Name: 在永久性幼虫特有的神经重构的C语言活体成像线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习利用活体成像技术观察秀丽隐杆线虫在dauer阶段的神经元重塑过程。该方法通过提取粗制dauer信息素诱导幼虫进入滞育状态，结合GFP标记的IL2神经元实时成像，揭示环境应激下神经可塑性的分子机制。

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感谢 Maureen Barr 博士，在其指导下最初表征了dauer IL2重塑表型。感谢 C. Britt Carlson 博士对本文稿的批判性审阅。Barr 实验室的资金来自美国国立卫生研究院（NIH，资助号：5R01DK59418）以及美国农业部（USDA，资助号：2010-65106-20587）和新泽西州脊髓损伤研究委员会（CSCR12FEL004）的博士后奖学金。本研究目前的资金来自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校农业、消费与环境科学学院（ACES）FIRE 项目资助。

1. 粗制滞育信息素的制备
<ol>
	<li>从单个菌落接种，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下，于 100 ml LB 液体培养基中过夜（O/N）培养 OP50 E. coli。注意：此过夜培养物可提前制备，并在 4 °C 下保存。</li>
	<li>将 N2 C. elegans 培养于 15–20 个 6 cm 培养皿的 NGM 琼脂平板上（配方见表 1），每皿接种 50 µl OP50 E. coli，直至细菌几乎耗尽19。</li>
	<li>在 1 L 锥形瓶中配制 5 份各 250 ml 的 S 培养基（配方见表 1）19。注意：该溶液可提前配制。</li>
	<li>在 4 L LB 液体培养基中接种 1 ml OP50 E. coli，于 37 °C 振荡培养 16 小时，过夜培养 OP50 E. coli 培养物。</li>
	<li>用 1 ml S 基础溶液（配方见表 1）从步骤 1.2 的平板上冲洗线虫，并将 4–5 个平板的线虫转移至步骤 1.3 中制备的 S 培养基的 4 个 1 L 锥形瓶中（每瓶对应 4–5 个平板）19。</li>
	<li>将步骤 1.4 中的 OP50 在 650 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清液。将每份细菌沉淀重悬于 10 ml S 基础溶液中。将等量重悬的细菌分别加入各瓶线虫 S 培养基中。</li>
	<li>将锥形瓶置于室温（20–25 °C）、100–150 rpm 的摇床上培养 4–5 天，直至溶液开始变澄清，表明食物已耗尽。</li>
	<li>当食物耗尽后，在 4 × 1 L LB 液体培养基中再次过夜培养 OP50 E. coli。在 650 × g 条件下离心细菌 10 分钟，将一个锥形瓶的菌体沉淀加入每个含线虫的 S 培养基瓶中。将 S 培养基瓶按步骤 1.7 的条件放回摇床，继续培养 3–4 天，直至食物再次耗尽。</li>
