Name: 蒸汽腔体建设用于公开小鼠酒精在所有三个学期人类发展的等效 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 了解如何构建可定制的酒精蒸汽腔体，用于模拟人类孕期三个阶段的胎儿酒精暴露。该小鼠模型可维持稳定血酒精水平，为发育生物学和神经科学研究提供重要工具。

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由美国国立卫生研究院资助项目 R01-AA015614、R01-AA014973、T32-AA014127 和 K12-GM088021 支持。作者感谢 Samantha L. Blomquist 提供的技术支持，以及 Kevin Caldwell 博士和 Donald Partridge 博士对稿件和视频的审阅与宝贵意见。

所有动物实验程序均经新墨西哥大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 气相室组装
<ol>
	<li>使用圆锯或曲线锯按照视频中提供的尺寸切割聚碳酸酯板，用于制作箱体的顶部、底部、前部、后部、侧面和门（图1 和 表1）。</li>
	<li>使用圆锯或曲线锯在前板中央切割一个高8英寸、宽16英寸的开口。</li>
	<li>测量并标记铰链安装孔的位置，位置为将作为箱门的18英寸×10英寸聚碳酸酯板上。</li>
	<li>在门板上使用5/16英寸钻头钻出沉头孔，并使用3/16英寸钻头钻出螺钉孔。确保沉头孔位于门内侧，以便螺钉头嵌入。</li>
	<li>准备聚碳酸酯板以进行焊接。</li>
	<li>使用Weld-on #16将前板、后板和侧板组装到底板上。</li>
	<li>使用Weld-on #16密封各板之间的所有缝隙。</li>
	<li>使用Weld-on #16将顶板固定到位。</li>
	<li>使用夹具或厚重的教科书固定所有部件，直至焊缝完全固化。</li>
	<li>在前板上距开口下方1英寸处，安装一段1英寸×12英寸的聚碳酸酯条，用于连接门铰链。</li>
	<li>确保Weld-on固化时间至少为24小时。</li>
	<li>截取两段12英寸长的PEX管和一段1英寸长的PEX管。</li>
	<li>使用5/16英寸钻头，在每段12英寸长的PEX管的一端约1至2英寸处钻孔。</li>
	<li>将两段12英寸长的PEX管连接至一个3/8英寸T型接头，确保钻孔方向远离接头。</li>
	<li>使用3/8英寸堵头封闭PEX管的开放端。</li>
	<li>使用4-40机械螺钉和螺母将铰链固定在前板和门上。</li>
	<li>以门为基准，在箱体前板上的1英寸间隔条上标记铰链所需的安装孔位置。</li>
	<li>使用3/16英寸钻头在前板上钻出铰链安装孔。</li>
	<li>使用4-40机械螺钉和螺母将门和铰链固定到前板上。</li>
	<li>按照视频所示方式组装快夹，快夹侧臂两侧各加一个垫圈和一个螺母。</li>
	<li>在前板上标记并钻出3/16英寸的孔，用于安装快夹，并使用4-40机械螺钉和螺母固定快夹。</li>
	<li>在门内侧安装3/8英寸橡胶密封圈。</li>
	<li>使用5/8英寸扩孔钻头在顶板中心钻孔，用于进气口。</li>
	<li>在后板底部中心位置钻一个1/2英寸的孔，用于出气口。</li>
	<li>通过将3/8英寸穿墙接头的螺纹部分从蒸气室后壁的出气口孔中穿出，组装出气口；从室内侧用螺母固定接头。</li>
	<li>去除聚碳酸酯板上的保护膜。</li>
	<li>将1英寸长的PEX管连接至T型接头，并从室内侧将PEX管强行穿过箱体顶部的孔。</li>
	<li>从外部在1英寸长PEX管的顶部连接一个3/8英寸90度弯头。 
	注意：在门上钻一个1/2英寸的孔，并将一个1/2英寸密封隔片插入该孔中。</li>
	<li>对仅通空气的对照室重复步骤1–22。</li>
</ol>
2. 支架与空气输送组件装配
<ol>
	<li>若将培养室放置在材料清单中提到的推车/架子上，请根据制造商的说明组装推车。</li>
	<li>使用备用螺母和螺栓，将一块废弃的聚碳酸酯板固定在架子上，用于安装气流调节器。</li>
	<li>在废弃的聚碳酸酯板任意位置标记并钻出3/4英寸的孔，用于安装气流调节器，并使用配套的螺母将调节器固定。</li>
	<li>将3/8英寸穿墙接头安装到气流调节器的进气口和出气口端口上。</li>
	<li>将乙醇瓶与曝气石、#8 塞子以及快速释放式管路连接器组装在一起。</li>
	<li>使用3/8英寸TYGON管路，按照图1所示方式将气流调节器连接至空气泵和乙醇瓶。</li>
