Name: 器官切片文化研究少突胶质细胞动力学和髓鞘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 探索利用器官切片培养技术研究少突胶质细胞动力学和髓鞘形成的方法。该方法通过维持组织细胞结构，实现对NG2细胞增殖与分化的实时成像分析，为神经发育和脱髓鞘疾病研究提供重要工具。

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本工作由美国国家多发性硬化症协会（A.N. 获资助号 RG4179）、美国国立卫生研究院（A.N. 获资助号 NIH R01NS073425 和 R01NS074870）以及美国国家科学基金会（A.N.）的资助项目支持。我们感谢德国萨尔兰大学洪堡校区的 Frank Kirchhoff 博士提供 PLPDsRed 转基因小鼠。我们感谢孙幼芬在维持转基因小鼠品系方面提供的协助。

注意：所有动物实验操作均遵循相关指南，并已获得康涅狄格大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
注意：在这些实验中，分别使用了组成型 NG2cre18（JAX#008533）和诱导型 NG2creER16（JAX#008538）转基因小鼠，与 Z/EG19（JAX#003920）或 gtRosa26:YFP 报告基因小鼠20（JAX#006148）杂交，以成像 NG2 细胞及其子代。为成像成熟的少突胶质细胞，使用了 PLPDsRed 转基因小鼠21。为保证一致的存活率，可从出生后第 10 天以内的小鼠前脑和小脑中分离脑片。
1. 切片制备
<ol>
	<li>在超净工作台中，将组织培养小室放入六孔板，并加入 1 ml 切片培养基（配方见试剂部分）。在解剖前至少 2 小时，将六孔板置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养孵箱中。</li>
	<li>用 70% 乙醇对所有工具和组织切片机进行灭菌。</li>
	<li>将解剖缓冲液（配方见试剂部分）在冰上用 95% &#160;O2 和 5% CO2 气体饱和至少 15 分钟&#160;，解剖开始前完成此步骤。</li>
	<li>根据批准的动物实验方案，将幼鼠置于冰上麻醉 5–10 分钟。通过轻捏尾部和脚趾确认动物无反应，以判断麻醉深度是否合适。</li>
	<li>按照动物实验规程，使用锋利的剪刀将动物断头。使用已灭菌的工具，先做矢状切口，再做侧向切口，迅速移除覆盖前脑和小脑的颅骨。通过轻轻将脑组织侧向翻转，小心切断脑干腹侧的颅神经。</li>
	<li>将组织放入含有冰冻且充氧的无菌解剖缓冲液的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>使用剃须刀片将小脑和前脑分离，然后沿中线做矢状切口，将左右半球分开。</li>
	<li>使用手动组织切片机切割前脑和小脑的 300 μm 厚的冠状面或矢状面切片。注：手动组织切片机可在无需琼脂糖包埋的情况下，实现从解剖到培养孵育的快速处理。也可使用振动切片机，方法如前所述9。</li>
	<li>将分离的脑片转移至盛有新近充氧的冷解剖缓冲液（置于冰上）的培养皿中。</li>
	<li>使用小型解剖铲或称量铲分离单个脑片，并将其转移至预先孵育的含组织培养小室的六孔板中。</li>
	<li>使用一次性移液管或 P200 移液器吸头，吸除培养小室表面多余的解剖缓冲液。每个培养小室可放置 2–3 个前脑切片或 3 个小脑切片。 
	注：为了获得稳定的前脑培养结果，建议选取跨越胼胝体前三分之一区域的切片（图 1A），以便在同一脑片中同时研究灰质和白质区域。每只动物通常可获得 6 个前脑切片和 6 个小脑切片。</li>
	<li>将六孔板放入孵箱中培养，并在脑片制备后的第 1 天更换 1 ml 新鲜切片培养基，之后每隔一天更换一次，直至脑片固定。</li>
