植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

以下实验的总体目标是通过高压冷冻和快速冷冻置换技术固定植物细胞的细胞结构，以便后续利用透射电子显微镜进行观察。该目标通过以下方式实现：首先仔细准备组织样品，在冷冻前使用冷冻保护剂对样品进行编码处理，以确保组织在高压冷冻过程中受到的损伤最小化。第二步是在高压条件下迅速冷冻样品，从而固定细胞组分并限制结晶冰的形成，最终获得形态完整的细胞。

接下来进行快速冷冻置换，以有机溶剂取代细胞内的水分，并引入四氧化锇等固定剂，从而交联并稳定细胞的超微结构。通过透射电子显微镜观察获得的结果表明，高压冷冻结合快速冷冻置换技术能够有效保存植物细胞的结构与形态。该技术相较于传统的化学固定等现有方法的主要优势在于，高压冷冻-快速冷冻置换（H-P-F-Q-F-S）可在毫秒时间内固定细胞内容物，最大限度地减少人工假象的产生。

通常，QFS 方案对于初学者而言具有较大挑战性，因此建议在操作者熟悉流程之前由两人共同协作完成。操作液氮时必须始终佩戴个人防护装备，包括防冻手套和护目镜。将一个装有冻存管架的隔热箱用液氮填充，使管架完全浸没于液氮中。在快速冷冻置换（QFS）过程中所使用的固定剂为含 1% 四氧化锇和 0.1% 醋酸铀酰的丙酮溶液。

在遵循所有安全警示配制大量溶液后，将1.5毫升分装至冻存管中，并在液氮中冷冻保存。将适量标记好的含有冷冻置换液或FS培养基的冻存管放入液氮中的铝制支架，每个支架放置两个。根据本方案，在样品制备前约一至一个半小时，可将最多四个圆片（每个含一个样品）放入单个冻存管中。

高压冷冻仪必须开机并准备就绪以进行运行。本方案还需要酵母糊作为细胞外冷冻保护剂，用于填充样品周围的空隙。在样品载具中，用牙签将适量的干酵母与大致等体积的10%甲醇混合，直至形成均匀的糊状物。

其稠度类似于煎饼粉混合物，所需糊状物的量取决于样品数量；对于10个或更少的样品，可在微量离心管中混合糊状物。为进行高压冷冻（HPF）制备样品时，从植物上取下感兴趣的叶片，并轻轻将其放置在牙科蜡片或其他切割表面上。使用0.2毫米的打孔器从叶片上切取样品。

该操作过程中最关键的步骤是将样品制备好以装入样品载网。如果样品处理不当，后续任何步骤都无法弥补所造成的损害。在解剖显微镜下操作，找到A型样品载网的0.2毫米一侧，并在其表面涂上酵母糊。

将叶圆片放入样品载体中，用细毛刷将糊状物抹平，确保圆片完全填满且糊状物与载体边缘齐平。将样品载体放入样品架中，样品架应保持干燥并处于室温。用B型样品载体平面朝下覆盖样品。将先前准备好的隔热箱放置在仪器顶部。

将样品连同样品托架一起放入高压冷冻仪中。将装有样品的样品托架插入高压冷冻仪内。按下喷射自动按钮启动冷冻程序，该过程应在一两秒内完成，需尽可能快速地进行操作。

从机器上取下样品台，并放置尖端。将样品放入保温箱中的液氮内。冷冻后，将两对镊子的尖端浸入液氮中进行冷却。

应使用经液氮冷却的镊子在液氮中操作载样片。通过逆时针旋转打开样品 holder，用经液氮冷却的镊子将载样片从 holder 中取出，确保圆盘始终处于液氮或液氮蒸气中。打开一个含有 FS 培养基的冻存管，并将管盖放置在盒子的一侧。

用一把预冷的镊子夹住冻存管，用另一把镊子将组织片放入冻存管中。小心拧紧冻存管盖，注意不要将液氮困在管内。液氮在复温过程中体积会膨胀700倍，任何被困住的液氮在此期间都可能引起爆炸。

