可能耗时较长，但一旦制备完成，这些结构可多次重复使用而不会发生降解。因此，在集电器组装完成后，通过静电纺丝后续制备PLGA微结构可生物降解膜的速度可与制备普通（“无结构”）膜相媲美。虽然本研究中采用微立体光刻技术来制备模具，但也可使用其他制造方法，如3D打印或注塑成型。相应地，模具基体也可由其他聚合物或金属材料制成，而不仅限于PEGDA。因此，该技术具有很高的灵活性，研究人员可根据自身需求和实验条件轻松调整该方法。
本研究所使用的in-house微立体光刻装置无法制备特征尺寸小于30µm的结构；这对于本文所述的角膜应用而言并非限制，但在其他模型的设计中可能至关重要。在此情况下，双光子聚合（2PP）等技术可能更具优势，然而静电纺丝技术可能难以实现亚微米尺度结构的复制（本课题组目前正在对此进行研究）。
制备过程中的关键步骤包括：（i）避免聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）模板过度固化，可通过调节光照时间和光引发剂用量来控制；（ii）控制静电纺丝条件，如温度和湿度；（iii）使用真空包装和干燥剂妥善保存静电纺丝环状膜。
综上所述，通过将角膜缘组织外植体置于膜的微结构内，我们已证实外植体在生态位区域出现细胞迁移生长，细胞可转移至兔损伤角膜并实现角膜的后续再上皮化。此外，还研究了在不同温度下储存的膜的降解情况，并建立了一种可实现膜长期储存的包装方案，后者对于开发用于临床的膜材料至关重要。

角膜是眼球最外层的无血管组织，是参与视觉功能最重要的组织之一1。多种细胞共同维持角膜的正常功能。角膜最表层由上皮细胞构成，厚度约为5至7层2。该层可防止细菌侵入角膜3，并允许氧气进入4。研究表明，角膜上皮干细胞位于角膜周边区域称为角膜缘（limbus）的微环境或隐窝中，这些隐窝大小约为120–150 µm5,6。当干细胞分裂时，其子代细胞（即短暂扩增细胞）会从隐窝中迁移而出；随着持续分裂，这些细胞向心性地向内和向上移动，最终在中央角膜区域形成终末分化的细胞7,8。这些表层细胞会随着眨眼被不断清除，暴露出下方更新的细胞9。
除了是上皮干细胞的所在位置外，角膜缘还具有阻止血管化的结膜侵入角膜区域的作用10。角膜缘的损伤可能由热/化学烧伤、辐射以及遗传性疾病引起10。当发生此类损伤时，角膜缘屏障被破坏，结膜细胞得以迁移至角膜表面，导致该区域血管化，严重时可引起疼痛甚至失明。这种病症被称为角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）10。
已有多种天然基质被报道可作为干细胞载体，用于辅助角膜再生。例如，Dravida 等11 使用了基于胶原的膜材料，而Rama及其同事12在一项涉及112名患者的研究中报道了纤维蛋白的应用。然而目前最常用的治疗方法是使用来自组织库的人羊膜，并在其表面培养角膜缘上皮细胞13,14。当形成单层细胞后，将羊膜以细胞面朝上的方式粘附于受损角膜表面，此前该角膜已通过手术清除全部结膜细胞和瘢痕组织14。羊膜在数周至数月内逐渐降解，使上皮细胞附着于裸露区域，从而实现上皮再生15,16。该技术在恢复视力方面已取得成功，但仍存在一些实际问题，限制了其在临床上的广泛应用。由于羊膜属于人体组织，因此在用于患者细胞移植前，必须按照良好的组织库规范进行筛查。此类筛查仅能降低疾病传播的风险，但无法完全消除17。此外，已有报道指出，由于供体间的个体差异18,19以及不同的处理方法19,20，羊膜的性能存在变异性。除疾病传播的较小风险外，该方法还要求手术中心能够获得管理良好的组织库资源，而并非所有机构都具备这一条件。
尽管羊膜的应用相对成功，但仍需要开发新的合成可生物降解细胞载体，以用于角膜疾病治疗。合成载体可避免组织库储存程序，同时消除疾病传播的微小风险以及供体间差异。在这方面，已对聚乙二醇21,22和PLGA23,24等材料进行了研究。
在开发人羊膜的合成替代物时，还可以设计一些理想的特性，以期提高培养细胞的存活率。在生物材料装置中引入微结构以特异性调控细胞行为，是当前备受关注的研究领域。许多研究人员已报道了关于人工干细胞微环境构建的研究工作25-30。本课题组近期报道了一种微加工制备的PEGDA纤维连接蛋白生物功能化人工角膜缘，用于递送角膜缘上皮细胞22，以及一种制备含微加工微腔的电纺可降解膜的方法，用于支持角膜缘上皮细胞31。
本研究旨在开发一种新型制造技术，用于制备含有微结构特征的生物材料器件，这些微结构可在一定程度上模拟干细胞在体内所处的微环境。我们开发了一种结合微立体光刻与静电纺丝的技术，可制备出具有优异组织再生应用潜力的可生物降解微结构膜。
需要注意的是，尽管本研究中该技术已应用于角膜再生环的制备，但该技术还可用于多种上皮组织再生所需装置的制备。 例如皮肤、口腔黏膜、肠道、呼吸道和膀胱上皮。本研究中，我们开发了一种合成的可生物降解膜，其功能类似于羊膜，可用于向角膜递送细胞。该膜包含约300 µm的微孔结构（大于Vogt栅栏区角膜缘隐窝的尺寸，约150 µm）。最后，我们建立了一种包装方案，使这些膜可在-20 °C下保存超过6个月而无任何降解迹象。

