Name: 改善凝胶还原β-消除综合O连接和磺基糖组学质谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学习利用SDS-PAGE分离糖蛋白，通过还原β消除释放O-连接糖链，结合甲基化与相分配技术，最终采用串联质谱进行结构鉴定与定量分析。该方法为糖组学研究提供了高效工具。

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本研究工作得到了美国国立心肺血液研究所/国立卫生研究院（NHLBI/NIH）基金项目P01HL107151的资助。作者还衷心感谢美国国立普通医学科学研究所/国立卫生研究院（NIGMS/NIH）基金项目P41GM103490所提供的仪器设备支持与使用权限。

注意：实验室安全事项
遵循标准的实验室最佳实践，需注意以下事项。将所有有机溶剂存放在合适的场所。所有废弃材料应置于带有明确化学成分标签的化学废液容器中。由于本实验方案中使用的多种试剂可能具有致癌性或会产生易燃挥发性气体，因此所有试剂操作均应在通风良好的通风橱内进行。在使用有机溶剂时，应佩戴个人防护装备，如手套、实验服和护目用具。
<img alt="聚糖分析工作流程图：凝胶纯化、凝胶内β-消除、完全甲基化、质谱分析。" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 凝胶内O-糖组学操作流程。（A）目标蛋白质通过SDS-PAGE分离，经适当染色方法（考马斯亮蓝或银染）检测后切取。将切下的凝胶条块切成小块，脱色，并用乙酸乙酯洗涤以去除可能干扰后续质谱分析的杂质。部分凝胶条块可保留用于凝胶内胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS进行后续蛋白质组学表征。（B）通过凝胶内还原性β-消除反应从分离的糖蛋白中释放O-连接聚糖。关键步骤包括通过甲醇共沸去除盐分和硼酸盐。（C）经还原性β-消除释放的O-连接聚糖进行完全甲基化修饰，随后分配至水相和有机相中。硫酸化聚糖定量回收于上层（水相），而中性聚糖和唾液酸化聚糖则分配至下层（二氯甲烷相）。
<img alt="SDS-PAGE 过程；示意图；显示凝胶电泳、β-消除、全甲基化工作流程。" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 凝胶内糖组学详细流程图。图中逐一展示了 图 1 中的每个实验步骤：（A）凝胶脱色与乙酸乙酯提取，（B）直接在凝胶内进行还原性 β-消除以释放 O-连接聚糖，以及（C）全甲基化与相分离。<a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

