Name: 串联高压冷冻和植物组织中快速冷冻替代透射电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学习高压冷冻和快速冷冻替代技术用于植物组织的透射电子显微镜样品制备。该方法能有效固定细胞结构，减少冰晶损伤和人工假象，保持超微结构完整性，为植物细胞生物学研究提供高质量的成像基础。

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我们非常感谢加州大学伯克利分校的肯特·麦克唐纳博士（Dr. Kent McDonald）的善意与慷慨。感谢一位匿名审稿人提出的极具帮助性的建议。伯奇-史密斯实验室（Burch-Smith lab）由田纳西大学的启动资金支持。

注意：QFS 操作程序需要用户格外小心和谨慎，我们在适用的地方将这些安全预防措施突出显示为“警告”和“注意”。
1. 高压冷冻运行的准备工作
<ol>
	<li>开始样品制备前，按照制造商说明开启高压冷冻仪。 
	注：本方案中使用的高压冷冻仪（HPF）为 Wohlwend Compact 02 型号（图1A），启动过程大约需要一至一个半小时，之后方可开始高压冷冻操作。
	<ol>
		<li>开启 Wohlwend Compact 02 高压冷冻仪。
		<ol>
			<li>将主开关从“0”拨至“1”，启动仪器。</li>
			<li>向仪器通入压缩空气。</li>
			<li>向仪器通入液氮。</li>
			<li>按下“SYSTEM DRY UP”按钮。</li>
			<li>30 分钟后，再次按下“SYSTEM DRY UP”按钮。</li>
			<li>按下“ON/OFF”按钮，开启仪器。</li>
			<li>按下“NITROGEN”按钮。</li>
			<li>即使“DRIVE IN”按钮已亮起，仍需让仪器继续冷却 20 分钟。</li>
			<li>“DRIVE IN”按钮亮起。</li>
			<li>按下“DRIVE IN”按钮。</li>
			<li>按下“AUTO”按钮。</li>
			<li>“SYSTEM READY”按钮亮起。</li>
			<li>将温压探头插入压力腔，并用插销固定。</li>
			<li>按下“JET AUTO”按钮。此步骤用于确认压力上升和温度下降符合预期；本质上是一次试运行。预期会出现温度迅速下降和压力迅速上升的现象（图1B）。</li>
			<li>再执行两次 JET 循环。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 冻存样本接收前的准备工作
<ol>
	<li>将装有冻存管架的保温箱内充满液氮（参见安全警告），使管架完全浸没于液氮中（图1C）。 
	注意：操作液氮时需佩戴个人防护装备（PPE），包括防冻手套和护目镜。</li>
	<li>将适量装有FS培养基的冻存管放入液氮中的铝制管架内（图1C）。根据本方案，每个冻存管中最多可放置四个圆盘，每个圆盘含一个样品。 
	注意：应使用尖锐工具（如金刚石刻笔）和极软的铅笔对冻存管进行标记。
	<ol>
		<li>在快速冷冻固定（QFS）过程中使用的固定剂为含1%四氧化锇（OsO4）和0.1%醋酸铀酰的丙酮溶液9。将该溶液大量配制后，分装为每份1.5 ml至冻存管中，并在液氮中冷冻保存。 
		注意：操作四氧化锇（OsO4）和醋酸铀酰时，请遵循安全警告。 
		注意：四氧化锇（OsO4）和醋酸铀酰为危险化学品，必须在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括封闭式鞋头的鞋子、实验服和手套。 
		注意：用于QFS样品保存的冻存管应配有坚硬的O型密封圈，以确保在QFS过程中管体密封，防止四氧化锇（OsO4）泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用牙签或其他类似工具将干酵母与约等体积的10%甲醇混合，搅拌至形成均匀的酵母糊。酵母糊作为胞外冷冻保护剂，用于填充样品与样品载具之间的空隙。所需糊状物的量取决于样品数量；对于10个或更少的样品，可在微量离心管中混合酵母糊（1 ml）。</li>
</ol>
3. 样品的高压冷冻
<ol>
	<li>从植物上取下感兴趣的叶片（或其他组织），轻轻放置在牙科蜡或其他切割表面上。使用直径为 2.0 mm 或所需尺寸的打孔器从叶片上切取样品。用镊子轻柔地操作样品，并尽快完成操作。</li>
	<li>在解剖显微镜下操作，将叶圆片放入 A 型样品载具的 0.2 mm 一侧，并完全覆盖酵母糊。用细毛笔将酵母糊抹平，确保圆片完全填满，且糊面与载具边缘齐平（图 2）。</li>
	<li>将载具放入样品架中，再将 B 型样品载具盖在上面，平面朝下。 
	注意：样品架应保持干燥并处于室温。</li>
	<li>将装有样品的样品架插入仪器中，按下“JET AUTO”按钮启动冷冻程序，该过程应在一两秒内完成。</li>
	<li>尽快将样品架从仪器中取出，并将夹持样品的一端浸入高压冷冻仪顶部保温箱中的液氮中。同时将两对镊子的尖端浸入液氮中进行预冷。 
	注意：冷冻后，载具只能使用经液氮冷却的镊子操作。常温（室温）镊子往往是低温技术失败的常见原因。</li>
	<li>打开一个装有 FS 介质的冻存管，将管盖放在保温箱一侧。借助一对经液氮预冷的镊子，轻柔地将圆片从样品载具中取出，确保圆片始终处于液氮或其蒸气中。在液氮蒸气环境中，用一支预冷镊子夹住 FS 管，另一支镊子将载具放入 FS 冻存管中，然后拧紧管盖。注意不要将液氮封入管内。 