	<li>根据实验需要，在培养 5–7 天后使用脑片。仅使用在培养最初几天内变得透明的脑片，弃用存在不均匀浑浊区域的脑片。注：脑片内的浑浊区域肉眼可见，在相差显微镜下表现为成团的暗色细胞。当技术熟练后，死亡或浑浊的脑片发生率极低，通常少于 1–5%。</li>
</ol>
2. NG2细胞分裂和少突胶质细胞分化的延时成像
注意：为了对NG2细胞的增殖和分化进行延时成像，我们使用NG2cre:ZEG小鼠16，该小鼠在NG2细胞及其子代细胞中表达EGFP（图1C-E）。该品系中的报告基因表达足够强，可在脑片切片后立即进行活体成像，并在至少四周的时间内持续观察到GFP+细胞。在培养的最初3-5天，脑片经历一个初始变薄阶段，此后可获得最清晰的图像。
<ol>
	<li>整个实验过程中，将脑片置于37 °C的细胞培养孵育箱中，仅在短暂时间内（每片少于15分钟）取出，成像时保持六孔板的盖子盖好。</li>
	<li>使用配备数字相机的倒置荧光显微镜，采用10倍物镜在第一个时间点采集图像。注意：首个时间点根据实验设计而定，可以是脑片制备当天，也可以是之后的任意时间点。</li>
	<li>在第一个时间点，对脑片的灰质和白质区域内的多个部位进行成像。通过脑片内的特定解剖标志以及在示意图上标记图像位置来记录成像区域，以便后续成像会话时准确定位。可用的解剖标志包括脑片边缘和/或白质纤维束的走向。每个时间点在每片脑片上采集4至8个位置的图像。</li>
	<li>若研究NG2细胞分裂及少突胶质细胞分化，则后续图像采集间隔为4–6小时，理想情况下持续5–7天。</li>
	<li>在最后时间点对所有区域进行最终成像，随后立即固定脑片。向培养插件底部加入1 ml固定液（含0.1 M L-赖氨酸和0.01 M偏亚硫酸氢钠的4%多聚甲醛），再在脑片上方加入1 ml固定液。注意避免将固定液直接喷洒在脑片上，以防脑片从膜上脱落。固定组织30分钟&#160;，然后按照第4节所述方法，使用发育阶段特异性标记物进行免疫组织化学染色。</li>
	<li>用0.2 M磷酸钠缓冲液清洗脑片，每次10分钟，共洗3次。如有必要，可在免疫染色前将脑片在4 °C的0.2 M磷酸钠缓冲液中保存1–3天，但最好在24小时内完成染色。随后按照下文第4节所述方法进行免疫组织化学染色，以确定分化为少突胶质细胞的细胞比例（图2D–F）。</li>
</ol>
3. 利用可诱导型报告转基因小鼠在脑片培养中对NG2细胞子代进行命运图谱分析
注意：为了追踪培养过程中某一特定时间点 NG2 细胞的命运，可使用可诱导型 NG2creER:YFP 转基因小鼠。
<ol>
	<li>通过向培养基中添加溶于乙醇的100 nM 4OHT，诱导Cre重组及报告基因表达。注意：报告基因阳性细胞应在1-2天内出现，诱导效率约为20-25% YFP+NG2+/NG2+细胞；在此时间点，所有阳性细胞均处于NG2细胞阶段（图2A-C）</li>
	<li>在不同时间点对经过各种处理（见2.5和2.6节）的脑片进行固定和洗涤。</li>
</ol>
4. 切片免疫组织化学
<ol>
	<li>使用手术刀将带有切片的膜从插入物中切割下来。</li>
	<li>用镊子将切片转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板的各个孔中，注意在夹取膜时避免破坏切片结构。</li>
	<li>将切片转移至含有封闭液（含5%正常山羊血清（NGS）和0.1% Triton-X100的PBS）的24孔板中，室温孵育1小时。</li>
	<li>在4 °C条件下，将切片与一抗在含5% NGS的PBS中孵育过夜。为鉴定处于NG2细胞阶段的细胞，使用针对NG2和PDGFRα的抗体；为鉴定已分化的少突胶质细胞，使用针对腺瘤性息肉病蛋白抗原（APC；克隆CC1）的抗体。</li>
	<li>第二天，用PBS清洗切片，每次15分钟，共洗3次；然后在室温下将切片与含5% NGS的PBS中的二抗孵育1小时。再次用PBS清洗切片，每次15分钟，共洗3次，随后将切片转移到载玻片上。放置时切片朝上，膜面朝向载玻片，以确保膜不会位于物镜与组织之间。</li>
</ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益