1. 凝胶切胶及去除凝胶来源的污染物
<ol>
	<li>开始实验前，准备好材料清单中列出的化学品和试剂。</li>
	<li>使用标准的Tris-甘氨酸缓冲系统在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质，并用考马斯亮蓝或银染法对分离的蛋白质进行染色。通常，从银染凝胶中回收O-连接聚糖的效率约为考马斯亮蓝染色凝胶回收效率的80–90%。</li>
	<li>电泳完成后，将凝胶置于玻璃板上，使用洁净的解剖刀或剃须刀片切下目标区域。</li>
	<li>为提高O-聚糖的回收率，将目标凝胶条带转移至另一块玻璃板上，并将切下的凝胶切成约2 mm的立方体。避免将凝胶切得小于1 mm的立方体，因为这会降低聚糖的回收率。使用不锈钢微型刮勺将小凝胶块转移至带螺旋盖的玻璃管（13 × 100 mm）中。</li>
	<li>向样品管中加入1 ml的25 mM碳酸氢铵（AMBIC, NH4HCO3），用带聚四氟乙烯衬里的螺旋盖盖紧玻璃管，轻轻弹击管壁混匀，静置10分钟。切勿剧烈震荡，以免撕裂凝胶块。</li>
	<li>使用巴斯德玻璃吸管或配有超长塑料吸头的移液器小心移除玻璃管中的AMBIC溶液。在移除AMBIC溶液时，避免压碎或转移小凝胶块。</li>
	<li>向玻璃管中加入1 ml乙腈（ACN），盖紧管盖，轻轻弹击管壁混匀，静置10分钟。确保凝胶块完全被溶剂覆盖。如有必要，可用移液器吸头将凝胶块从管壁推入溶剂中。</li>
	<li>用移液器吸除玻璃管中的ACN，并重复步骤1.5–1.7，直至明亮的蓝色完全消失。如有必要，至少重复五次交替的AMBIC/ACN洗涤。对于银染凝胶，使用脱色试剂盒。当凝胶块在ACN中变为均匀白色时，进入下一步。</li>
	<li>吸除玻璃管中的任何残留液体，重新盖上管盖，加入1 ml AMBIC，静置5分钟。</li>
	<li>移除AMBIC，向玻璃管中加入2 ml乙酸乙酯（EtOAc）。用带聚四氟乙烯衬里的盖子盖紧管子，置于4 °C过夜进行翻转震荡；或在室温下进行三次乙酸乙酯洗涤，每次30分钟。乙酸乙酯洗涤时间越长，去除污染物的效率越高。</li>
	<li>移除最后一次乙酸乙酯洗涤液，随后用2 ml H2O进行三次洗涤。彻底去除乙酸乙酯可确保还原性β-消除反应高效进行。</li>
	<li>吸除H2O，通过加入1 ml ACN洗涤一次使凝胶脱水。 
	注：干燥后，脱水凝胶即可用于凝胶内β-消除反应。脱水凝胶块可于-20 °C保存至使用。</li>
	<li>可在任意洗涤步骤中停止操作，并将凝胶块在4 °C下过夜保存，无论此时凝胶中所用的缓冲液或溶液为何（AMBIC、ACN、H2O）。可在接下来的两天内随时恢复样品制备。</li>
	<li>可取部分已脱色并脱水的凝胶块，采用标准蛋白质组学方法进行蛋白质鉴定。</li>
</ol>
2. 通过还原性 β-消除法在凝胶中释放 O-糖链
<ol>
	<li>使用50%的氢氧化钠（NaOH）或固体NaOH配制1 M氢氧化钠（NaOH）储备液，并于4 °C保存备用。
	<ol>
		<li>取5.2 ml的50% NaOH（或4 g固体NaOH），加水定容至100 ml，制成1 M NaOH溶液。将1 M NaOH储备液稀释为100 mM NaOH，该溶液可在4 °C保存长达6个月，且在还原性β-消除反应中不会损失活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在100 mM NaOH中配制2 M硼氢化钠（NaBH4）溶液。将38 mg NaBH4溶解于0.5 ml的100 mM NaOH中。通常每份样品使用0.5–1.0 ml硼氢化钠溶液。根据步骤1中制备的干燥凝胶块数量调整反应液体积。预计1–2块切下的凝胶（步骤1.3）需使用0.5 ml硼氢化钠溶液。</li>
	<li>向脱水的凝胶块中加入500 µl的100 mM NaOH，冰上静置3–5分钟，使凝胶充分平衡至碱性条件，以提高糖链回收率。</li>
	<li>加入500 µl含100 mM NaOH的2 M NaBH4溶液，最终反应体系中NaBH4浓度为1 M，NaOH浓度为100 mM。轻轻混匀后于45 °C孵育18小时。
	<ol>