	注意：将样品转移至冻存管进行快速冷冻固定（QFS）时，务必确保无液氮残留于管内。液氮在升温过程中体积会膨胀约 700 倍，任何残留的液氮都可能在升温时引发爆炸。</li>
	<li>重复步骤 3.1 至 3.7，直至完成所有所需样品的冷冻。相同类型的多个叶圆片可置于同一冻存管中。请注意，每次冷冻运行之间，样品架需擦干并恢复至室温。为加快此过程，可用吹风机加热，并通过触感监测其温度。</li>
</ol>
4. 冻干替代的准备工作
<ol>
	<li>将铝制加热块完全浸入液氮中10分钟，或直至成核沸腾停止。在此期间，在用作FS室的容器底部放置一层干冰（1-2 cm）（图3）。可使用泡沫塑料容器或冰桶作为FS室，并配合使用粉碎的干冰或干冰颗粒。</li>
	<li>迅速将装有样品的冻存管以及温度探针插入加热块的中间排。确保冻存管盖拧紧，以防冷冻保存液在冷冻过程中泄漏。开始记录温度。
	<ol>
		<li>通过将热电偶插入冻存管顶部，使其到达管底，从而制备温度探针。用树脂密封管盖，确保无液体泄漏。每次进行QFS实验前，向管内加入1.5 ml丙酮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用绝缘低温手套或大号镊子，将加热块中的液氮全部倒出，注意不要将冻存管倒出。 
	注意：操作液氮时应佩戴个人防护装备，包括低温手套和护目镜。</li>
	<li>将装有冻存管的加热块放置在QFS室中干冰层上。确保加热块放置时，冻存管呈水平状态，但略微向上倾斜。若使用正确的冻存管，则不应发生泄漏。</li>
	<li>用干冰填满QFS室，使冷冻管被覆盖，但无需覆盖加热块顶部。盖上容器盖子。</li>
</ol>
5. 快速FS
注意：尽管已采取其他预防措施，仍需在通风橱内进行四氧化锇（OsO4）的QFS运行，以防发生意外泄漏。
<ol>
	<li>将QFS室放置于通风橱内的平台式旋转摇床上，以125 rpm转速振荡120分钟。在此期间，样品块的温度应逐渐上升至约-80 °C。振荡可确保各组分充分混合，从而获得更佳的冷冻固定效果。 
	注意：在整个QFS操作过程以及每次QFS运行期间，摇床在通风橱内的位置及通风橱门的开合状态应保持一致，以确保样品受热条件的一致性。</li>
	<li>从腔室内移除干冰，并继续振荡1小时。 
	注意：温度应上升至约-15 °C至-20 °C。</li>
	<li>从QFS室中取出样品和温度探头，置于室温下的摇床上继续振荡10–15分钟，直至其温度升至室温。停止记录温度。</li>
	<li>在进行冷冻固定期间，关闭高压冷冻（HPF）仪。
	<ol>
		<li>当HPF仪正在充注液氮时，关闭液氮罐的阀门。</li>
		<li>按下“NITROGEN”按钮。</li>
		<li>等待红色的“PISTON DOWN”指示灯熄灭。</li>
		<li>按下“ON/OFF”按钮。</li>
		<li>按下“SYSTEM DRY UP”按钮。</li>
		<li>切断向仪器供应的压缩空气。</li>
		<li>至少等待12小时（以确保彻底去除任何残留湿气）后，将主开关从“1”拨至“0”，关闭仪器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 膜片钳记录后处理
<ol>
	<li>使用塑料移液管小心移除 FS 培养基，并将其放入有毒废弃物专用容器中。 
	注意：OsO4 和醋酸铀酰为危险化学品，操作时必须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括包趾鞋、实验服和手套。</li>
	<li>用 100% 丙酮清洗样品四次。收集前两次洗涤液，并放入有毒废弃物容器中。</li>
	<li>使用精细镊子将组织样品从样品架中取出。操作过程中应保持样品湿润，用丙酮覆盖，动作需轻柔，避免样品断裂。 
	注意：此时酵母糊从样品上脱落是正常现象，甚至可能有利于后续操作。酵母糊通常呈深棕色，而叶片组织仍为绿色。</li>
	<li>将样品收集至含有丙酮的冻存管中。按照常规方案继续进行透射电镜（TEM）所需的样品制备（浸润与包埋）步骤。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的成功实施在很大程度上取决于操作者。首先，必须做好充分的前期准备，确保所有必需材料均能及时获得，并具备足够的数量以完成一次完整的高压冷冻-快速冷冻置换（HPF-QFS）实验。其次，操作者必须快速操作，高效地依次执行各个步骤，尽量减少对样品的处理，从而最大限度地减少组织天然状态的改变。样品冷冻后、脱水前，必须始终保持低温状态，因此应特别注意避免任何可能导致样品意外升温的操作，例如使用戴着手套的手而非预冷的镊子进行操作。随着对本方案的熟悉程度提高，操作速度和效率也会相应提升，因此建议在正式处理目标样品前先进行预实验。第三，操作者必须充分意识到冷冻置换介质中所用化学试剂的危害性，以及使用液氮和干冰时存在的风险。制备冷冻置换介质和执行快速冷冻置换（QFS）步骤时必须在通风橱中进行。对于其余所有操作步骤，建议佩戴必要的个人防护装备，包括手套、实验服、封闭式鞋头的鞋子和护目镜。
长期以来，人们已经认识到在制备透射电子显微镜（TEM）样品（包括植物样品）时，使用冷冻固定法而非室温下的化学固定剂具有诸多优势10。一项比较了通过高压冷冻（HPF）或化学固定剂固定的烟草（<...

