Name: 大鼠脑组织被提取物的高分辨核磁共振代谢组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解利用高分辨核磁共振波谱技术对大鼠脑组织提取物进行代谢组学分析的方法。本研究通过液氮速冻、甲醇-氯仿-水萃取及冻干处理，获取脑代谢物高分辨图谱，助力神经化学与疾病代谢机制研究。

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谨此感谢法国国家科学研究中心（CNRS，UMR 6612 和 7339）的资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

核磁共振波谱法是一种高效、高度可重复且准确测定溶液中化学化合物浓度的方法。然而，要获得高质量的数据，必须遵循样品制备和分析过程中的若干规范。在利用核磁共振波谱法测定代谢物浓度时，只要观测信号的强度未接近检测阈值（即信号极弱），信号的产生或接收过程均不会成为定量误差的主要来源。在其他所有情况下，生物学变异、样品制备技术（提取效率、化合物的物理和化学稳定性、移液和称量误差） 等等。），以及信号采集和处理参数的选择将决定结果的精确性和准确性。显然，组织采集过程中发生的任何代谢变化都会反映在所获得的代谢物浓度中。因此，必须尽快完成组织采集，并采用特定的组织冷冻技术（如漏斗冷冻），以确保结果的准确性 体内 快速代谢化合物的浓度非常重要（尤其是葡萄糖、乳酸、ATP及其分解产物、ADP和AMP）。
即使在常规高分辨率核磁共振波谱仪的中等磁场强度（9.4 T）下，也能获得优异的谱图。例如，在 1大鼠脑组织提取物水相的氢核磁共振谱中，化学位移差Δδ达到 约 0.005&#160;ppm（对应于2.0）&#160;赫兹，400...