中枢神经系统中的髓鞘形成对高效的神经元通讯和轴突存活至关重要22。NG2细胞在整个成年期持续生成可形成髓鞘的少突胶质细胞，同时在大多数脑区维持一个稳定的细胞群体16,23–25。尽管已有研究描述了一些调控这些细胞分化的遗传和分子机制，但仍有许多未知有待探索。由于脑片培养体系能够保持解剖区域的完整性、便于操控细胞外环境、具有较强的髓鞘形成能力，并包含所有主要的细胞类型，因此成为研究这些机制的便捷工具。这些特性有助于研究NG2细胞、少突胶质细胞与轴突之间短期和长期的相互作用11,26。此外，细胞移植在该体系中较易操作，可用于研究不同脑区对细胞行为的区域依赖性差异17。同时，可通过向培养基中添加药理学试剂，研究影响NG2细胞增殖和/或分化的分子机制，适用于正常17,27,28及脱髓鞘培养模型15,29。最后，利用脑片培养体系在技术上可行地开展高通量化合物筛选，以鉴定能够促进NG2细胞增殖或分化的分子，甚至可在脱髓鞘损伤后进行此类筛选30。
...

中枢神经系统器官型脑片培养已被证明是在半完整系统中研究神经元和胶质细胞生物学的极为有效的手段1–4。这类培养方法相对易于建立，同时保留了原代分离细胞培养的诸多优势，例如可调控细胞外环境，并便于进行长期重复的活细胞成像和电生理记录5–9。此外，脑片培养能够维持组织的三维细胞结构、区域性的神经连接，且系统中存在绝大多数主要的细胞类型。这些特性使得脑片培养成为研究单个细胞行为与生理功能及其与细胞和环境相互作用的独特而便捷的系统。
NG2细胞是哺乳动物中枢神经系统中的一类胶质细胞，在胚胎期和出生后发育过程中持续增殖并生成有髓鞘的少突胶质细胞10。这类细胞已在分离的原代细胞培养体系中得到广泛研究，而近年来建立的在NG2细胞中特异性表达荧光蛋白的转基因小鼠品系，为活体命运图谱绘制以及急性脑片标本中的电生理记录提供了便利。in vivo 尽管已有这些研究，目前对NG2细胞增殖及少突胶质细胞分化的时间动态仍知之甚少。虽然分离细胞培养因其在药理学和遗传学操作上的相对便利而被广泛应用，但它并不适用于探究这些细胞在不同脑区中的功能差异，尤其是在需要维持细胞微环境背景的情况下。脑片培养则提供了一种简便的替代方法，适用于进行药理学干预，并已被用于研究少突胶质细胞的髓鞘形成11,12、溶血卵磷脂（LPC）或抗体诱导脱髓鞘后的细胞反应13,14，以及通过药物处理诱导再髓鞘化的过程15。
本文介绍了一种用于研究前脑和小脑来源的器官型脑片培养物中NG2细胞增殖及少突胶质细胞分化的活体成像和固定组织（或后固定）分析的方法。该方法可用于研究单个NG2细胞分裂后的细胞命运16，并揭示生长因子诱导的NG2细胞增殖在不同脑区和年龄阶段的差异17。这一相对简便的技术易于推广，有助于进一步探究调控这些胶质细胞生理功能的细胞内在机制和/或微环境因素，以及它们对神经元活动或髓鞘损伤的响应。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;切片培养基&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30074.03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">用 NaOH 调节至 pH 7.22，使用瓶顶滤器过滤，并在 4 摄氏度下保存</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;解剖缓冲液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（无水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">使用瓶顶滤器过滤，并在 4 摄氏度下保存，使用前用 95%O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体混合物充氧</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;其他试剂与耗材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬（4OHT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>偏高碘酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>兔抗 NG2 抗体</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>小鼠抗 CC1 抗体</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>小鼠抗 Ki67 抗体</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>小鼠抗 NeuN 抗体</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>种属特异性二抗</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>含 DAPI 的封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 培养膜插件，孔径 0.45&amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 与 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体混合物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌六孔板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖（海马）或称量用刮勺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手动或自动组织切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 和 60 mm 无菌培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