我们对细胞超微结构的认识主要来源于电子显微镜技术，该技术能够分辨低至数纳米尺度的细节1。尽管透射电子显微镜（TEM）具有极高的分辨率，但其操作并不便捷，因为样品制备过程需要耗时且繁琐的步骤，并要求操作者具备一定的专业技术。传统的样品固定方法通常联合使用醛类试剂与四氧化锇，随后进行脱水、树脂包埋和切片，以获得超薄切片，再用重金属染色。然而，已知化学固定可能产生多种假象，包括蛋白质聚集、脂质丢失1，以及膜结构的改变，最终影响多个细胞区室的形态2。这些假象主要归因于在室温下进行固定和脱水时反应速度较慢3,4,5。
通过高压冷冻（HPF）实现的冷冻固定可避免化学固定引起的大多数假象。冷冻固定的原理在于，它可使水的冰点降低约20摄氏度，减缓生物样品中冰晶的成核与生长过程，并提高水的黏度，从而使细胞组分基本处于固定状态6, 7。HPF可在毫秒时间内将样品温度降至液氮温度，同时施加极高的压力（210 MPa 或 2,100 bar）。若操作得当，HPF可有效防止形成大冰晶，避免对细胞超微结构造成严重损伤。在典型的生物溶质浓度下，HPF可用于固定厚度达100–200 μm的样品7。关于HPF背后的物理机制与基本原理，已有大量综述文献，例如1,7,8。
高压冷冻（HPF）后，样品在低温（-78.5 °C 至 -90 °C）下于含有四氧化锇等化学固定剂的液态有机溶剂中孵育，通常持续数天。在此低温条件下，样品中的水被有机溶剂逐步取代，常用的溶剂为丙酮或甲醇1,9。因此，该过程称为冷冻置换（FS）。随后，样品被逐渐升温，在此过程中通常使用四氧化锇和醋酸铀酰进行固定9。低温下的交联固定具有固定已固定化分子的优势1。因此，与室温下常规化学固定相比，冷冻置换所获得的样品质量更优，尤其体现在超微结构保存更佳、抗原性保留更好以及游离细胞组分的损失更少10,11。
大多数冷冻置换（FS）过程需要较长时间，通常长达数天，植物样品尤其如此12,13,14。McDonald 和 Webb 最近开发的一种新方案将冷冻置换的时间从数天大幅缩短至数小时15。在其快速冷冻置换（QFS）流程中，冷冻置换在3小时内完成，而在超快速冷冻置换（SQFS）中，样品处理仅需90分钟。这些方法所获得的样品质量与传统冷冻置换方案相当。我们已在高压冷冻（HPF）后的植物样品后续处理中采用了QFS方案。实践证明，该方法不仅节省了时间，也降低了成本，因为QFS和SQFS使用常规实验室设备，而无需昂贵的商业化冷冻置换仪器。
植物组织通常很难制备用于透射电子显微镜（TEM）观察。一般来说，植物细胞比细菌或动物细胞更大。由于存在疏水性蜡质角质层、厚实的细胞壁、占据细胞总体积高达90%的充满水的大液泡（其中含有有机酸、水解酶和酚类化合物）16，以及通气腔隙，整个系统的热导率显著降低17。此外，植物样品的厚度几乎总是超过20 μm，超出了化学固定的适用范围。在此类厚度下，水的低热导率导致样品中心的冷冻速率无法超过–10,000 °C/sec，而该速率是避免形成有害的六方冰晶（密度较低、尺寸大于10至15 nm的冰晶）所必需的8。这些因素共同对样品的充分冷冻以及后续的冷冻替代（FS）造成了困难。尽管如此，冷冻固定仍是固定植物样品的最佳方法。本文介绍了一种适用于植物组织样品的高压冷冻-快速冷冻替代（HPF-QFS）操作方案，主要以模式物种Arabidopsis thaliana为例，但也已成功应用于Nicotiana benthamiana。典型结果表明，HPF-QFS能在更短的时间内获得与传统高压冷冻-冷冻替代（HPF-FS）相当质量的样品。通过适当调整，该方案也可用于其他相对较厚的生物样品。