<table><tbody><tr><td>聚（乳酸-&lt;em&gt;co&lt;/em&gt;-乙醇酸</td><td>Purac</td><td>PDLG5004</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich 或 Fisher</td><td>270997 Or D/1850/17</td><td>&gt;99.8% 含有 50–150 ppm 戊烯稳定剂</td></tr><tr><td>数字微镜装置（DMD）Discovery 1100 控制器板 &amp;和 初学者工具包</td><td>德州仪器</td><td>1076N732（紫外）</td><td></td></tr><tr><td>473 nm 激光器</td><td>Laser 2000</td><td>MBL-III</td><td>150 mW</td></tr><tr><td>聚（乙二醇）二丙烯酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>475629</td><td>Mn = 250 g/mol，500 ml</td></tr><tr><td>DMEM + Glutamax</td><td>Fisher</td><td>12077549</td><td></td></tr><tr><td>火腿&amp;rsquo;s F12</td><td>Labtech biosera</td><td>LMH1236/500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Labtech biosera</td><td>FB-1090/50</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;研发</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-100ml</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9326</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>p63</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3737</td><td></td></tr><tr><td>CK3</td><td>默克密理博</td><td>CLB218</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>SLS</td><td>HHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110232-1L</td><td></td></tr><tr><td>医用级袋（PET/铝箔/LDPE）可剥离袋</td><td>Riverside Medical Ltd. Derby, 英国</td><td>铝箔复合膜 PET/铝箔/LDPE，（12,7,50）</td><td></td></tr><tr><td>伽马射线辐照（灭菌）</td><td>应用灭菌技术公司（Synergy Health Laboratory Services（SHLS），英国阿伯加文尼）——外部剂量范围为25–40 kGy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶橙色</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10087</td><td></td></tr><tr><td>氯化钴（II）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232696</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜（II）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>六点湿度指示卡</td><td>中国台湾，美国</td><td>6HIC200</td><td></td></tr><tr><td>真空热封机</td><td>Andrew James UK 有限公司，博沃本，英国</td><td>VS518</td><td></td></tr><tr><td>Andrew James 真空封口机卷膜 28 厘米 × 40 米卷</td><td>Andrew James UK 有限公司，博沃本，英国</td><td>BR2805</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>Philips/FEI XL-20 扫描电子显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司 LSM 510 META</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维得宁消毒液</td><td>Ecolab，斯温顿，英国</td><td></td><td>3%</td></tr></tbody></table>