表达NG2的细胞（多突胶质细胞，少突胶质细胞前体细胞）是中枢神经系统中的第四类主要胶质细胞群体。在胚胎期和出生后发育过程中，这些细胞活跃增殖并生成形成髓鞘的少突胶质细胞。以往通常在原代分离培养、神经元共培养以及固定组织中对这些细胞进行研究。利用新近可用的转基因小鼠品系，可通过脑片培养系统研究前脑和小脑灰质与白质区域中少突胶质细胞谱系细胞的增殖与分化。脑片培养物取自出生早期的小鼠，可在体外培养长达1个月。在培养期间可对这些脑片进行多次成像，以研究细胞行为及其相互作用。该方法可实现对NG2细胞分裂过程及向少突胶质细胞分化各阶段的可视化观察，同时能够对不同脑区依赖性的NG2细胞和少突胶质细胞功能异质性进行详细分析。这是一种强大的技术，可在高度接近体内（in vivo）的细胞环境中，随时间推移研究影响这些细胞的内在与外在信号。

以下展示了使用P8阶段NG2cre:ZEG、NG2creER:YFP和PLPDsRed转基因小鼠品系的前脑和小脑脑片培养所获得的代表性数据。NG2细胞可在前脑和小脑脑片中进行数天的活体成像（图1B-D，视频1），并在固定后通过NG2和CC1抗体免疫染色确定这些细胞的表型（图1E）。除了活体成像外，还可通过针对细胞增殖标志物（如Ki67）的免疫组织化学染色来评估细胞增殖情况（图1F）。这些数据可在单细胞水平上对NG2细胞分裂后少突胶质细胞分化的时间动态进行详细分析。在NG2creER:YFP小鼠脑片中加入4OHT诱导cre重组后，可对NG2细胞进行命运图谱追踪（图2）。在向培养基中添加4OHT两天后，培养物中即可检测到表达YFP报告基因的NG2+细胞（图2A）。4OHT诱导六天后，部分YFP+细胞已分化为CC1+少突胶质细胞（图2B）。这些结果表明，在脑片培养体系中可对NG2细胞进行命运图谱追踪，并可通过调控细胞外环境，研究药理学试剂或各...