小鼠模型已广泛应用于脑科学研究1。一方面通过在RNA和/或蛋白质水平上研究基因表达，另一方面研究形态学、功能、电生理和/或行为表型，已在小鼠和大鼠脑中开展了基因型-表型相关性研究2-6。然而，要全面理解连接表型与基因型的机制，必须研究蛋白质表达下游的分子事件，i.e. 酶作用的生化底物的代谢过程7。这一需求在过去10至15年中推动了生物学多个领域代谢研究的复兴8,9。虽然经典代谢研究通常集中于特定代谢通路的细节，但新兴的代谢组学方法则致力于全面分析所研究组织的整体代谢谱。这一理念带来的一个直接结果是迫切需要分析工具，以最大程度减少对特定代谢通路和/或化合物类别的偏向性。然而，经典的生化检测依赖于特定分析物的特定化学反应，且该分析物必须在检测前预先确定。相比之下，核磁共振（NMR）波谱法和质谱法（MS）等光谱技术具有以下特点：(i) 基于生化化合物特有的分子（物理）性质，每种性质在一次实验所检测的谱图中产生一个或多个独立信号；(ii) 每次实验可同时检测大量不同的化合物。
因此，每个谱图都包含了大量代谢物的综合信息。正因如此，光谱方法适用于代谢组学研究，因为在测定分析物性质时无需预先进行选择8。 Consequently，这些技术天然适用于探索性研究，因为它们能极大地促进对意外代谢变化的检测。
尽管核磁共振波谱法和质谱法可互换用于多种代谢物的分析，但每种方法均具有特定的优缺点，这些已在近期得到综述10简而言之，核磁共振（NMR）波谱分析通常可直接用于粗提物，分析前无需对样品中的化合物进行色谱分离。相比之下，质谱（MS）通常需结合气相或液相色谱（GC 或 LC）分离技术，仅在少数最新进展中例外，例如质谱成像技术。在某些特殊情况下，如糖类分析，由于不同糖类在质子（¹H）谱中的共振峰存在显著重叠，NMR 分析也可能必须借助液相色谱（LC）分离。1H) NMR 谱图。然而， 1无需色谱分离的氢核磁共振（1H NMR）波谱法仍是目前最受欢迎且几乎普遍应用的代谢组学NMR方法。通常，质谱法（MS）的样品前处理比核磁共振波谱法更为耗时且复杂。由于基质效应引起的严重问题在核磁共振波谱法中远少于质谱法，而在质谱法中，基质效应可能导致信号显著衰减。两种方法均可实现代谢物的定量分析。然而，由于不同代谢物之间基质效应和电离效率的差异，质谱法需要使用多种标准品。相比之下，核磁共振波谱分析每样品仅需一种标准品，因为在适当的测量条件下，该方法具有内在的定量能力，源于被观测原子核的严格线性NMR响应。NMR的一个主要缺点是其相对较低的灵敏度。质谱法，尤其是液相色谱-质谱联用（LC-MS），其灵敏度比NMR高出数个数量级；因此，对于极低浓度化合物的分析，质谱法优于核磁共振波谱法。另一方面，核磁共振实验的非破坏性特性明显优于质谱法；因此，可对同一样品进行多次重复的NMR检测。 例如，针对不同的核磁共振活性核，例如 1H，磷-31（³¹P）31P），碳-13（13C），氟-19（19F) 等等，因为与质谱（MS）测量不同，核磁共振（NMR）不会消耗样品。
核磁共振（NMR）和质谱（MS）均可在不同模式下使用，每种模式均针对具有特定化学特性的化合物检测具有最佳效果。例如， 31P NMR 通常比 1用于分析中等浓度磷酸化化合物的氢核磁共振（¹H NMR），尽管几乎所有磷酸化代谢物也都含有质子。然而，它们的 1H NMR信号可能被掩盖 1其他非磷酸化化合物的氢核磁共振信号，而后者显然不会在 31P 核磁共振谱。在类似情况下， 19对于含氟化合物，应优先采用氟-19核磁共振（19F NMR）分析。 例如，含氟药物（无内源性代谢物的背景信号），而特例情况为 13C NMR 几乎仅在研究碳的去向时才具有重要意义 13需要追踪C标记的外源性代谢前体，由于其天然丰度极低 13碳同位素（约 1%）。许多质谱仪在负离子模式或正离子模式下工作，因此在分析前明确待观测离子带负电荷还是正电荷至关重要。本文重点介绍一种通过质谱分析脑组织代谢组的实验方案 1H 和 31P核磁共振波谱法，因为该方法在以下两方面以较低成本提供了大量重要代谢物的浓度信息：(i) 样品制备所需时间；(ii) 代谢物定量所需的劳动投入。所有实验均可使用标准湿化学实验室设备和高分辨率核磁共振波谱设施完成。其他要求详见下文 实验方案 下文部分。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>动物用麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>更新型号：Isotec 4</td></tr><tr><td>手术刀、剪刀、镊子、夹子</td><td>Harvard Apparatus&lt;br/&gt; Fisher Scientific</td><td>多种&lt;br/&gt; 多种</td><td>动物手术器械</td></tr><tr><td>冷冻夹具</td><td>自制</td><td>n/a</td><td>带铝板的钳子，用于插入&lt;br/&gt; 液氮中冷却</td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>氮气蒸发仪</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>可用自制装置替代</td></tr><tr><td>研钵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247472</td><td></td></tr><tr><td>研杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>配备适配匀浆器转轴的试管</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>玻璃离心管</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml、30 ml 管</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml 管；若与离心机转子兼容，应替代 &quot;Eppendorf&quot; 管</td></tr><tr><td>聚苯乙烯移液管</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 ml 和 10 ml 规格</td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>氘代度 99.96%</td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>氘代度 99.96%</td></tr><tr><td>氘化氯</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% 溶于重水</td></tr><tr><td>氘氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% 溶于重水</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>低温离心机</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMR 管</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR 同轴内插管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>由 Wilmad 生产</td></tr><tr><td>NMR 移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>配备适用于 0.5 至 1,000 &amp;mu;l 体积的吸头</td></tr><tr><td>移液辅助器</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR 波谱仪</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>含探头及其他附件</td></tr><tr><td>NMR 软件</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>更新版本可用：Topspin 3.2</td></tr><tr><td>水溶性标准化合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>磷脂标准化合物</td><td>Avanti Polar Lipids&lt;br/&gt; Doosan Serdary&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>多种&lt;br/&gt; 多种&lt;br/&gt; 多种</td><td>缩醛磷脂来源，但纯度可能 &amp;lt;70 - 80%</td></tr><tr><td>亚甲基二膦酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