<table><tbody><tr><td>Wohlwend HPF Compact 02 高压冷冻机</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>HPF02</td><td>配备集成示波器，用于显示冷冻和压力曲线；需配备电脑（不含）以显示&amp;nbsp;冷冻参数</td></tr><tr><td>DN 3 × 0.5 mm 铝制样品载具支架</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>样品载具，P=1,000，DN 3 × 0.5 铝制，A型</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>241-200</td><td></td></tr><tr><td>样品载具，P=1,000，DN 3 × 0.5 铝制，B型</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>242-200</td><td></td></tr><tr><td>20.5 L 储存杜瓦瓶，MVE Millennium 2000 XC20</td><td>Chart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酿酒酵母</td><td></td><td></td><td>越陈旧越好，以避免产生过多气体（CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td></tr><tr><td>牙签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热电偶数据记录仪 EL-USB-TC</td><td>OMEGA Engineering Inc.</td><td>OM-EL-USB-TC&amp;nbsp;</td><td>电池需单独购买更换</td></tr><tr><td>温度探头</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>34505</td><td></td></tr><tr><td>加热块 12/13 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-10</td><td></td></tr><tr><td>叶片打孔器 - Harris Uni-core 2.00</td><td>Ted-Pella Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>粉红色牙科蜡</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吹风机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>若干对</td></tr></tbody></table>

植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

自20世纪40年代以来，透射电子显微镜（TEM）一直为生物学家提供生物材料的超高清分辨率图像。然而，由于样品制备过程繁琐耗时，且需要丰富的经验以获得无假象的样品，因此TEM被认为并非一种用户友好的技术。传统的TEM样品制备方法使用化学固定剂来保存细胞结构。高压冷冻是指在高压条件下对生物样品进行冷冻固定，从而实现极快的冷却速率，限制冰晶形成——而冰晶的形成会破坏细胞超微结构的完整性。目前，高压冷冻结合冷冻置换是制备用于TEM观察的树脂切片中获得最高质量形态结构的首选方法。这些方法可最大限度地减少传统TEM薄切片处理过程中常见的假象。冷冻固定后，样品中的冰在低温下被液态有机溶剂取代，这一过程称为冷冻置换。冷冻置换通常需要在专用且昂贵的设备中进行数天。最近的一项创新技术可将该过程缩短至三小时，而非通常所需的两天。此后通常还需数天的样品制备步骤，包括渗透和包埋于环氧树脂中，然后进行切片。本文介绍了一种结合高压冷冻与快速冷冻置换的实验方案，可在数小时内完成植物样品的固定。该方案可轻松适用于其他组织或生物体。植物组织尤为特殊，因其含有气腔和充满水的液泡，阻碍了水的无冰冷冻。此外，由于细胞壁的存在限制了化学试剂向组织深层渗透，植物组织的化学固定过程尤其漫长。因此，植物组织的处理极具挑战性，但本方案可靠且能产生最高质量的样品。