	<li>对于仅通空气的培养室，按照图1所示，使用3/8英寸TYGON管路将气流调节器的出口端连接至3/8英寸90度弯头的进气口。</li>
</ol>
<img alt="乙醇蒸气化实验装置示意图，显示气流通过各腔室。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51839/51839fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 蒸气室装置的示意图。 一个三通接头连接至低噪声空气泵。三通接头的一侧直接连接至仅通空气蒸气室的气流调节器。另一侧再次分路，连接至两个不同的气流调节器，分别用于空气和乙醇。空气室如图所示直接连接至调节器。对于乙醇蒸气室，一个气流调节器连接至浸没在滤瓶内液态乙醇中的曝气石。滤瓶的侧臂接口连接至空气调节器的输出端，如图所示。混合后的乙醇蒸气与空气随后通入乙醇蒸气室的入口。出口管（未显示）连接至室内的通风排出口。
3. 测试蒸气室并调节乙醇浓度
<ol>
	<li>向滤瓶中加入 600 ml 190 proof 乙醇，插入通气石，并将进气管连接至滤瓶的侧臂。</li>
	<li>关闭腔室门，启动空气泵。</li>
	<li>调节气流调节器，使通过液体乙醇的空气流量约为与其混合的纯空气流量的一半。将仅通空气的气流调节至乙醇腔室中乙醇与空气的总流量。</li>
	<li>在测量空气中乙醇浓度前，让腔室至少平衡 30 min。</li>
	<li>通过隔膜使用 18G 针头和 60 ml 注射器抽取 5 ml 空气样品。通过将活塞回拉至 60 ml 处，用室内空气稀释该样品（1:12 稀释）。按照制造商说明使用呼气酒精检测仪测量空气中乙醇浓度。需要对腔室空气进行稀释，以使乙醇蒸气浓度处于呼气酒精检测仪的检测范围内。 
	注意：若使用不同浓度的乙醇暴露条件，可能需要调整稀释倍数。</li>
	<li>作为起始点，根据需要调节气流调节器，使空气中乙醇浓度达到约 4.5–5 g/dl（每 dl 空气中含 g 数的气化乙醇）。</li>
</ol>
4. 动物繁殖
<ol>
	<li>将雌性 C57BL/6 小鼠（2–3 月龄）以 2–3 只为一组共同饲养至少 1 周，以同步动情周期。</li>
	<li>将雄性 C57BL/6 小鼠（2–5 月龄）单独饲养至少 2 周。</li>
	<li>完成同步后，将一只雌鼠与一只雄鼠合笼饲养 5 天，以允许交配。</li>
	<li>交配结束后，移除雄鼠，将雌鼠单独分笼饲养并转移至实验用饲养盒中。</li>
</ol>
5. 孕前和产前乙醇蒸气暴露
<ol>
	<li>从妊娠开始，在光照周期内（光照时间为上午6点至下午6点），每天上午10点开始对孕鼠暴露于乙醇蒸气4小时，但分娩当天除外，以防止仔鼠死亡。</li>
	<li>在妊娠第5天（G5）、G13-G14和G18-G20天称量母鼠体重以监测妊娠情况；称重当天更换垫料，以尽量减少对动物的抓取。</li>
	<li>每天为乙醇暴露组更换食物，避免动物摄入吸收了乙醇的饲料颗粒。</li>
	<li>分娩当天不进行暴露。分娩后，从出生后第1天（P1）至第12天（P12），每天上午10点开始对母鼠和仔鼠暴露4小时。</li>
	<li>在P2、P8、P12和P25天称量仔鼠体重；并在P8和P12天更换垫料，以减少额外操作。</li>
	<li>最后一次暴露后（P12），立即将笼具转移至标准动物饲养室。</li>
</ol>

作者无披露事项。

本文详细描述了构建挥发性气体吸入舱的方法。建造这些吸入舱所需的材料和工具均可从多家商业供应商处轻松获得，且构建步骤相对简单。我们在此描述的系统不包含任何用于防止回流和混合的管路单向阀。我们在仅通空气的舱中未能检测到任何可测浓度的乙醇，表明乙醇未发生混合或倒流进入仅通空气的舱。应定期对仅通空气的舱进行乙醇蒸气检测（需注意，应在测试乙醇舱之前始终先测试空气舱，以避免呼气分析仪和/或注射器中残留乙醇蒸气的干扰）。理想情况下，应将吸入舱安置在动物饲养设施的专用房间内，以便在整个暴露实验期间持续安置小鼠笼具，避免运输小鼠，从而减少应激。该实验范式仅需配备通风出口的标准房间即可。然而，若房间与其他研究人员共用，则有必要将吸入舱置于带有独立隔间的房间内，以尽量减少其他动物接触乙醇气味。每个舱可容纳最多6个标准小鼠笼，因此相较于例如经口灌胃等方法，该方法劳动强度更低。
暴露范式可根据特定实验的需求轻松修改。可在相当于人类妊娠全部三个 trimester 的时期对动物进行乙醇暴露。需要注意的是，啮齿类动物发育阶段与人类发育的对应关系可能因所考虑的脑区以及所关注的发育过程（如神经发生、突触整合等）而有...