	<li>从每个锥形瓶中取约 1 ml 溶液，从每份 1 ml 样品中取 1 µl 进行亚样，计数线虫数量，估算线虫浓度。注意：线虫浓度应为每毫升 50,000–75,000 条线虫。在此浓度下，大多数线虫为持存幼虫（dauer）。</li>
	<li>弃去任何被污染的锥形瓶。注意：污染常在步骤 1.9 中表现为可见的真菌菌丝。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4,000 × g 离心线虫 10 分钟。弃去线虫沉淀，保留上清液。另见讨论部分，了解如何利用这些线虫制备低活性信息素。</li>
	<li>用 Whatman #1 滤纸过滤上清液。注意：使用抽滤瓶可加快此过程。</li>
	<li>进一步使用 0.45 µm 无菌真空过滤装置过滤上清液。注意：滤液可在 4 °C 下过夜保存，或直接进入步骤 1.14。</li>
	<li>将滤液加入含搅拌子的 2 L 烧杯中，置于通风橱内的加热磁力搅拌器上。边搅拌边加热至沸腾，蒸发至约 200 ml。将溶液转移至 500 ml 烧杯中，继续煮沸至剩余约 50 ml。注意：此步骤需谨慎操作，以防溶液暴沸。最终 50 ml 溶液呈深棕色。在浓缩过程中的任意时刻，均可关闭加热，将滤液在室温或 4 °C 下过夜保存。</li>
	<li>冷却后在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。将上清液倒入 100 ml 烧杯中，弃去沉淀。</li>
	<li>将上清液继续煮至形成棕色结痂。停止加热，用刮刀将结痂打碎。加入足量 200 度乙醇覆盖结痂。用 Parafilm 封口，室温过夜静置。倒出乙醇至洁净烧杯中暂存。加入新鲜乙醇覆盖结痂。重复过夜萃取 3 次。合并所有萃取液。</li>
	<li>使用真空泵干燥乙醇萃取物。若无真空泵，可将乙醇萃取物转移至洁净烧杯，在通风橱中边搅拌边于 50 °C 温育。注意：乙醇蒸发后应留下浅棕色粘稠残留物。若采用加热方式，需注意避免长时间加热导致残留物烧焦。</li>
	<li>将残留物溶于 10 ml 无菌蒸馏水中。使用 0.22 µm 注射式滤器过滤除菌，分装为每管 1 ml，于 -20 °C 保存。注意：每 100 ml 原始液体线虫培养物使用 1 ml 水溶解残留物。例如，若因污染弃去一个液体培养瓶，则需相应调整溶解残留物所用水的体积。</li>
</ol>
2. 信息素剂量反应的测定
<ol>
	<li>通过制备6份各5 ml的NGM培养基（含Noble琼脂，不含蛋白胨），并添加50 µg/ml硫酸链霉素及一系列浓度的dauer信息素（见表1配方）4, 19，来准备dauer信息素。将组分混合于13x100 mm玻璃培养管中，在本生灯上煮沸，然后倒入3 cm培养皿中。</li>
	<li>称量一个微量离心管。向管中加入1 ml过夜培养的E. coli OP50菌液，在微量离心管中以约17,000 × g离心。弃去全部上清液。再次称量管重，确定细菌沉淀的重量。用M9缓冲液（见表1配方）重悬沉淀，使其最终浓度为4%（w/v）。将10 µl细菌悬液等分点样至每块信息素平板中央4。将平板在室温下放置过夜。</li>
	<li>在成虫蜕皮后一天，挑取10–15只性成熟的N2野生型雌雄同体个体接种至信息素平板上4。将平板置于25 °C培养3–4小时。</li>