		<li>孵育的前1小时内，每15分钟轻轻混匀一次。避免剧烈震荡，以防凝胶碎片化。反应可在预热充分的孵育箱/烘箱或加热金属块中进行。确保凝胶块完全浸没于反应液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品管从孵育器或加热块中取出并置于冰上，以终止反应。 
	注意：β-消除反应进行18小时后，必须在同一天内完成脱盐步骤。</li>
</ol>
3. 阳离子交换色谱脱盐
<ol>
	<li>为防止产生过多热量，将样品管保持在冰上，缓慢逐滴加入10%乙酸（AcOH）以中和碱性物质。每次加入AcOH后轻轻涡旋混匀样品管。注意缓慢且逐滴加入酸，因为加酸时会产生大量气泡，类似“火山喷发”现象。如有必要，可离心以消除气泡并防止溢出。
	<ol>
		<li>为去除反应混合物中大量的钠离子，将反应混合物通过一个小的阳离子交换柱（Dowex或AG-50W-X8树脂，H+型）。</li>
		<li>即使树脂为分析纯级别，使用前仍需用1 M NaOH和1 M HCl洗涤，以去除可能干扰质谱分析的杂质。</li>
		<li>将树脂浸泡于1 M NaOH中，倾去上清液；加入去离子水，再次倾去水相，然后加入1 M HCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复上述步骤，直至树脂上方溶液变为无色。用去离子水洗涤已清洁的树脂，并将其保存在5%乙酸（AcOH）中，置于4 °C备用。</li>
	<li>制备小型玻璃层析柱时，使用陶瓷切割器在巴斯德玻璃移液管尖端划痕并折断，使移液管尖端的锥形部分长度约为1 cm。取一团玻璃棉轻轻撕松，推入管尖作为树脂床的支撑。用夹子或晾衣夹固定移液管柱，并将其置于玻璃试管上方。</li>
	<li>用1 ml甲醇（MeOH）和3 ml 5%乙酸（AcOH）洗涤空移液管。轻轻摇匀保存在5%乙酸中的H+型Dowex或AG50阳离子交换树脂悬浮液，并转移适量悬浮液至巴斯德移液管柱中，形成约1 ml的树脂床体积。</li>
	<li>用五倍柱体积的5%乙酸（AcOH）冲洗层析柱。检查流出液中是否含有树脂颗粒，若检测到树脂颗粒则不得使用该柱。</li>
	<li>将层析柱置于新的螺口玻璃管（16 x 125 mm）上方，加载样品。收集穿流液，并用至少三倍柱体积的5%乙酸（AcOH）洗脱糖链至同一收集管中。</li>
	<li>用Parafilm封住管口，并用针扎几个微小孔洞。将样品管置于-80 °C或干冰中冷冻。待样品完全冻结后，通过冷冻干燥法干燥样品。干燥后的样品储存于-20 °C，直至使用。</li>
</ol>
4. 硼酸盐去除
<ol>
	<li>配制10%乙酸甲醇溶液：取10 ml冰醋酸，用甲醇定容至100 ml。将该试剂储存于带聚四氟乙烯衬里瓶盖的玻璃瓶中，可保存长达6个月。</li>
	<li>向干燥的冻干样品管中加入300 µl 10%乙酸甲醇溶液，涡旋混匀。在氮气（N2）气流下蒸发去除生成的三甲酯硼。 
	注意：在酸性条件下，硼酸盐与甲醇反应会生成挥发性化合物三甲酯硼。</li>
	<li>在37 °C下用氮气（N2）气流吹干。干燥后，按步骤4.2所述方法再次加入一份乙酸甲醇溶液。在37 °C下用氮气（N2）气流吹干液体5分钟。
	<ol>
		<li>重复重悬和干燥步骤至少3次。将干燥后的样品储存于-20 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. C18 净化
<ol>
	<li>使用三倍柱体积的乙腈（ACN）和五倍柱体积的5%乙酸（AcOH）平衡C18固相萃取柱（柱体积1 ml，填料100 mg）。通过施加轻微的正压空气加速平衡液的流过。</li>
	<li>向去盐且无硼酸的样品管中加入500 µl的5%乙酸，涡旋溶解。</li>
	<li>将重悬的样品上样至已平衡的C18柱，收集穿流液至一支玻璃螺口管（13 x 100 mm）中。用3 ml的5%乙酸洗脱O-聚糖至同一管中。</li>
	<li>用Parafilm封口膜封住管口，用细针扎几个小孔，或使用松盖的PTFE衬垫盖子覆盖管口，然后将样品在-80 °C或干冰中冷冻。通过冷冻干燥法去除溶剂。将干燥后的样品储存于-20 °C，待用。</li>