孕期饮酒可能对胎儿造成伤害，导致多个器官和系统的持久性改变，显著降低受影响个体及其家庭的生活质量。据估计，在美国约有10%-30%的女性在怀孕期间饮酒，其中1%-8%存在暴饮行为1,2。胎儿发育期间暴露于乙醇所引起的一系列效应统称为胎儿酒精谱系障碍（FASDs）。最近的估计表明，FASDs是一个重大的公共卫生问题，在美国的患病率高达2%-5%3。FASDs中最严重的表现形式是胎儿酒精综合征（FAS），其特征为生长迟缓、颅面异常以及神经行为缺陷，包括学习障碍。在美国，FAS的患病率估计为0.2%-0.7%3。目前可用于FASDs的治疗方法仅部分有效，而更有效疗法的开发受到对该复杂障碍谱系的细胞与分子机制理解不足的限制。
来自国家出生缺陷预防研究（NBDPS）的数据表明，孕妇饮酒最常见于妊娠早期st 妊娠早期（在妊娠尚未被检测出时），随后在妊娠的后期阶段禁用 2NBDPS 还发现，妊娠期间乙醇摄入的第二种最常见模式是在整个孕期的三个阶段均饮酒。2原因包括对胎儿乙醇暴露潜在危害的认识不足（即使在低剂量下）、产前保健获取受限、神经精神疾病既往史，以及乙醇滥用或依赖4有趣的是，国家出生缺陷预防研究（NBDPS）报告称，第三种最常见的消费模式是在孕早期完全禁酒st 和 2nd 3个孕期阶段，随后在第3孕期期间摄入rd 孕早期，此时常被认为饮酒是安全的，因为器官发生已基本完成。然而，3rd 孕早期是神经系统对乙醇损伤高度敏感的时期，因为此时神经元回路正在经历深刻的重塑过程2。NBDPS 还确定了孕期发生的其他较为少见的饮酒模式，包括整个孕期持续饮酒st 和 2nd 三个孕期阶段，随后在第3个阶段戒断rd 孕早期/孕中期/孕晚期2.
为了模拟孕妇中观察到的不同乙醇摄入模式，研究人员已采用多种动物物种建立了不同的发育期乙醇暴露范式，其中以大鼠和小鼠最为常用5,6. 这些动物的妊娠期通常持续约3周，相当于人类的1st 和 2nd 人类妊娠的三个阶段。许多啮齿类动物研究已评估了在此期间不同剂量和暴露模式的乙醇暴露所产生的影响。常用于向妊娠小鼠和大鼠施用乙醇的方法包括通过液体饲料给药7,8，向饮水中添加乙醇9,10，自愿饮用含糖精的溶液11，胃灌注12，蒸汽吸入13，以及皮下或腹腔注射14这些研究的结果重现了胎儿酒精谱系障碍（FASDs）患者所表现出的多种缺陷，表明在妊娠早期暴露于酒精就足以对全脑范围内的神经环路造成损伤（详见综述于 6,15).
啮齿类动物实验还表明，在相当于人类妊娠第三期暴露于某些因素时rd 人类妊娠的孕早期，大约相当于大鼠和小鼠出生后的前1-2周，这一时期的乙醇暴露会显著损害大脑发育。为模拟此阶段的暴露，研究人员通过向新生大鼠或小鼠给予乙醇来建立模型。乙醇可通过多种方式给予这些动物，包括通过胃造口喂养人工哺育的动物16-18胃内插管19皮下注射20，以及蒸汽吸入21,22这些研究令人信服地证明，脑部快速生长期是乙醇对发育产生影响的高度敏感时期。6.