	<li>移除所有成年雌雄同体个体。记录每块平板上所产卵的数量。用Parafilm封口膜密封平板，并放回25 °C继续培养3天17。</li>
	<li>统计dauer幼虫所占百分比（图2）。注意：对于两种方法均需注意，dauer幼虫（以及程度较轻的非dauer个体）会沿培养皿壁爬升并附着于皿盖。因此，必须检查培养皿所有表面以寻找线虫。</li>
	<li>将数据拟合至剂量-反应曲线，并估算信息素的EC90浓度（即足以诱导90%个体发育为dauer幼虫的信息素浓度），如图3所示。注意：我们通常采用逻辑回归模型估算EC90，但不同的统计软件包可能提供其他可产生相似估计结果的方法。</li>
</ol>
3. 秀丽隐杆线虫dauer阶段IL2神经元的活体成像&#8203;
<ol>
	<li>按照方案2的方法制备dauer信息素平板，使用EC90 步骤 2.6 中确定的值</li>
	<li>使用携带整合型IL2报告基因转基因的品系，按照方案2中的方法诱导滞育幼虫myIs13[蛋白质]klp-6::gfp], myIs14[实验方案]klp-6::gfp], myIs16[ Pklp-6::tdTomato] 或 qIs56[实验方案]lag-2::gfp])12, 20, 21. 注意：如果 q使用Is56时，GFP的表达在dauer蜕皮开始数小时后才会在IL2Qs中可见，且一些初始的重塑事件将无法观察到。此外，尽管来自P的荧光信号lag-2::gfp 在dauer期间，IL2s中的转基因最终比P更亮klp-6 荧光的报告基因，Plag-2::gfp 转基因在头部肌肉中也有微弱表达，可能会掩盖精细的IL2分支。</li>
	<li>产卵后，移除成年雌雄同体线虫，用封口膜密封培养板，在25 °C下孵育34小时17注意：个体间进入dauer蜕皮所需时间略有差异。树突分支化的最快速阶段始于dauer蜕皮开始后4 - 5小时（在25 °C条件下，产卵后39 - 44小时）。12.</li>
	<li>成像前一天，配制10%（v/v）的溶液w/v) 在含有EC浓度的滞育信息素的M9缓冲液中制备琼脂糖90 浓度。取约100 µl琼脂糖置于显微镜载玻片上，迅速但轻柔地将另一张载玻片盖在上面，以形成平整的琼脂糖表面。待琼脂糖凝固后，用保鲜膜包裹载玻片，并置于湿度 chamber（移液器吸头盒内放置湿纸巾）中保存。</li>
	<li>34小时孵育后，检查信息素平板上停止咽泵运动的线虫。将载玻片分开，使仅一片载玻片的一面带有琼脂糖。挑取一条或多条线虫至10%琼脂糖垫上，并1 µ0.1 微米聚苯乙烯微球22注意：当种群同步性良好时，培养皿中的大部分线虫将处于从L2d期向dauer期蜕皮的阶段。然而，个体之间可能存在差异。因此，需要结合其他特征（如口咽封闭、咽部重塑）来判断动物处于dauer蜕皮阶段的时间（参见代表性结果示例）。</li>
	<li>确定线虫的方向（左右、背腹）。使用100倍放大镜，以尽可能低的荧光强度，每隔15分钟或根据具体实验需要对IL2Q树突进行Z轴层扫成像。持续采集图像，直至线虫脱离L2d角质层导致无法固定，或动物已从dauer状态恢复（咽部开始抽吸）。在不进行成像时，将载玻片置于湿度 chamber 中。注：我们使用配备电动载物台和微分干涉差（DIC）光学系统的落射荧光显微镜。</li>
</ol>

