体内成像观察C. elegans中dauer特异性神经元的重塑

本实验的总体目标是对秀丽线虫中特定感觉神经元的重塑进行成像。该目标的实现分为两个步骤：首先从液体培养物中提取粗制的吸引性信息素，第二步是测定该粗制信息素的活性强度。

接下来，利用信息素诱导在IL2神经元中表达GFP的动物形成嗅突。最后一步是在DMT阶段将动物固定于显微镜载玻片上，进行活体成像以观察树突分支情况。该方法有助于回答神经可塑性领域中的一些关键问题，例如神经元如何响应环境条件而发生重塑。

尽管该方法可用于研究幼虫第二次蜕皮过程中的表皮重塑，但也同样适用于其他特定发育事件，例如咽部重塑。开始此操作时，挑取单个菌落的OP50大肠杆菌，在37摄氏度、200 RPM振荡条件下，于100毫升LB液体培养基中过夜培养。随后，将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）培养于15至26厘米的NGM琼脂平板上，每板接种50微升上述大肠杆菌，继续培养直至细菌几乎耗尽。

接下来，通过接种1毫升大肠杆菌，在4升LB肉汤中培养大肠杆菌，于37°C振荡培养16小时。随后，用1毫升S基础溶液从平板上冲洗线虫。将4至5板的线虫转移至1升的S培养基锥形瓶中，将大肠杆菌在650 ×g下离心10分钟，弃去上清液，将每份菌体沉淀重悬于10毫升S基础溶液中。

随后，将等量重悬的细菌转移至每个含有线虫的烧瓶中。将烧瓶置于室温下的旋转摇床上，以100至150 RPM振荡培养四天，直至溶液开始变澄清，这表明食物已耗尽。一旦食物耗尽，将大肠杆菌在四份1升LB肉汤培养基中过夜培养。

然后在650 ×g 条件下离心细菌10分钟。将细菌沉淀加入含有线虫的S培养基锥形瓶中，并将所有S培养基锥形瓶放回摇床培养箱中继续培养三至四天，直至食物再次耗尽。随后，取1毫升溶液转移到培养皿中，在体视显微镜下计数线虫数量。

接下来，在4°C条件下，以4,000 G离心线虫10分钟，弃去线虫沉淀，保留上清液。然后将上清液通过Whatman 1号滤纸过滤。再使用0.45微米的无菌真空滤器进一步过滤上清液。

随后，将滤液加入一个含有搅拌子的2升烧杯中。将其置于通风橱内的加热搅拌板上，边搅拌边加热至沸腾，并浓缩至约200毫升。接着，将溶液转移至500毫升烧杯中，继续煮沸，直至剩余体积约为50毫升。

冷却后，在1000 ×g 条件下离心5分钟。然后将上清液倒入100毫升烧杯中，弃去沉淀。接着将上清液煮沸至形成棕色结晶物。之后从热源上移开，用刮勺将结晶物捣碎。

加入足量的200度乙醇以浸没沉淀物。用封口膜盖住烧杯，室温下静置过夜。然后将乙醇倒入一个干净的烧杯中，并置于一旁备用。

加入新鲜乙醇覆盖沉淀物，重复过夜提取三次，随后合并提取液。之后，使用真空泵干燥乙醇提取物。若无真空泵，可将乙醇提取液转移至洁净烧杯中，在通风橱中边搅拌边加热至50摄氏度。

然后将残留物溶于10毫升无菌蒸馏水中。使用0.22微米注射器滤器对该溶液进行除菌，分装为1毫升，于-20摄氏度保存。

在此步骤中，称量一个微量离心管。向管中加入一毫升过夜培养的 equali 菌液，在 17,000 ×g 条件下离心。然后移除所有上清液，再次称量该离心管，以确定细菌沉淀物的重量。

随后，用M9缓冲液重悬沉淀，制成终浓度为4%（重量/体积）的溶液。取10微升菌液，点样于每个信息素平板的中心，将平板在室温下过夜孵育。

在成虫蜕皮后一天，将10至15只晚期幼虫转移到野生型雌雄同体个体至信息素平板上。将平板置于25摄氏度环境中孵育三至四小时。随后移除所有成年雌雄同体个体。

记录每块培养板上产卵的数量。用封口膜密封培养板，置于25摄氏度条件下孵育三天，随后统计dauer幼虫的比例。接着，使用EC90值制备dauer信息素培养板，在产卵后利用携带整合型IL2报告转基因的菌株诱导dauer幼虫形成。

移除成年雌雄同体。用封口膜密封培养皿，并在成像前一天于25摄氏度下孵育34小时。在M9缓冲液中配制含10%（重量/体积）琼脂糖的溶液，并加入浓度为EC90的doer信息素分装液。

取约100微升琼脂糖滴加到显微镜载玻片上，迅速而轻柔地将另一张载玻片盖在上面，以形成平整的琼脂糖表面。待琼脂糖凝固后，将两张载玻片分开。用保鲜膜包裹载玻片，并置于湿度培养 chamber 中保存。经过34小时孵育后，观察信息素平板上停止咽部泵动的线虫。

将载玻片分开，使载玻片仅一侧表面含有琼脂。用一微升0.1微米聚苯乙烯微珠将一条或多条线虫转移至10%琼脂垫上，然后确定线虫的方位。以100倍放大倍数，每隔15分钟或根据具体实验需要，以尽可能低的荧光强度对IL2Q树突采集Zack图像。

该图显示了秀丽隐杆线虫在不同滞育幼虫阶段的微分干涉差（DIC）右侧侧面显微图像。此为一L2期个体，具有典型的圆形末端咽部球状结构。蜕皮进入滞育期约三小时后，末端咽球开始收缩，L2d期角质层正逐渐与新形成的滞育期角质层分离。

大约在蜕皮开始后10小时，该动物已发生显著的径向收缩，并从L2D期角质层完全脱离。有时仍可见L2D期衬有角质层的排泄管附着于正在发育的dower结构上。图中显示的是表达IL2报告基因的单个动物的侧向表观荧光显微图像。

这些插图显示了在蜕皮开始后不同时间点的 IL 两 Q 树突。在蜕皮开始后约五小时，IL 两 Q 分支迅速发生。在尝试纯化蜕皮信息素时，务必注意使用无菌技术以防止污染。

观看本视频后，您应能充分理解如何纯化粗提的蜂巢信息素并评估其活性，以及如何利用该信息素对体内蜂巢特异性重塑过程进行成像。