如上所述，妊娠期间所有三个阶段的饮酒是女性乙醇摄入的常见模式2然而，相比之下，采用动物模型评估这种暴露模式影响的研究较少。其中一些研究利用了大型动物，其中的3rd 孕早期等效阶段发生 在子宫内 而非大鼠和小鼠所处的新生儿期。这些动物模型包括非人灵长类动物23,24 和绵羊25-27然而，这些动物模型在胎儿酒精谱系障碍（FASDs）研究中的应用并不广泛，部分原因在于其成本高昂且需要专门的护理设施。相比之下，啮齿类动物更常被用于表征全孕期乙醇暴露对胎儿发育的影响。5豚鼠在这方面具有显著优势，因其具有充分的产前发育过程，且大脑成熟过程与人类相似28,29. 通过豚鼠，已能够表征乙醇暴露的影响 在子宫内 包括人类3个等效发育周期的时间段rd 孕早期。由于这些动物成本较高，且妊娠期相对较长（约67天），目前仅有少数实验室将其用于胎儿酒精谱系障碍（FASDs）的研究。
由于大鼠在生物医学研究中成本较低且应用广泛，研究人员已利用其建立妊娠各阶段乙醇暴露的动物模型。在早期研究中，通过液体饲料使大鼠在妊娠期间暴露于乙醇，随后通过胃造瘘术对人工喂养的新生鼠（出生后第1–10天）给予乙醇，使母鼠的血液乙醇浓度峰值（BEC）达到0.08 g/dl。&#160;幼鼠中为0.16 g/dl。该范式导致视神经髓鞘化出现持久性改变，并减少小脑中Bergmann胶质纤维的数量30-32同样，Maier 及其合作者在人工饲养条件下，通过胃内插管以类似暴饮的方式向妊娠大鼠给予乙醇，随后在出生后早期阶段的部分时间内对仔鼠进行新生儿期给药。rd 孕早期等效期（P4-9）33,34母体和幼崽在妊娠第20天和出生后第6天（P6）的峰值血液乙醇浓度（BEC）均为0.3 g/dl。这种贯穿整个孕期的暴露模式导致了更显著的生长迟缓，其程度明显大于仅在妊娠特定阶段暴露的幼崽所观察到的生长迟缓。33此外，在相当于全部三个孕期均暴露于乙醇的大鼠中，小脑浦肯野细胞和颗粒细胞数量的减少程度大于其他时期暴露的动物。34海马区细胞数量的减少在此范式中也有报道，但这些效应似乎主要是3期间暴露所致的结果rd 孕早期等效阶段35一种通过经胃灌胃向妊娠大鼠和新生小鼠给予乙醇的方法，也被用于模拟整个孕期的暴露。36该方法使母鼠（妊娠第17天）的血液乙醇浓度达到0.13 g/dL，P6幼鼠达到0.24 g/dL，导致海马和下丘脑中单胺类神经递质水平发生持久性改变，并增加海马中DNA甲基转移酶及甲基-CpG结合蛋白2的表达37,38. 采用类似的暴露范式（母鼠血液酒精浓度为0.14–0.2 g/dl，仔鼠为0.2 g/dl），Gil-Mohapel 等.39 检测到成年大鼠齿状回中新生成的未成熟神经元数量增加，这可能代表了对乙醇诱导的神经元损伤的一种代偿机制，或成年出生神经元成熟过程的改变。研究人员还尝试通过在妊娠和哺乳期间对母鼠提供含乙醇的液体饲料或饮用酒精水，以模拟整个孕期的乙醇暴露。9,40然而，通过母乳向幼崽暴露的方法存在局限性，因为通常会导致幼崽的血液乙醇浓度（BEC）较低（例如，0.002–0.05 g/dl； 41,42).