</ol>
6. 预甲基化用碱的制备
注意：为了实现稳定的完全甲基化，需新鲜配制 NaOH 悬浊液。用于完全甲基化反应的所有玻璃器皿应彻底清洗。
<ol>
	<li>为制备全甲基化反应的碱性试剂，将 400 µl 的 50% NaOH 加入一支洁净的玻璃螺口管（13 x 100 mm）中，再加入 800 µl 无水甲醇，涡旋混匀。</li>
	<li>加入 4 ml 无水二甲基亚砜（DMSO），涡旋混匀，生成白色沉淀。</li>
	<li>以 600 × g 离心 1 分钟，使沉淀成团；用移液器吸除上清液并弃去。向沉淀中再加入 4 ml 无水 DMSO，涡旋混匀。</li>
	<li>至少重复步骤 6.2 和 6.3 三次，或直至不再形成白色沉淀为止。</li>
	<li>将沉淀的碱性物质溶解于 3 ml 无水 DMSO 中，用洁净的巴斯德移液管反复吹打，轻轻混匀。</li>
	<li>立即使用该碱性试剂进行后续的全甲基化反应，因其不可储存。</li>
</ol>
7. 释放糖链的完全甲基化
<ol>
	<li>添加 200 µl 加入无水DMSO至C18纯化后的样品中，涡旋或超声以重悬。</li>
	<li>添加 300 µl 将重悬的基质浆液加入样品中，并立即添加 100 µl 碘甲烷（MeI）。用聚四氟乙烯衬垫盖密封试管，涡旋剧烈混合5分钟。</li>
	<li>为终止完全甲基化反应，将2 ml预冷的5%乙酸加入冰上反应体系中，涡旋混匀。用移液器将溶液上下吹打5次，通过挥发减少剩余碘甲烷的体积。 
	注意：乙酸（AcOH）用于中和溶液，去除碘甲烷（MeI）可提高硫酸化聚糖在相分离过程中向水相的萃取效率。</li>
	<li>加入2 ml二氯甲烷（DCM），涡旋混匀。室温下以600 × g离心1分钟，以分离水相和有机相。</li>
	<li>将上层液体（含有大部分全甲基化硫酸化糖链的水相）转移至新的玻璃管（13 × 100 mm）中。</li>
	<li>加入2 ml H2将O加入有机相中并涡旋振荡。以600 × g离心1分钟，分离水相和有机相，并将此次获得的第二水相与第一次的水相（步骤7.5）合并。</li>
	<li>重复步骤 7.6 和 7.5 三次，但后续分液所产生的水相无需保留。</li>
	<li>尽可能移除上层（水相），并将下层（有机相）使用洁净的巴斯德吸管转移至另一新的玻璃管中。</li>
	<li>在 N₂ 下干燥有机相2 流速在 42 °C.</li>
	<li>用封口膜封住管口，并于 -20 °C 直至使用。</li>
</ol>
8. 水相中硫酸化O-聚糖的C18纯化
<ol>
	<li>用三倍柱体积的乙腈（ACN）和五倍柱体积的5%乙酸（AcOH）平衡C18固相萃取柱。</li>
	<li>将步骤7.5和7.6中收集并合并的水相样品加载到柱上。</li>
	<li>用10 ml H2O洗涤柱以脱盐。</li>
	<li>用2 ml 50% ACN将全甲基化硫酸酯化O-聚糖洗脱至新的玻璃管中。对于较大的寡糖，可使用85% ACN进行额外洗脱，以提高全甲基化硫酸酯化O-聚糖的回收率。</li>
	<li>在42 °C下用氮气流吹干洗脱液。</li>
	<li>将干燥后的样品在-20 °C保存，最长可保存6个月，之后进行质谱分析。</li>
</ol>
9. O-糖链的全甲基化质谱分析
<ol>
	<li>使用纳米电喷雾离子源，以0.40–0.60 µl/min的注射器流速和210 °C的毛细管温度，将全甲基化O-聚糖直接进样至合适的质谱仪中进行分析。在离子阱仪器中进行CID碎裂的MS/MS和MSn分析时，施加30–40%的碰撞能量。</li>
	<li>负离子模式下，将全甲基化硫酸化O-聚糖溶解于50 μl甲醇/2-丙醇/1-丙醇/13 mM乙酸铵水溶液（体积比16:3:3:2）中；正离子模式下，将全甲基化中性/唾液酸化O-聚糖溶解于50 µl甲醇/水（1:1）含1 mM氢氧化钠的溶液中。</li>
	<li>利用Xcalibur软件包2.0版本的总离子图谱（TIM）和中性丢失扫描（NL scan）功能进行MSn分析，以表征单个O-聚糖结构13,19。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