结合微立体光刻与静电纺丝技术制备用于角膜再生的带壁龛结构膜

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

角膜疾病影响着全球数百万人，显著降低了他们的生活质量。角膜疾病可由无虹膜症或史蒂文斯-约翰逊综合征等疾病引起，也可由化学烧伤或辐射等外部因素导致。目前的治疗方法包括：（i）使用角膜移植片；（ii）使用在实验室中扩增并以载体（例如，羊膜）递送的干细胞。这些治疗方法相对有效，但遗憾的是，部分治疗在3至5年后可能失败。因此，亟需设计和制造新型角膜生物材料装置，以精确模拟角膜中干细胞所处的生理环境。角膜缘干细胞位于角膜与巩膜之间的环形区域——角膜缘，定植于被称为沃格特栅栏（Palisades of Vogt）的特定微环境内。在本研究中，我们开发了一种新型平台技术，结合了两种先进的制造技术（微立体光刻和静电纺丝），用于制备在一定程度上模拟角膜缘结构的角膜膜。我们的膜材料包含人工微腔结构，旨在为细胞提供类似沃格特栅栏在眼部所提供的保护作用。

采用微立体光刻与静电纺丝相结合的方法制备了静电纺丝微加工环（图1 和 图2）。利用微立体光刻技术制备了不同尺寸的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）环（图3）；该技术可实现厘米级结构的加工，并能同时集成微结构特征。本研究中制备了直径为1.2–1.6 cm、带有350–500 µm微口袋的环状结构（图4）。
在制备、灭菌和包装用于未来临床应用的材料方面，发现使用医用级包装袋进行真空封装可显著提高PLGA膜的长期保存能力（图5）；采用厚度为0.12 mm的医用级包装袋（PET/铝箔/LDPE）可延长材料的保质期。我们通过将膜材料送至位于印度的合作者处进行验证，膜在-20 °C、室温以及37 °C的刻意潮湿条件（湿式培养箱）下储存数月。 图5 显示，在37 °C潮湿环境这一刻意严苛的储存条件下，非真空封装的膜仅能稳定保存约1个月，而真空封装条件下可稳定保存达3个月（图5 和 表1）。
表1展示了即使在有利于水分吸收和纤维膨胀的条件下，只要注意选择所使用的袋子，也能实现储存条件的改善。
在不同条件下，环状支架均支持角膜缘外植体的细胞生长：(i) 新制备的环状支架和 (ii) 储存6个月后的环状支架（图6）。将PLGA膜置于三维损伤模型上培养4周后，实现了细胞的迁移与扩展。组织外植体在膜上生长并形成新的上皮层，覆盖先前去上皮的角膜区域（图7）。同时设置了阳性对照（未经任何处理的角膜）和阴性对照（损伤角膜），并在相同培养时间内进行维持。阴性对照证实，在未添加任何细胞的情况下，无法形成新的上皮层。免疫细胞化学结果显示，从外植体生长出的细胞为角膜上皮细胞，因其表达角膜分化标志物CK3（图7E）。
<img alt="用于使用PEGDA聚合物进行3D打印的立体光刻装置示意图，包含激光器、光束扩展器和DMD。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 用于制备PEGDA环的微立体光刻装置示意图。
<img alt="电纺丝示意图：高压装置、PEGDA纤维、PLGA溶液、涂有电极的铝箔。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 使用微加工PEGDA环作为模板的电纺丝过程示意图。
<img alt="不同直径的金膜冲压与转移方法；实验示意图及结果。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. (A) 展示了用于纺制微加工PLGA膜的静态收集器（电镀铝片带有PEGDA环）的一个示例。(B) 和 (E) 展示了从静态收集器上剥离的不同电纺膜。(C) 展示了不同尺寸的PEGDA模板，突显了使用微立体光刻技术制备底层表面的灵活性。(D) 展示了一个微加工的PLGA复制品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<img alt="静电纺丝过程示意图：扫描电镜图像、PEGDA模板、PLGA复制品、纤维形貌分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 具有马蹄形微结构的PEGDA环的扫描电镜图像 (A)；微加工凹槽的高倍扫描电镜图像 (B)。