小鼠也被广泛用于表征发育期乙醇暴露的影响。该动物模型具备上述大鼠模型的诸多优点，此外还可利用多种可获得的基因修饰小鼠品系。5小鼠已被成功用于表征乙醇在发育早期阶段的影响st, 2nd 或 3rd 妊娠期的三个阶段43,44然而，由于在技术上更难实现让小鼠暴露于相当于人类妊娠全部三个阶段的环境中，全孕期暴露对这些动物的影响尚未得到充分表征。例如，已在大鼠中成功使用的人工喂养和胃灌注方法，在小鼠中则需要更为专门的操作程序。45据我们所知，迄今为止仅有一项研究尝试利用小鼠探讨整个孕期乙醇暴露的影响；这些动物在妊娠期和哺乳期均通过饮水摄入乙醇溶液。46母体血液乙醇浓度（BEC）为 0.07 g/dl，仔鼠血液乙醇浓度未测定，但预计仅为母体浓度的一部分。
本文介绍了一种新的小鼠全孕期乙醇暴露模型，该模型通过吸入式蒸气舱对怀孕母鼠及新生幼鼠进行酒精暴露。蒸气舱的构建基于先前的设计47。我们提供了构建吸入舱及实施暴露操作的详细步骤，并介绍了可达到的血液乙醇浓度（BECs）以及暴露对仔鼠存活率和生长发育的影响。

<table><tbody><tr><td>聚碳酸酯 1/4&quot; 清晰 48&quot; × 24&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K23</td><td>10</td></tr><tr><td>泡沫橡胶灯泡密封圈 3/8&quot;w × 7/32&quot;h</td><td>McMaster-Carr</td><td>93085K67</td><td>10 英尺</td></tr><tr><td>焊接式 #16</td><td>McMaster-Carr</td><td>7515A11</td><td>3</td></tr><tr><td>钢琴铰链 12&quot; 长</td><td>McMaster-Carr</td><td>1658A11</td><td>2 × 1 英尺</td></tr><tr><td>标准压紧式快速夹钳</td><td>McMaster-Carr</td><td>5126A26</td><td>8</td></tr><tr><td>PEX 管 1/2&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>51275K88</td><td>10 英尺</td></tr><tr><td>带支管三通接头（黑色），每包10个</td><td>McMaster-Carr</td><td>5463K608</td><td>1</td></tr><tr><td>带刺插头接头（黑色）10个/包</td><td>McMaster-Carr</td><td>5462K79</td><td>1</td></tr><tr><td>带倒刺弯头管接头（黑色），10 个/包</td><td>McMaster-Carr</td><td>5463K596</td><td>1</td></tr><tr><td>3/8&quot; 穿墙接头，管对螺纹管</td><td>McMaster-Carr</td><td>5463K851</td><td>1</td></tr><tr><td>Phillips 机用螺钉 4-40</td><td>McMaster-Carr</td><td>91772A112</td><td>1</td></tr><tr><td>4-40 机器螺钉六角螺母</td><td>McMaster-Carr</td><td>90480A005</td><td>1</td></tr><tr><td>面板安装式流量计 2-20</td><td>McMaster-Carr</td><td>41945K76</td><td>3</td></tr><tr><td>1,000 毫升过滤烧瓶，每包6个</td><td>VWR</td><td>89001-800</td><td>2</td></tr><tr><td>精密封口隔垫</td><td>VWR</td><td>89084-490</td><td>1</td></tr><tr><td>VWR 黑色橡胶塞 #8 单孔</td><td>VWR</td><td>59581-367</td><td>1</td></tr><tr><td>TUBE TYGON R3603 3/8X9/16 