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。

表达NG2的细胞（多突胶质细胞，少突胶质细胞前体细胞）是中枢神经系统中第四类主要的胶质细胞群体。在……

本实验的总体目标是在高度模拟体内环境的条件下，研究少突胶质细胞系细胞的增殖与分化过程。该目标通过以下步骤实现：首先制备出生后早期转基因小鼠大脑和小脑的脑片培养；随后对脑片中的单个细胞进行数小时至数天的连续成像，以观察其增殖和分化过程中的细胞动态变化。成像后，通过免疫组织化学方法对细胞进行染色，以确定多种细胞特征。最终结果可展示细胞在正常条件下以及经过药理学或遗传学干预后的增殖与分化动态。该技术相较于现有方法（如解离共培养、神经元培养以及胶质前体细胞培养）的主要优势在于，脑片培养能够在维持组织细胞结构的同时，对细胞外环境进行操控。所有动物实验操作均遵循相关指南，并已至少在解剖前两小时获得康涅狄格大学机构动物护理与使用委员会的批准。在六孔板中准备好组织培养插件，每孔加入一毫升切片培养基，然后在解剖前至少15分钟将板转移至37°C、含5%二氧化碳的细胞培养孵箱中。将解剖缓冲液置于冰上，并用95%氧气、5%二氧化碳气体进行鼓泡。同时确保所有工具和组织切片机已用70%乙醇灭菌。将组织转移至含有冰冷含氧解剖缓冲液的无菌35毫米培养皿中。接下来，使用剃刀刀片切断小脑和前脑，然后沿前脑和小脑的中线进行矢状切口，分离两侧半球。现在使用手动切片机，对四个端脑和小脑进行300微米厚的冠状面和矢状面切片。每只动物通常可获得六个端脑切片和六个小脑切片。理想情况下应获取胼胝体前三分之一区域的脑切片，以便在同一切片中研究灰质和白质区域。使用小型解剖镊或称量勺，将分离好的切片转移至冰上预先通入气体的冰冷解剖缓冲液中。分离各个切片，并将其转移至预温育的。六孔培养皿，内含培养插件。每个培养插件上可放置两到三个切片。用移液器吸除培养表面多余的解剖缓冲液。将培养板插入并转移至培养箱中，直至切片固定。切片制备后一天更换切片培养基，之后每隔一天更换一次，直至切片固定，具体操作按照实验方案进行。根据实验需要，在切片制备后第五至第七天使用切片。在培养过程中，仅使用最初几天后变得透明的切片，丢弃肉眼可见不均匀不透明区域的切片。在相差显微镜下，这些不透明区域表现为成团的暗色细胞。若操作正确，切片中出现死亡不透明区域的比例不超过1%至5%。为进行NG2细胞增殖与分化的延时成像，应使用表达EGFP的NG2细胞小鼠的3至5日龄脑切片。切勿使切片温度低于37摄氏度超过15分钟。每次成像时，保持培养板闭合，使用倒置荧光显微镜的 10 × 物镜首次采集培养物的时间点图像。在每一片切片的灰质和白质区域中，各选取四至八个位置进行成像。此外，应拍摄有助于重新定位的有用解剖标志图像，例如脑片边缘、特定细胞或白质纤维束的走向。先前时间点的图像可作为重新定位时的参考图像，用于NG2细胞分裂及少突胶质细胞分化的观察。理想情况下，每4至6小时拍摄一次图像，持续5至7天。若使用可诱导标记 NG two cre、ER YFP，则采用含有 100 纳摩尔 4-羟基他莫昔芬（溶于乙醇）的培养基诱导报告基因表达。报告基因活性应在一至两天内出现。固定时，向培养物底部加入一毫升固定液。插入并再加入一毫升固定液至切片上方。切勿将固定液直接喷洒在切片上，以免切片脱落。在4°C条件下固定组织30分钟，然后使用解剖刀。用镊子小心地将附着组织切片的膜取出，并转移到含有 PBS 的 24 孔板的各个孔中。接着，将切片转移至第二个含有封闭液的 24 孔板中，封闭液含 5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液。室温下在封闭液中孵育一小时。封闭完成后，将切片转移至含有5%正常羊血清（NGS）的PBS缓冲液配制的一抗溶液中，4°C孵育过夜。用 PBS 清洗切片。然后在含 5% NGS 的 PBS 中加入二抗孵育切片，在室温下孵育 1 小时。随后按照前述方法在PBS中再洗涤三次，并将切片膜面朝向载玻片封片，以避免膜位于物镜与组织之间。为分析少突胶质细胞分化的时序动态，连续多天获取出生后第8天（P8）NG2-CreER转基因小鼠前脑切片培养中NG2细胞分裂的图像，进行长达122小时的时间序列成像。通过NG2和CC1抗体染色确定分裂后细胞的表型。还通过细胞增殖标志物的免疫组织化学染色评估了细胞增殖。在NG二型CRE YFP小鼠脑片中诱导CRE重组后，进行了NG二型细胞的KI 67诱饵定位。添加4-羟基他莫昔芬两天后。在培养物中发现了表达YFP报告基因的NG2阳性细胞。四天后，其中一部分细胞分化为CC1阳性的少突胶质细胞。从P-L-P-D-S的小脑切片培养物中观察到了成熟的少突胶质细胞。这些培养物中存在来自红色小鼠的髓鞘化佩金神经元。重复成像显示，在这些脑片中添加了表达DS红色的髓鞘形成少突胶质细胞，免疫组织化学检测显示出大量髓鞘碱性蛋白的表达。最后，更高时间分辨率的成像揭示了稳定的少突胶质细胞胞体，其远端突起存在轻微运动。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备脑和小脑的脑片培养物，对单个细胞进行数天至数小时的重复成像，并利用免疫组织化学染色对成像细胞的命运进行后续分析。此外，这些脑片不仅可用于成像，还可结合细胞命运示踪技术（如在已制备脑片中使用可诱导的 Cre 重组系统），对细胞微环境进行操控。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