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<li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li>
<li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

研究特定于dauer阶段的神经可塑性及其他与dauer相关的形态学变化，需要通过基因突变（例如 daf-c 突变体）或暴露于信息素的方式，实现对dauer形成过程的可控且可靠的诱导。尽管利用基因突变诱导dauer具有操作便利的优点，但可能干扰实验结果。因此，基于daf-c突变体所获得的数据，应进一步通过野生型动物经dauer信息素诱导进入dauer阶段的实验加以验证。
粗制滞育信息素的制备相对简单，已有多种该方案的变体被发表18。除可能的污染外，本文所述方法非常可靠。为制备提取物，我们采用在S培养基液体培养液中高密度培养线虫的标准方法19。接种至液体培养液中的初始线虫接种量在数量上具有较大灵活性。起始时使用较多数量的线虫可加快实验进程。然而，必须确保所有初始接种的线虫均无污染。在液体培养基中培养过程中可能产生真菌或细菌污染。真菌污染可通过菌丝的存在轻易检测。细菌污染则较难评估，通常若在规定的孵育时间后液体培养物未能迅速变澄清，则可能提示存在细菌污染。产生足量信息素所需的总线虫种群密度也具有一定灵活性。例...

表型可塑性，包括发育可塑性和行为可塑性，在生物适应不利环境条件中起重要作用，并被认为是推动进化的关键力量1。C. elegans 是发育生物学和神经生物学研究中常用的一种模式生物。在理想条件下，C. elegans 经历四个幼虫阶段后进入成虫繁殖阶段。然而，在食物匮乏和种群密度较高的条件下，C. elegans 可发生发育转变，进入一种寿命较长且具有抗逆性的持存幼虫（dauer）阶段2。持存幼虫在形态和行为上表现出多种与非持存个体不同的特征，这些特征可能介导了其抗逆能力。调控持存幼虫形成的环境信号和遗传通路已有广泛研究和描述3, 4, 5, 6, 7。然而，控制持存形成过程中各个具体表型变化的分子机制仍了解较少。
观察特定于dauer期的表型需要制备dauer期动物。这可以通过三种方式实现：1）从饥饿培养的C. elegans群体中手动挑选，2）利用dauer期形成组成型（daf-c）突变体，3）通过纯化的信息素诱导dauer期形成。从标准NGM平板上挑选dauer期个体相对简单，该平板上的C. elegans种群已耗尽其细菌食物来源。在我们的实验条件下，一个标准NGM平板最初接种50 µl OP50 Escherichia coli，培养3天&#160;后接种3–4条成年雌雄同体线虫，并在25 °C下培养，通常在一周内耗尽食物，并在随后的3天内产生数千条dauer期幼虫（同时还有大量饥饿但未进入dauer期的非dauer个体）。然而，该方法不适合研究进入dauer期过程中的蜕皮事件。在典型的饥饿平板上，难以确定数千条个体中哪些正处于进入dauer期的阶段。此外，使用饥饿平板无法实现发育同步化。利用daf-c突变体可实现发育同步并稳定地获得dauer期个体。但需注意，特定的daf-c突变本身或与其他突变组合时，可能会影响其他dauer期特异性表型，这一点无法完全排除。
Cassada 和 Russell 首次提出存在滞育幼虫信息素，随后由 Golden 和 Riddle 证实。此后，该滞育幼虫信息素已被化学表征2, 8, 9, 10。纯化后的信息素由多种蛔甙（ascarosides）组成的复杂混合物构成，不同形式的蛔甙可调控行为和发育过程9, 11。使用粗提的滞育幼虫信息素提取物可在野生型背景下可靠地诱导同步化的滞育幼虫形成。
在滞育幼虫形成过程中，神经系统及相关胶质细胞会发生重塑12, 13, 14。其中一些变化是不可逆的，例如滞育期间胶质细胞的重塑13, 14；但其他一些重塑事件在环境条件恢复适宜时则可逆转。例如，一组四个IL2Q神经元在滞育形成期间会发生快速且可逆的神经元重塑，包括：树突分支化、从单树突神经元转变为多树突神经元，以及轴突重塑12。本文所述方法可实现对模式生物中应激诱导的神经可塑性进行可靠的体内成像。文中所介绍的粗提滞育信息素的制备与检测方法，此前已有描述，并综合自多个文献来源4, 8, 15, 16, 17, 18。

