用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

本实验的总体目标是在高度模拟体内环境的条件下，研究少突胶质细胞系细胞的增殖与分化过程。该目标通过以下步骤实现：首先制备出生后早期转基因小鼠大脑和小脑的脑片培养；随后对脑片中的单个细胞进行数小时至数天的连续成像，以观察其增殖和分化过程中的细胞动态变化。

成像后，通过免疫组织化学方法对细胞进行染色，以确定多种细胞特征。最终结果可展示细胞在正常条件下以及经过药理学或遗传学干预后的增殖与分化动态。该技术相较于现有方法（如解离共培养、神经元培养以及胶质前体细胞培养）的主要优势在于，脑片培养能够在维持组织细胞结构的同时，对细胞外环境进行操控。

所有动物实验操作均遵循相关指南，并已至少在解剖前两小时获得康涅狄格大学机构动物护理与使用委员会的批准。在六孔板中准备好组织培养插件，每孔加入一毫升切片培养基，然后在解剖前至少15分钟将板转移至37°C、含5%二氧化碳的细胞培养孵箱中。

将解剖缓冲液置于冰上，并用95%氧气、5%二氧化碳气体进行鼓泡。同时确保所有工具和组织切片机已用70%乙醇灭菌。将组织转移至含有冰冷含氧解剖缓冲液的无菌35毫米培养皿中。

接下来，使用剃刀刀片切断小脑和前脑，然后沿前脑和小脑的中线进行矢状切口，分离两侧半球。现在使用手动切片机，对四个端脑和小脑进行300微米厚的冠状面和矢状面切片。每只动物通常可获得六个端脑切片和六个小脑切片。

理想情况下应获取胼胝体前三分之一区域的脑切片，以便在同一切片中研究灰质和白质区域。使用小型解剖镊或称量勺，将分离好的切片转移至冰上预先通入气体的冰冷解剖缓冲液中。分离各个切片，并将其转移至预温育的。

六孔培养皿，内含培养插件。每个培养插件上可放置两到三个切片。用移液器吸除培养表面多余的解剖缓冲液。

将培养板插入并转移至培养箱中，直至切片固定。切片制备后一天更换切片培养基，之后每隔一天更换一次，直至切片固定，具体操作按照实验方案进行。根据实验需要，在切片制备后第五至第七天使用切片。

在培养过程中，仅使用最初几天后变得透明的切片，丢弃肉眼可见不均匀不透明区域的切片。在相差显微镜下，这些不透明区域表现为成团的暗色细胞。

若操作正确，切片中出现死亡不透明区域的比例不超过1%至5%。为进行NG2细胞增殖与分化的延时成像，应使用表达EGFP的NG2细胞小鼠的3至5日龄脑切片。切勿使切片温度低于37摄氏度超过15分钟。

每次成像时，保持培养板闭合，使用倒置荧光显微镜的 10 × 物镜首次采集培养物的时间点图像。在每一片切片的灰质和白质区域中，各选取四至八个位置进行成像。

此外，应拍摄有助于重新定位的有用解剖标志图像，例如脑片边缘、特定细胞或白质纤维束的走向。先前时间点的图像可作为重新定位时的参考图像，用于NG2细胞分裂及少突胶质细胞分化的观察。理想情况下，每4至6小时拍摄一次图像，持续5至7天。

若使用可诱导标记 NG two cre、ER YFP，则采用含有 100 纳摩尔 4-羟基他莫昔芬（溶于乙醇）的培养基诱导报告基因表达。报告基因活性应在一至两天内出现。固定时，向培养物底部加入一毫升固定液。

插入并再加入一毫升固定液至切片上方。切勿将固定液直接喷洒在切片上，以免切片脱落。在4°C条件下固定组织30分钟，然后使用解剖刀。

用镊子小心地将附着组织切片的膜取出，并转移到含有 PBS 的 24 孔板的各个孔中。接着，将切片转移至第二个含有封闭液的 24 孔板中，封闭液含 5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液。

室温下在封闭液中孵育一小时。封闭完成后，将切片转移至含有5%正常羊血清（NGS）的PBS缓冲液配制的一抗溶液中，4°C孵育过夜。

用 PBS 清洗切片。然后在含 5% NGS 的 PBS 中加入二抗孵育切片，在室温下孵育 1 小时。

随后按照前述方法在PBS中再洗涤三次，并将切片膜面朝向载玻片封片，以避免膜位于物镜与组织之间。为分析少突胶质细胞分化的时序动态，连续多天获取出生后第8天（P8）NG2-CreER转基因小鼠前脑切片培养中NG2细胞分裂的图像，进行长达122小时的时间序列成像。通过NG2和CC1抗体染色确定分裂后细胞的表型。

还通过细胞增殖标志物的免疫组织化学染色评估了细胞增殖。在NG二型CRE YFP小鼠脑片中诱导CRE重组后，进行了NG二型细胞的KI 67诱饵定位。添加4-羟基他莫昔芬两天后。

在培养物中发现了表达YFP报告基因的NG2阳性细胞。四天后，其中一部分细胞分化为CC1阳性的少突胶质细胞。从P-L-P-D-S的小脑切片培养物中观察到了成熟的少突胶质细胞。

这些培养物中存在来自红色小鼠的髓鞘化佩金神经元。重复成像显示，在这些脑片中添加了表达DS红色的髓鞘形成少突胶质细胞，免疫组织化学检测显示出大量髓鞘碱性蛋白的表达。最后，更高时间分辨率的成像揭示了稳定的少突胶质细胞胞体，其远端突起存在轻微运动。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备脑和小脑的脑片培养物，对单个细胞进行数天至数小时的重复成像，并利用免疫组织化学染色对成像细胞的命运进行后续分析。此外，这些脑片不仅可用于成像，还可结合细胞命运示踪技术（如在已制备脑片中使用可诱导的 Cre 重组系统），对细胞微环境进行操控。