50'</td><td>VWR</td><td>89068-556</td><td>1</td></tr><tr><td>TUBE TYGON R3603 1/4X11/16 50'</td><td>VWR</td><td>89068-502</td><td>1</td></tr><tr><td>曝气石 P2120</td><td>VWR</td><td>32573-007</td><td>1</td></tr><tr><td>3/8&quot; T型连接器 Pk 20</td><td>VWR</td><td>46600-060</td><td>1</td></tr><tr><td>VWR 锥形断路器，每包10个</td><td>VWR</td><td>46600-110</td><td>1</td></tr><tr><td>3/8 英寸软管接头带阀直通接头</td><td>Colder Products Company</td><td>HFCD17612</td><td>1</td></tr><tr><td>中等容量气泵</td><td>LMI 制造商</td><td>DB60L</td><td>1</td></tr><tr><td>Nexelate 36英寸线架&quot;W X 24&quot;D X 63&quot;H</td><td>全球工业</td><td>T9A990135</td><td>1</td></tr><tr><td>茎杆万向轮套装（4个）5&quot; 聚氨酯轮</td><td>全球工业</td><td>T9A500591</td><td>1</td></tr></tbody></table>

用于在相当于人类发育全部三个孕期阶段对小鼠进行酒精暴露的蒸气舱构建方法

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

发育期间接触酒精可能导致一系列形态学和行为学异常，这些异常统称为胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASDs）。在该谱系中最严重的情况是胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Syndrome, FAS），其特征为生长迟缓、颅面畸形以及神经行为缺陷。包括啮齿类动物在内的动物模型研究已阐明了FASDs病理生理过程中涉及的许多分子和细胞机制。向妊娠期啮齿类动物施用乙醇已被用于模拟人类在妊娠第一和第二孕期的酒精暴露。人类妊娠第三孕期的乙醇摄入则通过新生啮齿类动物进行建模。然而，目前极少有啮齿类研究对相当于人类妊娠全部三个孕期的乙醇暴露效应进行表征，而这种暴露模式在妊娠女性中较为常见。本文中，我们展示了如何利用易得的材料构建可容纳多达六个标准小鼠笼的挥发室。我们描述了一种挥发室实验范式，可用于在全部三个孕期模拟乙醇暴露，且对动物干预极少。我们的研究表明，妊娠母鼠对乙醇产生了显著的代谢耐受性。然而，新生小鼠并未产生代谢耐受，且胎儿数量、胎儿体重、胎盘重量、每窝仔鼠数量、每窝死产数量以及仔鼠体重均未受到乙醇暴露的显著影响。该实验范式的一个重要优势在于其适用于基因修饰小鼠的研究。此外，该范式最大限度减少了对动物的操作，而操作频繁是胎儿酒精研究中的一个主要混杂因素。

图2A显示，怀孕小鼠及其新生后代在暴露舱内均接触了相对稳定的乙醇蒸气浓度，浓度范围为4-6 g/dl。图2B展示了怀孕小鼠血液乙醇浓度（BECs）随时间的变化情况。BECs采用基于标准乙醇脱氢酶的检测方法测定48。在妊娠第5天（G5），暴露开始2小时后BECs迅速上升至约60 mM，并在4小时暴露期结束时达到峰值；暴露结束后再经过4小时，BECs逐渐下降至约12 mM。到妊娠第13-14天（G13-14），BECs显著降低至G5时检测水平的约60%。此外，BECs上升速度更慢，下降速度更快，表明乙醇在怀孕小鼠血液中的存留时间缩短。在接近分娩期（G18-20），BECs进一步降低至G5时水平的约30%。这些结果与怀孕小鼠体内对乙醇产生快速代谢耐受性的发育过程一致。图2C显示，新生后代暴露时的BECs接近30 mM。在这些动物中，BECs逐渐上升，在4小时暴露期结束时达到峰值，并在暴露结束后8小时逐渐恢复至基线水平。与怀孕母鼠不同的是，在新生期早期（P2）或晚期（P7-P12）暴露的新生小鼠之间，所测得的BECs水平无...