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 布里斯托尔品系</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>向 Schroeder 实验室申请获取</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>向 Schroeder 实验室申请获取</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 大肠杆菌</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308，35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM 琼脂</td><td>多种来源</td><td></td><td>将 3 g NaCl、17 g 琼脂、2.5 g 蛋白胨溶于 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中，高压灭菌后冷却至 55&amp;deg;C，再加入 1 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇、25 ml 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液（pH 6.0）、1 ml 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S 培养基</td><td>多种来源</td><td></td><td>S 培养基由 S 基础溶液（1.46 g NaCl、0.25 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、0.25 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇，加 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至 250 ml，高压灭菌）组成。向 S 基础溶液中加入 2.5 ml 柠檬酸钾缓冲液（pH 6.0）（将 2 g 一水柠檬酸、29.4 g 一水三柠檬酸三钾&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 加至 100 ml，高压灭菌）、2.5 ml 微量金属溶液（1.86 g 乙二胺四乙酸二钠、0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，加 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至 1 L，高压灭菌后避光保存）、0.75 ml 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 0.75 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;。</td></tr><tr><td>用于剂量-反应实验的滞育信息素平板</td><td>多种来源</td><td></td><td>在 6 支 15 ml 培养管中，每管加入 0.085 g 贵族琼脂、0.5 ml 0.513 M NaCl 和 5 &amp;micro;l 溶于乙醇的 5 mg/ml 胆固醇。向每管中加入适量粗提信息素，以形成一系列浓度梯度。加 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至总体积为 4.725 ml。&amp;nbsp; 在本生灯上煮沸至琼脂完全溶解，然后冷却至 55 &amp;deg;C。向每管中加入 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 缓冲液（pH 6.0）、50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 50 &amp;micro;l 5 mg/ml 硫酸链霉素。&amp;nbsp; 将每管内容物倒入一个直径为 35 mm 的培养皿中。室温下静置过夜使琼脂凝固（若存放时间更长，应置于密闭容器中以防过度干燥）。</td></tr><tr><td>0.1 微米微球珠</td><td>Polysciences 公司</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td>多种来源</td><td></td><td>将 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至 1 升，高压灭菌灭菌</td></tr></tbody></table>

体内成像观察c. elegans中dauer特异性神经元的重塑

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

控制动物应激诱导表型可塑性的机制通常十分复杂且难以研究 体内一种典型的应激诱导可塑性实例是线虫的dauer阶段 秀丽隐杆线虫滞育幼虫是在细菌食物浓度较低且存在高浓度滞育信息素的条件下形成的一种替代性发育幼虫阶段。滞育幼虫表现出显著的发育和行为可塑性。例如，一组位于唇区的内唇四分体（IL2Q）神经元在滞育形成过程中会发生广泛的可逆性重塑。本文展示了利用已知调控滞育进入的环境通路，从大规模液体线虫培养物中制备粗提滞育信息素的既定方法。采用该方法，当液体培养物中线虫密度达到每毫升50,000至75,000条时，即可产生具有高度活性的粗提滞育信息素。粗提信息素的活性通过剂量-反应生物测定法进行评估。最后，文中还介绍了用于 体内 描述了在滞育形成期间对IL2Qs进行的延时成像。

粗提滞育信息素的产物为黄色液体（图1），具有耐热和耐寒的稳定性。粗提信息素分装后可于-20 °C长期保存，活性无明显损失。信息素制备完成后，通过一次剂量-反应生物测定即可对其活性进行粗略评估。然而，对于大多数实验而言，需重复生物测定2–3次，并取每次实验的平均值进行分析。图3展示了两次信息素生物测定的代表性结果。根据这些数据可计算出EC50和EC90。
除了对十二烷基硫酸钠具有抗性外2，滞育幼虫还可通过多种形态学特征进行识别，包括封闭的口孔、侧翼纵脊、前部表皮下折射体以及萎缩的咽部（图2 和 图4A 显示L2幼虫）。滞育幼虫还具有若干独特的行为特征，包括：倾向于保持行为静止、存在一种称为立起行为（nictation）的偶发扩散策略、抑制头部觅食运动、抑制咽部抽吸活动以及诱导排泄管节律性搏动2, 5, 23。这些行为特征在个体间存在变异。
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在暴露于特定环境应激因素后，线虫Caenorhabditis elegans会经历广泛的表型可塑性，从而进入一种抗逆境的“dauer”幼虫阶段。本文介绍了在dauer阶段期间对神经可塑性进行可控诱导和成像的方法。