具有马蹄形微结构的PLGA环的相差图像 (C)；微加工凹槽的高倍相差图像 (D)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<img alt="Microfabricated PLGA ring membranes; fiber intensity vs. temp/age; SEM of fibers; color samples." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 真空与非真空包装的微加工PLGA（50/50）膜（44 kg/mol）在6个月储存期间温度和时间对膜的影响。 膜完整性评分标准为：纤维完全完整（+++）、部分纤维溶胀（++）、纤维融合（+）或无完整纤维（-）。扫描电镜图像及三种干燥剂（橙色硅胶、氯化钴(II)和硫酸铜(II)）显示纤维完整性或湿度均无变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<img alt="Static equilibrium in tissue engineering; microscopy images of explant and scaffold interaction, 300 μm, 150 μm." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 荧光图像显示角膜缘外植体在新制备的可生物降解PLGA环（A，B）以及在-20 °C保存6个月后的PLGA环上LECs的生长情况20 °C （C，D）。 图像 （A） 和 （B） 分别对应经DAPI（蓝色）和碘化丙啶（红色）染色的细胞。图b为置于微加工孔穴上的外植体经共聚焦z轴层扫获得的正交视图。图像 (C) 和 (D) 显示 p63（绿色）阳性染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<img alt="培养皿中的三维角膜损伤模型及显微镜图像，显示角膜组织外植体的结果" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. (A) 显示一种带有环形支架的兔角膜损伤模型，角膜组织外植体置于此前涂有纤维蛋白胶的支架上。(B) 和 (C) 分别为阳性对照和阴性对照；阳性对照为新鲜兔角膜，阴性对照为上皮被人为去除的角膜（阴性对照也培养了4周）。(D) 为组织工程角膜在体外培养4周后的H&amp;E染色图像；该图显示由置于基质微环境中的外植体细胞迁移形成的新生多层上皮。(E) 为免疫细胞化学图像，显示角膜缘外植体的细胞迁移生长情况；细胞核用DAPI染色（蓝色），细胞表达角蛋白3（绿色），为角膜分化的标志物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;">PLGA (50/50)</td>
			<td colspan="7" style="width:448px;">在37 °C潮湿条件下储存的膜的纤维完整性</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:64px;">第0天</td>
			<td style="width:64px;">第1月</td>
			<td style="width:64px;">第2月</td>
			<td style="width:64px;">第3月</td>
			<td style="width:64px;">第4月</td>
			<td style="width:64px;">第5月</td>
			<td style="width:64px;">第6月</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">非真空包装</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:163px;">真空包装（袋A）（PE、PA复合材料）厚度：0.14 mm</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:163px;">真空包装（袋B）（PET / 铝箔 / LDPE）厚度：0.75 mm</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 真空及不同储存袋对PLGA（50/50）膜（44 kg/mol）在6个月储存期间完整性的影响。 膜完整性评分标准为：纤维完全完整（+++）、部分纤维膨胀（++）、纤维融合（+）或无完整纤维（-）。