将凝胶内还原性β-消除反应与水-有机相萃取相结合，可显著提高从小量黏蛋白型糖蛋白中分离得到的硫酸化及非硫酸化O-连接糖链进行结构表征时所获取数据的灵敏度和深度，这些糖蛋白通过SDS-PAGE与其他蛋白质分离。本研究中所提出技术方法的关键改进在于：（a）通过简单的洗涤步骤即可有效去除凝胶来源的污染物；（b）在快速的水-二氯甲烷（DCM）相分离后，可实现硫酸化糖链完全甲基化产物在水相中的定量回收。本文所述工作流程显著提升了对生物样品中生理表达水平糖蛋白所释放的硫酸化与非硫酸化糖链进行检测的灵敏度。
尽管此处所述方法在严格遵循标准分析实践时具有良好的稳健性和高度可重复性，但仍需简要提及一些可能的污染来源。确保所有玻璃器皿极为洁净，且无灰尘和洗涤剂残留，这一点至关重要。当在质谱（MS）图谱中观察到污染物峰时，应彻底清洗所有玻璃器皿，并在最终干燥前用甲醇（MeOH）冲洗。另一污染来源是使用橡胶衬垫的螺旋盖，而非聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖。由于橡胶衬垫缺乏对有机化学品的耐受性，会导致样品被干扰性的聚合物化合物污染。尽管本方案专门设计用于在离子阱质谱仪上通过纳升电喷雾电离质谱（NSI-MS）进...

糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与生物体生理功能、组织病理过程以及细胞识别1-3。尽管糖科学分析技术取得了重大进展，但对特定蛋白质上完整糖链多样性的表征仍是一项极具挑战性的任务，尤其是从原始生物来源中分离的蛋白质。然而，糖蛋白糖链的微不均一性常常会影响其与其他蛋白质的功能性相互作用。因此，对糖链多样性的表征对于理解细胞和组织糖基化的生理意义至关重要4,5。为了阐明糖蛋白糖基化在组织生理与病理生理中的作用，稳健、灵敏且全面的糖组学分析技术变得日益重要。在蛋白质组学分析中，通常通过LC-MS/MS对胰蛋白酶消化产生的肽段进行分析来实现蛋白质鉴定6。蛋白质消化可使用纯化后的蛋白质进行，也可对经SDS-PAGE分离的蛋白质进行胶内酶解，常用的蛋白酶包括胰蛋白酶7-9。通过SDS-PAGE对蛋白质混合物进行预富集，可提高蛋白质鉴定的深度与准确性。开发适用于糖蛋白糖基化分析的类似策略，正处于糖科学研究的前沿。
糖链的两大主要类别通过N-连接或O-连接方式附着于蛋白质骨架上。N-连接糖链连接在天冬酰胺（Asn）残基上，该残基是Asn-X-Ser/Thr/Cys序列基序（其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸）的一部分，可通过肽-N-糖苷酶（PNGaseF或A）在溶液中、凝胶内或印迹上进行酶解释放10-12。O-连接糖链主要连接在丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基上。然而，目前仅发现一种能够从糖蛋白上释放O-连接糖链的酶，且该酶的糖链特异性极为有限，只能释放最简单的O-连接糖链。化学释放策略仍是全面释放糖蛋白上O-连接糖链的首选方法。还原性或非还原性β-消除法以及肼解法是已被充分表征的化学释放技术，目前也是从糖蛋白上释放O-连接糖链最常用的方法13,14。尽管还原性β-消除法已被用于从SDS-PAGE分离的糖蛋白中释放O-连接糖链，但以往的方法需要后续进行HPLC分离以完成分析15-17。
多维质谱（MSn）分析目前为表征从大多数生物来源中分离出的糖蛋白所释放的糖链提供了最丰富的结构信息。在对释放的糖链进行分析之前，对其进行全甲基化修饰可显著提升基于质谱的结构解析深度。全甲基化可增强离子化效率，并倾向于使多种不同结构的糖链在摩尔水平上产生相对均一的信号响应18,19。此外，全甲基化能以特征性质量明确标记末端和被取代的单糖基团，从而促进结构解析20-23。例如，酸性糖链通常难以通过质谱检测其非甲基化形式。尽管酸性糖链可在负离子模式下通过质谱检测，但无法在同一离子模式下同时检测酸性和中性糖链。糖链全甲基化的一个主要优势在于，糖链上所有单糖取代基中的游离羟基（OH）均会被甲基（OCH3 或 OMe）封闭，从而使唾液酸化糖链的电荷被中和，其检测灵敏度因此与中性（无唾液酸）糖链的甲基化形式相当。然而，硫酸化糖链（sulfoglycans）上的硫酸基团中的羟基对甲基化具有抗性，导致其保留阴离子电荷，从而抑制离子化并降低检测灵敏度。这种抑制效应目前阻碍了对高度复杂糖蛋白（如黏蛋白）进行系统的糖组学分析，因为这类蛋白携带大量硫酸化糖链24-26。
近期关于纯化硫酸化糖链的报道采用带电荷的反相色谱法，在进行MALDI分析前对全甲基化糖链进行纯化和分离。该方法依赖于使用不同的流动相洗脱，以实现硫酸化与非硫酸化糖链的完全分离，但我们发现其严格性低于有机相分配法。因此，本文介绍了适用于硫酸化糖链检测与富集的新技术。这些技术可在糖链全甲基化反应结束时常规进行的水相与二氯甲烷（DCM）萃取后，实现硫酸化糖链在水相中的定量回收27。重要的是，该方法能够将全甲基化的硫酸化糖链与非硫酸化糖链混合物有效分离，同时富集带电物种，并简化MS2碎片图谱。本文还提供了一套改进的凝胶内O-连接糖链分析的综合方案。该优化方案可提高糖链回收率，增强通过对全甲基化糖链进行MSn分析所获得的结构信息，并提升对从生物来源中分离的重要糖蛋白进行硫酸化糖组学分析的灵敏度。
本方案旨在对通过 SDS-PAGE 分离的完整糖蛋白提取物或特定目标糖蛋白进行 O-连接聚糖分析，包含三个实验步骤：A）凝胶清洗；B）凝胶内还原性 β-消除；C）聚糖完全甲基化。目标是从具有重要生物学意义的原始样本中获取全面的 O-连接糖组学数据（图1）。通过染色法显示经 SDS-PAGE 分离的糖蛋白，切取目标条带并将其切成小块。对凝胶条带进行脱色处理，并用乙酸乙酯洗涤以去除凝胶污染物（图2A）。通过凝胶内还原性 β-消除反应释放聚糖（图2B），随后对释放的聚糖进行完全甲基化修饰。甲基化后采用水-有机溶剂萃取法，可将带负电荷的硫酸化聚糖与非硫酸化的中性聚糖完全分离（图2C）。将凝胶内还原性 β-消除与水-有机溶剂萃取相结合，能够实现对经 SDS-PAGE 分离的微量糖蛋白所释放的 O-连接聚糖及硫酸化聚糖的结构表征。整体实验策略概括于 图1，详细流程见 图2。此外，部分脱色并洗涤后的凝胶小块可用于后续标准 LC-MS/MS 蛋白质组学技术进行蛋白质鉴定。