体内成像观察C. elegans中dauer特异性神经元的重塑

控制动物应激诱导表型可塑性的机制通常十分复杂，且难以在体内进行研究。一个经典例子是……

本实验的总体目标是对秀丽线虫中特定感觉神经元的重塑进行成像。该目标的实现分为两个步骤：首先从液体培养物中提取粗制的吸引性信息素，第二步是测定该粗制信息素的活性强度。接下来，利用信息素诱导在IL2神经元中表达GFP的动物形成嗅突。最后一步是在DMT阶段将动物固定于显微镜载玻片上，进行活体成像以观察树突分支情况。该方法有助于回答神经可塑性领域中的一些关键问题，例如神经元如何响应环境条件而发生重塑。尽管该方法可用于研究幼虫第二次蜕皮过程中的表皮重塑，但也同样适用于其他特定发育事件，例如咽部重塑。开始此操作时，挑取单个菌落的OP50大肠杆菌，在37摄氏度、200 RPM振荡条件下，于100毫升LB液体培养基中过夜培养。随后，将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）培养于15至26厘米的NGM琼脂平板上，每板接种50微升上述大肠杆菌，继续培养直至细菌几乎耗尽。接下来，通过接种1毫升大肠杆菌，在4升LB肉汤中培养大肠杆菌，于37°C振荡培养16小时。随后，用1毫升S基础溶液从平板上冲洗线虫。将4至5板的线虫转移至1升的S培养基锥形瓶中，将大肠杆菌在650 ×g下离心10分钟，弃去上清液，将每份菌体沉淀重悬于10毫升S基础溶液中。随后，将等量重悬的细菌转移至每个含有线虫的烧瓶中。将烧瓶置于室温下的旋转摇床上，以100至150 RPM振荡培养四天，直至溶液开始变澄清，这表明食物已耗尽。一旦食物耗尽，将大肠杆菌在四份1升LB肉汤培养基中过夜培养。然后在650 ×g 条件下离心细菌10分钟。将细菌沉淀加入含有线虫的S培养基锥形瓶中，并将所有S培养基锥形瓶放回摇床培养箱中继续培养三至四天，直至食物再次耗尽。随后，取1毫升溶液转移到培养皿中，在体视显微镜下计数线虫数量。接下来，在4°C条件下，以4,000 G离心线虫10分钟，弃去线虫沉淀，保留上清液。然后将上清液通过Whatman 1号滤纸过滤。再使用0.45微米的无菌真空滤器进一步过滤上清液。随后，将滤液加入一个含有搅拌子的2升烧杯中。将其置于通风橱内的加热搅拌板上，边搅拌边加热至沸腾，并浓缩至约200毫升。接着，将溶液转移至500毫升烧杯中，继续煮沸，直至剩余体积约为50毫升。冷却后，在1000 ×g 条件下离心5分钟。然后将上清液倒入100毫升烧杯中，弃去沉淀。接着将上清液煮沸至形成棕色结晶物。之后从热源上移开，用刮勺将结晶物捣碎。加入足量的200度乙醇以浸没沉淀物。用封口膜盖住烧杯，室温下静置过夜。然后将乙醇倒入一个干净的烧杯中，并置于一旁备用。加入新鲜乙醇覆盖沉淀物，重复过夜提取三次，随后合并提取液。之后，使用真空泵干燥乙醇提取物。若无真空泵，可将乙醇提取液转移至洁净烧杯中，在通风橱中边搅拌边加热至50摄氏度。然后将残留物溶于10毫升无菌蒸馏水中。使用0.22微米注射器滤器对该溶液进行除菌，分装为1

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神经科学

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亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

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动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

本方案描述了一种简单的微流控芯片设计及微加工方法，可用于在持续供应食物的条件下培养秀丽隐杆线虫（C.

一种用于长期培养与成像的简易微流控芯片 秀丽隐杆线虫

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

学习利用活体成像技术观察秀丽隐杆线虫在dauer阶段的神经元重塑过程。该方法通过提取粗制dauer信息素诱导幼虫进入滞育状态，结合GFP标记的IL2神经元实时成像，揭示环境应激下神经可塑性的分子机制。

体内成像观察C. elegans中dauer特异性神经元的重塑

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