利用组织提取物的高分辨率核磁共振波谱法对大鼠脑组织进行代谢组学分析

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

长期以来，研究人员通过在 RNA 和蛋白质水平上研究基因表达来探索疾病背后的生物学过程。近年来，基因组学和蛋白质组学得到了对生物系统中代谢物库进行全面定量分析的补充。这一策略被称为代谢组学，旨在对参与代谢的小分子组成进行全面的表征。基因组和蛋白质组定义了细胞能够执行的功能，而代谢组则是实际表型的一部分。在当前代谢组学所采用的多种方法中，光谱技术尤其受到关注，因为它们能够在无需预先选择特定生化通路的情况下同时分析大量代谢物，从而实现广泛且无偏倚的研究策略。本文介绍了一种经优化的高分辨率核磁共振（NMR）波谱法用于代谢组学分析的实验方案，该方法是高效定量组织代谢物的首选方法。该方法的重要优势包括：（i）可直接使用粗提物，无需对样品进行纯化或代谢物分离；（ii）NMR 本身具有定量特性，仅需一种参考化合物即可实现对 NMR 谱图中所有代谢物的定量；（iii）NMR 的非破坏性特点，使得同一样品可重复用于多次测量。由于 NMR 信号具有线性响应，该方法可覆盖较宽的代谢物浓度动态范围，尽管浓度极低的代谢物可能难以检测。对于丰度最低的化合物，高灵敏度的质谱方法可能更具优势，但该技术所需的样品前处理和定量流程比 NMR 波谱法更为复杂。本文所述 NMR 方案已针对大鼠脑组织分析进行了优化，但经过少量修改后，同样适用于其他组织。

为了在脑组织及其他组织提取物的代谢物核磁共振（NMR）谱图中获得最佳分辨率，长期以来普遍采用的方法是去除或屏蔽提取液中存在的金属离子（尤其是顺磁性离子）。这一目的通常通过向提取物中添加螯合剂（如EDTA或CDTA）来实现。19，或通过Chelex-100等离子交换树脂处理提取物20. 本文展示的结果 图1 证明该步骤对于此过程并非必要 1根据上述方案仔细制备脑组织提取物后进行氢核磁共振（¹H NMR）波谱分析。在此条件下，所分析的所有波谱区域均获得了极窄的谱线。即使在信号非常密集的区域， 例如，用于谷氨酰胺/谷氨酸的检测 myo-肌醇/甘氨酸，峰位于某一距离处 &lt;0.01 ppm 在 400 MHz 下几乎可以完全分离图1，底部）。因此，对中心和底部图谱中可见的众多微小但目前尚未指认的峰进行定性和定量分析 图1 未来可以预见。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

许多神经系统和全身性疾病会改变哺乳动物大脑的神经化学特性。通过脑组织粗提物，可高效获得特征性的脑代谢物谱。为此，采用高分辨率核磁共振波谱法，能够对代谢物浓度（代谢组学）进行详细的定量分析。