我们报道了一种在电纺丝膜内制造微孔结构以研究细胞行为的技术。具体而言，我们描述了一种结合微立体光刻与电纺丝的方法，用于制备具有微结构特征的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）角膜生物材料装置。

角膜问题影响着全球数百万人，显著降低了他们的生活质量。角膜疾病可由多种疾病引起，例如……

以下实验的总体目标是通过结合增材制造技术和静电纺丝，在组织工程支架中引入三维空间复杂性。该目标通过分步光固化技术——即微立体光刻技术——制备由聚乙二醇、D acrl 或 PEG DA 构成的不可降解模板来实现。第二步。将模板固定在金属基底上，并采用电纺丝技术制备出模拟底层形态的可生物降解膜。随后，研究电纺膜的包装程序及其降解性能。通过控制温度和湿度，避免储存期间膜的过早降解。最后一步是将可生物降解膜置于三维角膜损伤模型上，以研究其作为角膜再生装置的潜在用途。结果表明，采用增材制造技术和静电纺丝技术可制备出含有微口袋的复杂膜结构，在一定程度上模拟了天然干细胞微环境，具有良好的应用灵活性。该技术的主要优势在于其多功能性。由于非生物降解模具可以采用多种制造技术重新制备，该方法在制造领域和组织再生领域均具有重要意义，并有助于回答与干细胞行为及其微环境相关的关键科学问题。这种微加工支架的制备方法可为角膜再生研究提供重要见解，还可推广应用于其他具有干细胞微环境的上皮组织，如皮肤和口腔黏膜，或用于构建适用于多种组织工程的三维结构与支架。主讲人 Ortega 和 Thomas Patterson 将共同演示该操作步骤。首先创建第一层（L1），即结构的基底，使用任何合适的绘图程序绘制一个直径为 1.2 厘米的黑色圆形。接下来，制作第二层 L2。在第二层中，绘制另一个直径为 1.2 厘米的黑色圆圈，并在其中包含六个至八个白色马蹄形结构，尺寸为 0.5 × 0.35 毫米。将这些小型白色马蹄形结构均匀分布在黑色圆圈内部。将L1和L2以JPEG格式保存，以准备进行微立体光刻。首先，调整并仔细清洁系统的光学部件。取300 µL聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG D）混合物，加入12孔细胞培养板的一个孔中。该孔应预先涂覆聚四氟乙烯或其他防粘材料，以便于结构的脱模。固化完成后，打开蓝色激光器，并将L1上传至ALP3基础软件。该软件是一种USP接口，可提供PC与数字微镜装置之间的连接。将第一层照射60秒。向孔中再加入250 µL的peg da。加载L2层并照射L2层60秒。去除未固化的聚合物，并用异丙醇将环状物清洗过夜。在电纺前一天，通过将聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG DA）环状物分布在一块电镀的12厘米×20厘米铝板上，制备静态电纺收集器。使用导电碳胶带将环状物固定。配制聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶液，并在使用前一天持续搅拌过夜。将四个五毫升注射器装入注射泵中，注射器配备钝端、内径为 0.8 厘米的针头。使用四个注射器而非单个注射器。为确保更快速的静电纺丝，将 2.5 毫升 PLGA 溶液装入每个注射器中。为了确保该实验步骤的成功，应尽量保持纺丝参数恒定。针头与收集器之间的距离保持15厘米。设定流速为30微升每分钟，电压范围为12至15千伏，进行电纺丝1小时30分钟。电纺完成后，小心地将PLGA电纺海绵片从支撑PEG da环的收集器上剥离。PEG DA环可作为电纺模板重复使用。使用圆形打孔器将电纺海绵支架切割成直径为22毫米的圆片。将环形结构置于中央位置，以准备用于长期保存的PLGA膜。将每片膜放入小型容器（如塑料培养皿）中，并置于医用级包装袋内。在医用级包装袋内放入三袋干燥剂。向袋中加入一张市售的六点湿度指示卡，以检测储存期间是否积聚湿气。使用真空热封机对袋子进行抽真空并密封。随后，将 PLGA 膜送至外部公司进行伽马射线或辐射灭菌，然后储存。本实验中所用的兔角膜缘组织是从养兔场获取的兔眼分离得到的，这些兔子饲养用于食用。首先使用 3% 的消毒液对兔眼进行消毒。接下来，通过去除角膜周围多余的组织来清洁眼球。角膜缘区域可识别为透明角膜与白色巩膜之间的细环状区域。将角膜缘区域与角膜其余部分分离。将角膜缘区域切成约1.5厘米长的片段，用1.5%消毒液对角膜缘片段消毒1分钟。消毒后，使用手术刀片将角膜缘片段切成小块。将组织小块置于DMEM加谷氨酰胺培养基中，在37°C和5%二氧化碳条件下保存，使用前最长不超过1小时。开始此操作时，使用细胞刮刀将15微升的原纤维蛋白胶涂覆在环形膜上。在解剖显微镜下操作，使原纤维蛋白均匀分布。使用25号针头将角膜缘外植体直接放置在PLGA微孔中。将带有组织外植体的环置于预先制备的去上皮角膜上。外植体朝上，并处于气液界面条件下，PLGA 环会迅速湿润并贴合角膜模型的形状。将器官培养模型置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养四周，每两天更换一次培养基。微立体光刻技术能够制造不同尺寸的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG DA）环，并可同时集成微结构特征。这些环可被重复、稳定地制备和重复使用，并可轻松固定在金属片上，用作静电纺丝的收集器。在此示例中，环上包含马蹄形微结构特征。静电纺丝随后制备出PLGA复制品，对PLGA膜进行真空包装可显著改善其长期储存性能，即使在37摄氏度的刻意潮湿条件下亦然。所使用的包装袋类型也会影响膜的稳定性，扫描电子显微镜对三种不同包装袋的检测结果显示，完整纤维的结构完整性或湿度均未发生改变。来自角膜缘植入物的细胞生长可由新制备的可生物降解PLGA环以及在-20摄氏度下储存六个月后的PLGA环有效支持。将PLGA膜置于3D角膜损伤模型上后，四周实现了细胞的转移。H&E染色图像显示，从种植于微环境中的外植体迁移出的细胞形成了新的多层上皮。阴性对照证实，在未添加任何细胞的情况下，无法形成新的上皮层。与作为阳性对照使用的新鲜兔角膜中观察到的常规角膜上皮相比，免疫细胞化学结果显示，从植入物中生长出的细胞为角膜上皮细胞，因其表达角蛋白3（cytokeratin three），即一种角膜分化标志物。由于含有不可降解模板的电纺收集器可重复使用，当实验方案优化后，支架的制备可在两小时内完成。该技术可使组织工程领域的研究人员探索一种制造含微结构特征的复杂组织工程膜的新方法，用于研究细胞行为。观看本视频后，您应能充分理解如何利用增材制造技术或建模等类似方法制备不可降解的微加工模板，以及如何通过静电纺丝为支架增加复杂性。