我们展示了利用 readily available 的材料构建酒精蒸气室的方法，该装置可同时容纳6个鼠笼。我们进一步描述了其在小鼠胎儿酒精暴露模型中的应用，该模型相当于人类妊娠的全部3&#160;个孕期。该实验范式在妊娠期以及出生后第1至12天对动物进行暴露。

孕期接触酒精可能导致一系列形态学和行为学异常，这些异常统称为胎儿酒精综合征……

在本视频中，我们将演示如何构建和组装酒精蒸气暴露舱。我们还将介绍一种酒精吸入实验方案，该方案可在相当于人类发育全部三个孕期的阶段对幼鼠进行酒精暴露。该暴露舱可根据所需的血液酒精浓度或暴露方案进行高度定制。我们的实验舱设计可容纳最多六个标准尺寸的小鼠笼，小鼠可自由摄取食物和水。该方法可在不使用玫瑰红（rosol）的情况下，使怀孕小鼠及其仔鼠均产生相对较高的血液酒精水平。本方法来自新墨西哥大学 Fernando Valenzuela 实验室。在本视频中，我们将演示聚碳酸酯乙醇蒸气暴露舱的组装方法，并介绍其在涵盖全部三个妊娠阶段的小鼠胎儿酒精暴露模型中的应用。任何具备基础木工技能的人员均可完成暴露舱的构建，且其尺寸可根据具体需求进行调整。暴露舱可长期放置于动物实验设施内，从而在整个暴露过程中最大限度地减少因动物转运和操作带来的应激反应。由于发育阶段的差异，向妊娠啮齿类动物给予乙醇可用于模拟人类在妊娠第一和第二 trimester 的暴露情况，而向新生仔鼠给予乙醇则用于模拟第三 trimester 的暴露。这些暴露舱设计用于同时容纳多个小鼠笼具，可对妊娠母鼠及其同笼的新生仔鼠进行乙醇暴露。采用这种酒精暴露范式的一些优势包括能够模拟发育的全部三个 trimester 阶段，减少妊娠母鼠及其幼崽的应激反应，以及在控制乙醇暴露水平方面具有更高的灵活性。在五块独立的、尺寸为24英寸×48英寸、厚度为四分之一英寸的透明聚碳酸酯板上，测量并标记出顶板、底板、前板、后板、侧板及门的相应尺寸。这些尺寸将构成一个宽32英寸、深22英寸、高14英寸的实验舱。此尺寸的实验舱可充分容纳六个标准小鼠笼，每个笼子尺寸为长11.5英寸、宽7.5英寸、高5.5英寸。需要注意的是，这仅提供一个腔室，因此需要重复此过程，以获得两个相同的腔室：一个用于酒精暴露，另一个仅用于空气对照暴露。聚碳酸酯板可以使用配备80齿刀片的圆锯或配备专用于塑料或有机玻璃的刀片的曲线锯进行切割。切割聚碳酸酯板时应按照测量好的尺寸进行，并尽可能小心，以确保切口平直。这将在所有部件切割完成后减少组装过程中的间隙。在前面板中央测量并标出一个 8 英寸 × 16 英寸的矩形区域，以留出门的开口。使用 3/8 英寸的钻头，在每个内角的内部钻一个孔。这些孔用于插入夹具副刀片，穿过聚碳酸酯板并切出开口。如果使用圆锯，可进行 plunge 切割。可能需要进行几次反向切割，以修整角落附近的边缘。所有边缘切割完毕后，即可移除中心部件，从而在前面板上留下一个开口。开始组装门时，先标记出用于将钢琴铰链固定到门上的孔位。使用 5/16 英寸的钻头在标记处钻出沉孔，这些沉孔用于容纳螺钉头部，钻孔深度应仅为聚碳酸酯板厚度的一半。使用 3/16 英寸钻头，以沉孔位置为引导，在组装前完成板材上的钻孔。去除聚碳酸酯板表面约两英寸的保护层，以便后续对部件进行焊接。由于组装过程可能较快，建议在焊接各部件前先将底部、后部、前部和侧面部件摆放到位。为焊接聚碳酸酯，使用16号溶剂胶的快速焊接设置。开始组装时，在侧板的底边涂上足量的焊料。立即用纸巾擦去任何滴落的焊料。在协助下将侧板放置到底部部件上。将其余的壁板组装到腔室底部。请注意，根据给定的尺寸，侧板将安装在前后面板之间。墙体组装完成后，从内侧用Weldon填充各接缝处的任何缝隙。要安装腔室顶部，请在每块墙体的顶部均匀涂抹足量的Weldon，然后将顶板放置在墙体上方，并对齐边缘。在焊接处固化期间，使用条形夹具将所有部件固定到位。或者，在固化过程中也可使用厚重的教科书压紧，以确保门体外侧与腔室外表面平齐。需将一块 1 英寸 × 12 英寸的聚碳酸酯板焊接在前板上，位置为开口下方 1 英寸处。铰链将连接到该垫片上，并允许门封闭腔室。为构建进液管路，截取两段长度为12英寸的半英寸聚乙烯管。同时截取一段长度为1英寸的半英寸聚乙烯管，用于输送气化酒精或气动钻头。在每根12英寸长的聚乙烯管末端约1英寸处，钻五个1/16英寸的孔。使用两个3/8英寸的堵头和一个3/8英寸的T型接头组装气体输送系统。确保聚乙烯管上的钻孔位于距离T型接头最远的一端。