器官切片文化研究少突胶质细胞动力学和髓鞘

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

本视频展示了一种离体（ex vivo）诱导由细胞毒性 CD8+ T 细胞介导的脑细胞死亡的技术。在获取脑切片后，将活化的、靶向少突胶质细胞的 CD8+ T...

一种通过少突胶质细胞特异性CD8+ T细胞诱导神经元死亡的离体技术

来源：Kennedy, L. H., 等人 利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片中少突胶质细胞细胞器进行可视化与活体成像 视频实验杂志...

器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

为了研究炎性脱髓鞘疾病皮层病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制，需采用不同的动物模型。本文介绍一种离体（ex vivo）方法，即将少突胶质细胞特异性的CD8+...

一个 离体 少突胶质细胞靶向性T细胞攻击在急性脑切片中的模型

本文介绍了一种利用脑片组织培养技术研究海马体出生后神经发生的实验方法。该方法可实现 体外...

用于研究出生后神经发生的器官型脑片培养

器官型海马切片培养（OHSC）是一种 体外 模拟的模型 体内...

用于研究肿瘤细胞神经保护作用及侵袭性的海马组织切片器官型培养模型

髓鞘形成少突胶质细胞可促进动作电位的快速传导以及神经元的存活。本文描述了一种在脑片组织切片中实现少突胶质细胞特异性表达荧光蛋白的实验方案，并可进行后续的时间序列成像。此外，还介绍了一种简单的方法用于可视化未染色的髓鞘结构。...

利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片培养中少突胶质细胞器的可视化与活体成像

腺相关病毒，共聚焦显微镜，脑片培养，少突胶质细胞，细胞器，活体成像，髓鞘

本文介绍了一种从小鼠小脑制备脑片器官型培养物的方法，并通过免疫组织化学染色显示髓鞘，适用于研究中枢神经系统中髓鞘形成及再髓鞘化的机制。...

制备及髓鞘化器官型小脑切片培养物的免疫染色

离体脑片实验可实现动眼神经生长的实时成像。通过将 E10.5 IslMN:GFP...

利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

本文展示了一种高效纯化少突胶质细胞并制备少突胶质细胞条件培养基的方法，该培养基可用于共培养实验。...

少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

探索利用器官切片培养技术研究少突胶质细胞动力学和髓鞘形成的方法。该方法通过维持组织细胞结构，实现对NG2细胞增殖与分化的实时成像分析，为神经发育和脱髓鞘疾病研究提供重要工具。

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

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