以下结果使用Wohlwend Compact 02进行高压冷冻（HPF）获得（图1A）。该仪器的一个主要优势在于其样品载网及其夹持器操作简便。使用其他仪器时，McDonald建议由两名操作者共同完成样品制备和高压冷冻过程，其中一人负责制备样品，另一人同时进行冷冻并将样品转移至FS冷冻管9。然而，Wohlwend的样品载网和夹持器设计简便，单个操作者即可独立完成全部操作（图2A、B、E、F和G）。但需指出，在处理珍贵样品前，应先进行数次试运行以熟悉高压冷冻仪器的操作。经验丰富的操作者通常可在一小时内固定多个（10个或以上）样品。然而，本方案中所述原理适用于任何 commercially available 的高压冷冻设备。
HPF-QFS 流程中最关键的步骤可能是将样品装入样品载网前的制备过程（图 2C）。尽管这一点可能并不直观，但这是研究人员在实验流程中最具控制权的环节。高压冷冻（HPF）设备性能稳定，只要正确使用并妥善维护，其压力和温度变化在不同样品间应具有...

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。

自20世纪40年代以来，透射电子显微镜（TEM）一直为生物学家提供生物材料的超高分辨率图像。然而，……

以下实验的总体目标是通过高压冷冻和快速冷冻置换技术固定植物细胞的细胞结构，以便后续利用透射电子显微镜进行观察。该目标通过以下方式实现：首先仔细准备组织样品，在冷冻前使用冷冻保护剂对样品进行编码处理，以确保组织在高压冷冻过程中受到的损伤最小化。第二步是在高压条件下迅速冷冻样品，从而固定细胞组分并限制结晶冰的形成，最终获得形态完整的细胞。接下来进行快速冷冻置换，以有机溶剂取代细胞内的水分，并引入四氧化锇等固定剂，从而交联并稳定细胞的超微结构。通过透射电子显微镜观察获得的结果表明，高压冷冻结合快速冷冻置换技术能够有效保存植物细胞的结构与形态。该技术相较于传统的化学固定等现有方法的主要优势在于，高压冷冻-快速冷冻置换（H-P-F-Q-F-S）可在毫秒时间内固定细胞内容物，最大限度地减少人工假象的产生。通常，QFS 方案对于初学者而言具有较大挑战性，因此建议在操作者熟悉流程之前由两人共同协作完成。操作液氮时必须始终佩戴个人防护装备，包括防冻手套和护目镜。将一个装有冻存管架的隔热箱用液氮填充，使管架完全浸没于液氮中。在快速冷冻置换（QFS）过程中所使用的固定剂为含 1% 四氧化锇和 0.1% 醋酸铀酰的丙酮溶液。在遵循所有安全警示配制大量溶液后，将1.5毫升分装至冻存管中，并在液氮中冷冻保存。将适量标记好的含有冷冻置换液或FS培养基的冻存管放入液氮中的铝制支架，每个支架放置两个。根据本方案，在样品制备前约一至一个半小时，可将最多四个圆片（每个含一个样品）放入单个冻存管中。高压冷冻仪必须开机并准备就绪以进行运行。本方案还需要酵母糊作为细胞外冷冻保护剂，用于填充样品周围的空隙。在样品载具中，用牙签将适量的干酵母与大致等体积的10%甲醇混合，直至形成均匀的糊状物。其稠度类似于煎饼粉混合物，所需糊状物的量取决于样品数量；对于10个或更少的样品，可在微量离心管中混合糊状物。为进行高压冷冻（HPF）制备样品时，从植物上取下感兴趣的叶片，并轻轻将其放置在牙科蜡片或其他切割表面上。使用0.2毫米的打孔器从叶片上切取样品。 该操作过程中最关键的步骤是将样品制备好以装入样品载网。如果样品处理不当，后续任何步骤都无法弥补所造成的损害。在解剖显微镜下操作，找到A型样品载网的0.2毫米一侧，并在其表面涂上酵母糊。将叶圆片放入样品载体中，用细毛刷将糊状物抹平，确保圆片完全填满且糊状物与载体边缘齐平。将样品载体放入样品架中，样品架应保持干燥并处于室温。用B型样品载体平面朝下覆盖样品。将先前准备好的隔热箱放置在仪器顶部。将样品连同样品托架一起放入高压冷冻仪中。将装有样品的样品托架插入高压冷冻仪内。按下喷射自动按钮启动冷冻程序，该过程应在一两秒内完成，需尽可能快速地进行操作。从机器上取下样品台，并放置尖端。将样品放入保温箱中的液氮内。冷冻后，将两对镊子的尖端浸入液氮中进行冷却。应使用经液氮冷却的镊子在液

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜

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厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

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