<table><tbody><tr><td>水，去离子水</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>270733-4L</td><td>CHROMASOLV，用于高效液相色谱</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td>经认证的ACS级，&amp;ge;99.7% w/w</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>34860-4L-R</td><td>CHROMASOLV，用于高效液相色谱，&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Fluka</td><td>09830-500G</td><td>BioUltra，&amp;ge;99.5% (T)，步骤1</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>34998-4L</td><td>CHROMASOLV Plus，用于高效液相色谱，&amp;ge;99.9%，步骤1</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Fluka</td><td>34972-1L-R</td><td>LC-MS CHROMASOLV，步骤1</td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Aldrich</td><td>213462-25G</td><td>ReagentPlus，99%，步骤2</td></tr><tr><td>碘甲烷</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>289566-100G</td><td>ReagentPlus，99.5%，&amp;nbsp; 步骤6。&amp;nbsp; 使用前于4 &amp;deg;C保存。&amp;nbsp; 使用前置于室温下平衡。</td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液，50% w/w</td><td>Fisher</td><td>SS254-1</td><td>经认证，步骤6</td></tr><tr><td>无水二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>276855-1L</td><td>无水，&amp;ge;99.9%，步骤6</td></tr><tr><td>无水甲醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>322415-100ML</td><td>无水，99.8%，步骤6</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>34856-4L</td><td>CHROMASOL&amp;reg;，用于高效液相色谱，&amp;ge;99.8%，含戊烯作为稳定剂，步骤7</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8 氢型 100-200&amp;nbsp;目</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>217506-500G</td><td>步骤3</td></tr><tr><td>AG 50W-X8 树脂&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>步骤3</td></tr><tr><td>BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 固相萃取柱，聚丙烯，十八烷基（C18）反相</td><td>JT Baker</td><td>JT-7020-01</td><td>步骤5和8</td></tr><tr><td>7.5% Mini-PROTEAN TGX 预制胶&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>步骤1</td></tr><tr><td>Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td>G-250，步骤1</td></tr><tr><td>用于质谱分析的银染试剂盒</td><td>Pierce</td><td>24600</td><td>步骤1</td></tr><tr><td>寡糖试剂盒（麦芽三糖，Dp3: R474140）</td><td>Supelco&amp;nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>寡糖试剂盒（麦芽四糖，Dp4: R474135）</td><td>Supelco&amp;nbsp;</td><td>47265</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管，玻璃，短头</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>使用前清洗</td></tr><tr><td>PYREX 13 x 100 mm 一次性圆底螺纹培养管</td><td>Corning</td><td>99447-13</td><td>使用前清洗</td></tr><tr><td>PYREX 16 x 125 mm 一次性圆底螺纹培养管</td><td>Corning</td><td>99447-16</td><td>使用前清洗</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯覆面橡胶衬垫的酚醛盖帽/密封盖</td><td>Kimble</td><td>45066C-13</td><td>使用前清洗</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯覆面橡胶衬垫的酚醛盖帽/密封盖</td><td>Kimble</td><td>45066C-15</td><td>使用前清洗</td></tr><tr><td>Hamilton 高效液相色谱注射器</td><td>HAMILTON</td><td>81265</td><td>容积 500&amp;nbsp;&amp;mu;l，针头规格 22 G</td></tr><tr><td>Hamilton 高效液相色谱注射器</td><td>HAMILTON</td><td>81165</td><td>容积 250&amp;nbsp;&amp;mu;l，针头规格 22 G</td></tr><tr><td>Hamilton 高效液相色谱注射器</td><td>HAMILTON</td><td>81065</td><td>容积 100&amp;nbsp;&amp;mu;l，针头规格 22s G</td></tr><tr><td>Hamilton 高效液相色谱注射器</td><td>HAMILTON</td><td>80965</td><td>容积 50&amp;nbsp;&amp;mu;l，针头规格 22s G</td></tr><tr><td>Hamilton 校准注射器</td><td>HAMILTON</td><td>80300</td><td>容积 10&amp;nbsp;&amp;mu;l，针头规格 26s G</td></tr><tr><td>玻璃培养皿 100 mm x 15 mm</td><td>GSC INTERNATIONAL INC</td><td>1500-4</td><td>使用前清洗，步骤1</td></tr><tr><td>Bard-Parker 外科刀片</td><td>Fisher</td><td>371310</td><td>步骤1</td></tr><tr><td>Reacti-Therm 加热/搅拌模块</td><td>Pierce</td><td>18870</td><td>步骤1、4和7</td></tr><tr><td>加热块</td><td>Fisher</td><td>125D</td><td>步骤2</td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃纤维棉，硼硅酸盐，孔径 8&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Aldrich</td><td>CLS3950</td><td>步骤3</td></tr><tr><td>熔融石英切割器，管路切割器</td><td>alltech</td><td>3194</td><td>步骤3</td></tr><tr><td>多管涡旋振荡器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>444-7063</td><td>步骤6</td></tr><tr><td>冻干机 25EL Freezemobile</td><td>Virtis</td><td>25EL</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>VWR</td><td>Clinical 50</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Discovery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