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

Microstereolit​​hography和静电结合，以产生膜配备有利基的角膜再生

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

本方案结合静电纺丝与微球技术，构建可引导神经元生长的组织工程支架。将神经生长因子包裹于PLGA微球中，并将其静电纺丝至透明质酸（HA）纤维支架内。通过在支架上接种原代鸡背根神经节并培养4-6天，检测蛋白质的生物活性。...

电纺将生长因子释放微球融入纤维支架

生物材料技术的进步使得三维多细胞类型结构的构建成为可能。我们已开发出静电纺丝方案，用于制备三种独立的支架，以培养气道的主要结构细胞，从而构建气道细支气管壁的三维体外模型。...

通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

本方案描述了一种新型的三维 体外...

角膜组织工程：一种 体外 人角膜基质-神经相互作用模型

本文描述了制备用于高通量操控模拟物理与化学信号的多重人工细胞微环境（MACME）阵列的详细方法 体内...

构建多重人工细胞微环境阵列

本方案描述了从人或绵羊组织的外植体中建立和培养角膜内皮细胞培养物所需的关键步骤。同时介绍了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行传代培养的方法。...

在生物材料膜上培养人和羊角膜内皮细胞层

本方案介绍了一种无需光刻技术的微图形化方法，操作简便，适用于生物工程背景有限的研究人员。该方法利用定制的激光切割掩膜，将细胞外基质蛋白微图形化为特定形状，以调控细胞形态。本文以诱导多能干细胞来源的心肌细胞为例，演示了微图形化的操作流程。...

使用激光切割模板的简易无光刻单细胞微图案化技术

单纯后弹力层剥离术（Descemet's Stripping Only，DSO）是一种实验性手术方法，适用于因福克斯内皮角膜营养不良（Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy）导致中央角膜出现滴状赘疣的患者，通过剥离后弹力层，促使周边细胞再生内皮层。本文提出一种新的方法，模拟在体外（ex...

一种仅进行后弹力层剥离的人类角膜器官培养模型及其由工程化成纤维细胞生长因子1促进的加速愈合

传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境...

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。...

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

本方案描述了使用三维激光打印技术制备可植入式集成成像窗口的方法。该窗口由与微支架耦合的微透镜系统组成。该方法采用生物相容性光刻胶SZ2080，通过双光子聚合（2PP）技术进行连续加工，优化了不同组件之间的制造效率与对准精度。...

用于先进成像的微结构成像窗中可植入光学器件的微加工 体内 成像

了解微立体光刻与静电纺丝结合技术，用于制备具有微孔结构的PLGA角膜再生膜。该方法通过创建不可降解模板并电纺生物可降解膜，模拟天然干细胞微环境，为组织工程和角膜再生研究提供新途径。

结合微立体光刻与静电纺丝技术制备用于角膜再生的带壁龛结构膜

探索更多视频