重复此过程，直至所有目标样品均已被冷冻。含有相同类型样品的多个叶圆片可置于同一冻存管中。开始准备冷冻置换前，将一个铝制加热块完全浸入液氮中10分钟，或直至成核沸腾停止。

在此期间，将一层干冰放置在用作 QFS 室的容器底部。可使用泡沫塑料容器或冰桶，并装入粉碎的干冰或干冰颗粒。本操作需要使用温度探针。

将热电偶从冻存管顶部插入，使其到达管底，然后用树脂密封管盖，确保无液体泄漏。每次进行QFS实验前，向管中加入1.5毫升丙酮。务必拧紧冻存管盖，防止在冷冻取代（fs）过程中FS介质泄漏。

迅速将装有样品的冻存管连同温度探头插入加热块的中间孔位中。使用隔热冻存手套或大号镊子开始记录温度。将加热块中的液氮全部倾倒干净。

注意不要将冻存管倒出。将装有冻存管的冻存盒放入QFC腔室的干冰层中。确保冻存盒放置时使冻存管呈水平状态，但略微向上倾斜。

如果使用正确的冻存管，则不应有泄漏。用干冰填充QFS室，使FS管完全被覆盖。虽然无需覆盖金属块的顶部，但仍需将盖子盖在腔室上。

QFS 必须在通风橱中进行。将装有样品的 QFS 腔室置于平台式旋转摇床，并以 125 RPM 的速度旋转 120 分钟。在此期间，模块的温度应逐渐降至约负 80 摄氏度。

振荡可确保组分充分混合，以获得更好的冷冻取代效果。两小时后，从腔室中移除干冰。使用低温手套迅速将加热块从QFS腔室中取出，并快速将干冰倒入次级容器中。

继续振荡一小时。在此期间，温度应升至约负15摄氏度至负20摄氏度。一小时结束后，从QFS室中取出样品和温度探头，置于室温下的振荡器上继续振荡10至15分钟，直至样品恢复至室温。

快速冷冻替代完成后停止记录温度。用塑料移液管小心地从每个冻存管中移除FS溶液，并将其放入指定的有毒废弃物容器中。用100%丙酮将样品洗涤四次。

收集前两次洗涤液，并放入有毒废物容器中。去除丙酮时需小心，避免丢弃样品。样品洗涤完成后，使用精细镊子将组织样品从样品载体中取出。

操作过程中需用丙酮保持样品湿润，并轻柔操作，避免损坏样品。酵母膏从样品上脱落是常见现象。此时，酵母膏通常呈深棕色，而叶组织仍为绿色。

通常在快速冷冻切片（QFS）过程中，组织样本会从样本载体中脱落，此时需使用移液管将样本收集到含有丙酮的冻存管中。随后，根据标准方案将样本进行透射电子显微镜制样处理。A. 本图展示了QFS过程中温度变化的典型曲线。

温度从液氮温度（零下196摄氏度）迅速上升至约零下80摄氏度。运行开始时的尖峰是由探针的电子元件引起的，并不代表高压冷冻和快速冷冻取代后样品在透射电子显微镜观察前的真实温度测量值。这些图像显示了兔耳草叶片样品的典型结果。

光滑且紧贴细胞壁的质膜表明固定效果良好。高倍镜下可见分支状的质膜结构。其他细胞器也清晰可见。

它们包括叶绿体、类囊体、线粒体、高尔基体、微管以及质膜，大型中央液泡在处理后仍保持完整。在高压冷冻-快速冷冻-超薄切片过程中操作不当，会导致冰晶引起的损伤和细胞裂解等假象。染色过程中还可能形成铅沉淀。一旦掌握该技术，

如果操作得当，该技术可在四个半小时内完成。请注意，使用液氮和四氧化锇具有极高的危险性，进行此操作时必须采取预防措施，包括在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备，如手套、实验服和护目镜。