改进的凝胶内还原性β-消除法用于通过质谱进行全面的o-连接糖组学和硫酸化糖组学分析

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

通过SDS-PAGE分离蛋白质，随后对分离的蛋白条带进行凝胶内蛋白酶消化，已实现对生物样品的高分辨率蛋白质组学分析。类似的方法若用于深入分析经SDS-PAGE分离的糖蛋白所携带的糖链，则在使用质谱（MS）作为检测手段时，需特别考虑以最大化回收率和检测灵敏度。获得高质量数据的主要障碍之一是去除干扰质谱分析的凝胶来源污染物。本文所介绍的样品处理流程具有良好的稳健性和高效性，且无需在质谱分析前进行在线HPLC纯化。含有目标蛋白质的凝胶小块通过乙腈、水和乙酸乙酯洗涤，以去除包括聚合丙烯酰胺片段在内的污染物。O-连接糖链通过凝胶内还原性β-消除法从目标蛋白上释放，并通过高效、简便的纯化步骤进行回收。该流程的一个优势在于提高了对硫酸化糖链的检测与表征的灵敏度。这些操作可在质谱分析前通过快速相分离，有效分离硫酸化全甲基化糖链与非硫酸化（唾液酸化和中性）全甲基化糖链，从而增强对经SDS-PAGE分离的糖蛋白进行糖组学和硫酸化糖组学分析的能力。

凝胶内还原性β-消除前乙酸乙酯处理的影响
通过凝胶内还原性β-消除法从牛黏蛋白中释放的O-连接聚糖样品的甲基化衍生物的代表性质谱图如图3所示。使用乙酸乙酯洗涤凝胶碎片可有效去除十二烷基硫酸钠（SDS）和聚丙烯酰胺类污染物，这些杂质会干扰后续的质谱分析27。
<img alt="聚糖分析的质谱图，显示 m/z 比值及相对丰度峰标记。" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 在凝胶内还原性 β-消除反应前，用乙酸乙酯洗涤聚丙烯酰胺凝胶小块可增强释放聚糖的检测灵敏度。（A）未用乙酸乙酯洗涤时，通过凝胶内 β-消除法从牛颌下腺...

为了全面探索O-连接聚糖的多样性，采用了一种新的凝胶内还原性β-消除方法，结合完全甲基化和快速相分离技术，直接从SDS-PAGE分离的糖蛋白中释放O-连接聚糖，并适用于后续通过质谱进行的糖组学分析。

改进的凝胶内还原性β-消除法用于通过质谱进行全面的O-连接糖组学和硫酸化糖组学分析

通过SDS-PAGE分离蛋白质，随后对分离的蛋白条带进行胶内蛋白酶消化，已实现对……的高分辨率蛋白质组学分析

improved-gel-reductive-elimination-for-comprehensive-o-linked-sulfo

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

改善凝胶还原β-消除综合O连接和磺基糖组学质谱

本文介绍了一种特异且灵敏的方法，用于深入了解免疫器官和细胞中糖鞘脂抗原的表达谱。该方法利用离子阱质谱技术，通过逐步裂解糖鞘脂分子，并与化学合成的标准品进行比较，实现对分子结构的分析。...

糖鞘脂抗原的质谱分析

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本方案描述了通过在酶解（内切木聚糖酶）前用2-氨基苯甲酰基标记还原端（RE），然后利用质谱（MS）和核磁共振（NMR）分析产生的寡糖，从而对异木聚糖的还原端及内部区域糖基序列进行结构表征的具体技术。...

利用酶法、化学（甲基化）及物理（质谱、核磁共振）技术测定植物细胞壁杂聚木聚糖序列

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。...

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

二硫键长期以来已知可稳定许多蛋白质的结构。分析由这些二硫键稳定的多聚体复合物的一种简单方法是通过非还原性SDS-PAGE分析。本文以人骨成骨肉瘤细胞系U-2...

结合非还原性SDS-PAGE分析与化学交联技术检测培养哺乳动物细胞中由二硫键稳定的多聚复合物

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。...

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

本文介绍了一种从黏蛋白中释放...

使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

建立了一种从小胶质细胞中制备纯化线粒体、分离线粒体蛋白以释放N-聚糖，并利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离联用高分辨准确质量分析仪质谱技术快速检测亚细胞线粒体聚糖的实验方案。...

小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

本文介绍了通过电喷雾电离轨道阱质谱法对汞(II)与双半胱氨酸四肽在不同相对比例下形成的配合物进行表征。...

汞(II)与双半胱氨酰四肽络合物的电喷雾电离质谱研究

学习利用SDS-PAGE分离糖蛋白，通过还原β消除释放O-连接糖链，结合甲基化与相分配技术，最终采用串联质谱进行结构鉴定与定量分析。该方法为糖组学研究提供了高效工具。

改进的凝胶内还原性β-消除法用于通过质谱进行全面的O-连接糖组学和硫酸化糖组学分析

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