将钢琴铰链安装到门上，确保沉头孔朝上。使用四颗40号机械螺钉和螺母，将钢琴铰链固定在门上。以门为基准，用3/16英寸钻头在前面板的一英寸间隔器上标记钢琴铰链的安装孔位置。在前面板上钻孔，使用四个 40 机械螺钉和螺母安装门。将门和钢琴铰链固定到前面板上。用扳手拧紧。组装固定装置。如图所示安装旋入式夹具。利用门作为参考，在前面板上标出旋入式夹具的安装孔位置。使用 3/16 英寸钻头，在门的顶部安装两个快卸夹，并在两侧各安装一个。钻出快卸夹的安装孔，然后用四个 40 机螺钉和螺母固定快卸夹。将螺母置于腔体内部，用扳手拧紧，以确保腔体密封。沿门边缘裁剪并粘贴三条宽为八分之三英寸的橡胶密封条。当门关闭时，灯泡会在门与腔体前面板之间形成气密密封。使用5/8英寸扩孔钻头在顶板中心位置做标记，以钻出腔室的进液口。钻出进液口孔。在背板下部中心位置钻一个1/2英寸的孔，作为出液口。将一个3/8英寸的穿墙接头插入出口端口，并从腔体内部进行固定。此时可以移除保护盖。从外部将送风系统穿过顶板上的孔洞安装。插入一个3/8英寸的90度弯头。在门的前部钻一个1/2英寸的孔，然后将一个1/2英寸密封隔垫插入该孔中。该隔垫将作为测量乙醇蒸气的接口。此时，切割和钻孔已完成，可以对腔室进行清洁。组装支架，并将两个腔室和通气管安装到支架上。为了便于组织气流系统，将一块废弃的聚碳酸酯材料固定在下壳体上，用于辅助安装气流调节器；在该聚碳酸酯废料上标记并钻出三个直径为四分之三英寸的孔，用于安装三个气流调节器。使用提供的螺母将气流调节器固定到聚碳酸酯材料上。将一个3/8英寸穿墙接头连接到调节器的每个端口，用于乙醇蒸气室。其中一个气流调节器用于控制通过液态酒精鼓泡的空气量，另一个则用于控制与气化酒精混合的空气量。最后一个将控制仅用于第二空气室的空气量。按照图示组装酒精瓶，使用3/8英寸的管路。使用 T 型或 Y 型连接器按图示组装空气输送系统，以分流管路。单个泵即可为仅通空气的对照组室和酒精处理室提供足够的气流。将三条八分之一英寸管路连接至出口端口。向烧瓶中加入 600 mils 的 90 体积分数乙醇，并接入系统。为检测乙醇蒸气浓度，使用注射器和针头通过隔垫抽取 5 mils 空气。取下针头，通过将注射器抽至 60 mls，将空气样品稀释至原来的 1/12。使用室内空气缓慢将气体推过呼气分析仪，以检测乙醇蒸气。气态乙醇的检测值应与每套实验系统中动物的血液酒精浓度相关联。一旦将动物舱室安置于动物设施内，需记住将舱室直接连接至房间的通风系统进行排气。将2至3月龄的雌性小鼠同笼饲养至少一周，而将2至5月龄的雄性小鼠单独饲养两周。将雌性小鼠与单独饲养的雄性小鼠同笼配对5天，以允许交配。交配后，将雌性小鼠从雄性小鼠笼中移出，单独饲养于新笼中，并置于熏蒸室中。动物在光照周期的 G5 至 G20 阶段每天暴露于乙醇环境中四小时。定期称量雌性动物体重以监测妊娠情况。为避免仔鼠死亡，出生当天不进行暴露处理。出生后第1天，将仔鼠和母鼠重新放回染毒室，并持续暴露至出生后第12天。定期称量第12天仔鼠的体重，以监测其生长情况。开始进行蒸汽吸入实验时，将单独饲养的妊娠母鼠分别放入酒精和纯空气的实验舱内，关闭并密封舱门。将装有液体乙醇的烧瓶连接至系统，并开启泵。气流调节器用于控制进入液体乙醇的空气量，以及与乙醇蒸气混合的空气量。乙醇蒸气与空气的比例决定了最终进入腔室的乙醇蒸气浓度。仅控制空气的气流被设定为乙醇和空气两者气流的总和。乙醇蒸气暴露结束后，需更换食物，以消除可能已吸收乙醇蒸气的饲料。酒精组和仅空气组的舱室门均略微打开，以允许舱内与室内空气交换。在本视频中，我们演示了如何组装乙醇蒸气暴露舱，并介绍了一种小鼠酒精蒸气吸入实验方案，该方案可在相当于人类妊娠三个阶段的整个时期内对动物进行暴露。酒精蒸气浓度可轻松调节，以模拟低或高的血液酒精水平。这些暴露舱的一个优势在于其空间足够大，可在任意时刻容纳多个鼠笼。这使得动物在整个暴露期间均可饲养在暴露舱内，从而最大限度地减少因抓取或运输给动物带来的应激。此外，在建造过程中，该实验范式可根据研究需求定制，以适应任何感兴趣的妊娠阶段及暴露水平。所有切割必须保持平直且呈直角，以确保在焊接聚碳酸酯部件时形成密闭的腔室。操作时需迅速而高效，因为焊缝会快速干燥。观看本视频后，您应能够自行构建蒸气吸入装置。

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