在RNA和蛋白质水平上进行的基因表达研究长期以来一直被用于探索疾病相关的生物学过程。最近，基因组学……

本实验的总体目标是从大鼠脑组织提取物中获得高分辨率的代谢物谱图。首先，采集大鼠脑组织并用液氮速冻。第二步，使用甲醇-氯仿-水溶液对组织进行匀浆以提取脑内代谢物，随后去除变性蛋白质和有机溶剂。接下来，将水相样品进行冻干处理，并用明确规定的溶剂重新溶解所有样品。为了获得最佳的核磁共振波谱分析结果，最后一步是仔细设置并优化代谢组学核磁共振实验。最终，需要在明确规定的实验条件下获取核磁共振谱图，并采用优化的数据处理流程进行分析评估。尽管该方法可用于研究脑代谢，但也同样适用于其他软组织，如肿瘤、肝脏、肾脏及其他器官。首先，从负80摄氏度的冰箱中取出先前制备好的冷冻脑组织样本，然后立即将组织样本转移至一个装有部分液氮的研钵中。使用液氮冷却的研钵将冷冻的脑组织破碎成更小的碎片，以便轻松装入用于组织匀浆的试管中。随后充分混合这些冷冻脑组织碎片，准确称取250至350毫克组织，转移至含有总共4毫升冰甲醇的试管中。每次将冷冻组织碎片加入试管后，应立即使用组织匀浆器进行匀浆处理。当最后一块冷冻大鼠脑组织样本加入试管并匀浆后，将匀浆液转移至一个大于或等于20毫升的玻璃小瓶中。盖紧螺旋盖，将匀浆液置于冰上静置15分钟。接着，向匀浆液中加入4毫升冰冻的氯仿，并充分涡旋混匀。完成后，将匀浆置于冰上15分钟。充分涡旋后，向匀浆中加入4毫升水，然后将匀浆在-20摄氏度下静置过夜。为实现完全相分离，将脑组织匀浆液转移至体积大于或等于20毫升的耐氯仿离心管中，在4摄氏度、13,000 G条件下离心40分钟。离心后，使用巴氏吸管将上层相转移至适当的耐甲醇15毫升离心管中。然后使用新的巴氏吸管将下层相转移至适当的、容积大于或等于15毫升的耐氯仿离心管中，并将该管置于冰上，同时将含有水-甲醇相的管子也保持在冰上。通过向提取液中通入干燥氮气流以蒸发甲醇。当氮气鼓泡不再引起提取液体积减少时，终止蒸发过程。将含有甲醇-氯仿相的试管置于冰上后，将干燥的氮气流对准提取液表面，蒸发甲醇。当所有溶剂完全蒸发后，关闭管盖并将样品保存在零下80摄氏度，直至进行核磁共振（NMR）分析。为准备水相的冻干，将水相样品转移至一支已彻底冲洗过的50毫升离心管中。随后将离心管在液氮中旋转，使提取液逐渐冻结并覆盖管内表面，从而冷冻提取溶液。当所有液体完全冻结后，用带有穿孔的螺旋盖盖住试管，以允许蒸汽逸出，并将试管放入宽口真空过滤瓶中。将瓶子连接至冷冻干燥机后，启动冻干程序，随后终止冻干过程。当样品完全干燥后，将样品密封保存于−80 °C环境中，直至用于核磁共振（NMR）分析。进行磷脂的磷核磁共振分析时，将干燥的脂质溶解在700微升氘代氯仿-甲醇-200毫摩尔水性CDTA溶液（体积比5:4:1）的混合溶剂中。使用带有耐氯仿枪头的直接置换式微量移液器将样品转移至微量离心管中。此时，将核磁共振探头的温度调节至目标设定值，通常为25摄氏度离心。将磷脂提取液在4 °C、11,000 G条件下离心30分钟，以沉淀样品中的固体残渣。离心结束后，将600 µL上清液转移至外径为5毫米的高品质核磁共振（NMR）样品管中。准备合适的同轴插入管芯，内含pH 7.0的20 mmol/L水溶液亚甲基二磷酸盐，用于化学位移校准和定量分析。将此插入件放入装有磷脂提取液的核磁共振（NMR）管中。随后，为NMR管装配合适的转子，并将其转移至NMR磁体中。待样品温度平衡至设定值后，以15至20赫兹的转速旋转样品。通过调节轴向和非轴向匀场线圈电流，仔细尽量减小样品内磁场的不均匀性，并将核磁共振谱图采集参数设置为最优值，这些参数可能随磁场强度的不同而变化。谱图采集完成后，使用优化的参数对自由感应衰减信号进行处理，以获得磷脂共振信号全范围内的最佳结果。至少采用两种不同的滤波方法重复进行数据处理。最后，通过滤除极弱且宽泛、无明显重叠的信号，以提高信噪比。在本实验中，即使在谱图非常拥挤的区域，所有分析的谱区均获得了极窄的谱线。在400兆赫兹条件下，间距小于0.01 ppm的峰几乎可以完全分离。因此，未来可通过选择1000毫摩尔而非200毫摩尔来实现谱线变窄，从而对大量微小但目前尚未归属的峰进行定性和定量分析。曾希望使用CDTA，但其导致了磷脂信号的重叠；也曾希望选择277开尔文而非297开尔文以实现谱线变窄，但也同样导致了磷脂信号的重叠。将CDTA浓度从200毫摩尔降至50毫摩尔，仅导致谱线宽度略有增加，化学位移几乎无变化。然而需注意，50毫摩尔CDTA提取物中的组织浓度仅为200毫摩尔CDTA提取物中的一半。谱线相对较窄的原因在于，检测到大量可定量的磷脂，其浓度覆盖了较宽的范围。光谱分辨率甚至足以常规检测某些峰的部分裂分。因此，未来有望对更多磷脂亚类进行定性和定量分析。在尝试该操作时，重要的是务必牢记每一步都需极其谨慎地进行，以确保代谢物分析达到最佳效果。

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来源：Blanc, J., et al. 大鼠胡须激活期间桶状皮层7 T功能磁共振波谱分析。J. Vis. Exp.

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