Name: 小鼠运动耐力的评估没有一个冲击电网的使用：另一种强迫运动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学习一种无电击网格的人道方法，通过跑步机逐步加速测定小鼠自愿运动耐力。该方法减少应激干扰，适用于神经科学与行为学研究，为动物实验伦理提供可靠替代方案。

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由美国退伍军人事务部资助（项目号 BX001026，LSQ），并依托于 VA Puget Sound 医疗保健系统提供的资源与设施、华盛顿大学 Nathan Shock 衰老基础生物学卓越中心转基因资源核心（NIA #5P30AG-013280）以及华盛顿大学糖尿病内分泌学研究中心（NIH #P30 DK-17047）。我们感谢 VA Puget Sound 的 Cynthia Pekow 兽医学博士和 Kari L. Koszdin 兽医学博士对本文稿提出的宝贵意见。

本方案已获美国退伍军人事务部普吉特湾机构动物护理与使用委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（ILAR）的要求。
1. 实验准备
<ol>
	<li>预先确定是否需要在运动后立即采集血液或组织样本；如果需要，应明确采样与运动结束之间的时间间隔。例如，检测运动诱导的激素或细胞因子释放入血液循环（需采集血液），或检测运动诱导的特定mRNA表达水平（需实施安乐死后采集组织）。若需在运动后立即采集血液或组织，应提前将相关操作所需材料准备妥当并置于操作室内。所有操作均须获得机构审查委员会批准，并遵循相关法规指南进行。并非所有实验都需要在运动后采集血液或组织；有时仅需对跑步耐力进行简单比较即可。</li>
	<li>预先确定实验分组及小鼠运动后的处理流程（见上述说明）。</li>
	<li>将跑步机放置在安静房间内专用的稳固台面上，在跑步实验期间该区域仅用于此项操作。</li>
	<li>设置跑步机的跑道宽度以适应小鼠体型，并根据实验方案调整合适的坡度。本实验采用+5o的上坡设置，以避免小鼠在下坡跑动过程中因离心收缩（肌肉在收缩的同时被拉长）而导致肌肉损伤。</li>
	<li>在跑步机传送带下方放置吸水垫，以收集粪便。</li>
</ol>
2. 小鼠跑步机适应
确定是否需要设置“久坐”（不运动）的小鼠组，并按照步骤 2.1 - 2.5 所述，将久坐组小鼠置于跑轮上但不进行跑步。确定需要设置 2 个还是 4 个实验组，例如，&#160;久坐/运动（2 组）；运动对照/运动处理（2 组，无久坐动物）；或久坐/运动 × 对照/处理（4 组）。其中“处理”可以是转基因或基因敲除基因型、药物干预方案、特殊饮食或其他实验干预措施。
<ol>
	<li>将小鼠连同其运输用的家鼠笼及笼伴一起置于操作室中，适应环境1至2小时。</li>
	<li>选取单只小鼠，记录耳标编号；称量小鼠体重并记录数值。</li>
	<li>将小鼠放入跑台中，此时不启动电机，使其适应约5分钟。随后接通电源，但不启动跑带，让小鼠再适应仪器运行噪音5分钟。</li>
	<li>此时将“久坐”组（如使用该组；见注释1）的小鼠从跑台上移除，放回鼠笼，或根据实验设计进行后续处理（见注释2）。</li>
</ol>
3. 开始力竭跑测试
<ol>
	<li>适应结束后，当动物在跑带上活动且未处于平台时，将跑带速度调至较低速度（10 m/min）。</li>
	<li>对于不愿持续跑步的动物，使用压舌板轻轻敲击或抬起其后肢1至3次，以鼓励其留在跑台上继续奔跑。 
	注意：大多数小鼠会 readily 跑步，但有时会短暂停止。当发生这种情况时，可用压舌板轻轻敲击或抬起动物后部，促使其恢复跑步。通常情况下，小鼠无需实际接触压舌板；仅当它们注意到手持压舌板靠近时，便会继续奔跑。</li>
	<li>当小鼠以初始速度10 m/min跑步时，启动实验室计时器。</li>
	<li>当小鼠位于跑带顶端（上坡端）时，以约每2分钟增加1 m/min的速度，逐步缓慢提高跑速。</li>
	<li>如果小鼠出现反复短时冲刺而无法保持稳定节奏的情况，应将速度调回之前的设定值。</li>
	<li>通过调节速度并观察小鼠表现，确定每只小鼠的最大可持续跑步速度（通常C57BL/6小鼠为14–17 m/min），并记录该速度。 
	注意：小鼠在跑台上的位置可为研究者提供其是否愿意以更高速度跑步的提示。若小鼠位于最远端（上坡端）并即将触碰到墙壁，表明其已准备好以更高速度跑步；若小鼠在跑台中部以稳定速度奔跑，则可能已达到其最大速度，或需根据跑步质量进一步调整速度。</li>
</ol>
4. 终点指标与停止实验的小鼠
<ol>
	<li>使用压舌板轻轻敲击或抬起停止运动动物的后肢，以鼓励其恢复跑步（参见注释3.2）。对于跑步过程中的短暂中断，不要停止计时器。</li>
	<li>识别并移除拒绝跑步的小鼠。在数据表上记录此情况。根据实验设计，可于另一天重新测试拒绝跑步的小鼠。 
	注：部分小鼠会完全拒绝跑步。这类小鼠仅能短时间奔跑，随后停止并进行理毛或“踩踏”动作，即坐在跑台上，以前肢在传送带上移动。这些小鼠呈弓背姿势，四肢紧贴身体下方，以防止被压舌板推回至跑台上。偶尔有小鼠在不愿跑步时对压舌板表现出攻击性，如啃咬压舌板或沿其攀爬以试图逃离。在试验开始后的前5&#160;min&#160;内，即可明确该小鼠是否愿意跑步。将拒绝跑步的小鼠从分析中剔除，但不得将其归类为“久坐”小鼠。</li>
	<li>识别力竭小鼠并停止计时。 
	注：力竭的判定标准为连续三次停止跑步，且在轻柔刺激下仍拒绝继续跑步，同时伴有呼吸困难、四肢外展等体力耗竭的体征。小鼠通常在30至60分钟内从力竭状态恢复。</li>
	<li>记录在所有速度下跑步的总时间。</li>
	<li>根据实验设计，将小鼠放回笼中，或按照机构指南立即进行运动后操作，如采集血液或组织样本。</li>
	<li>每只小鼠测试结束后，使用杀菌湿巾清洁传送带，以避免前一只小鼠的气味影响后续测试小鼠的行为。</li>
	<li>测试下一只小鼠。每只小鼠均应使用新的压舌板。同笼饲养的小鼠可在同一天内依次测试，无需额外适应实验环境。</li>
</ol>

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<li>Cook, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+treadmill+exercise+training+exacerbates+inflammation+and+causes+mortality+while+voluntary+wheel+training+is+protective+in+a+mouse+model+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis.</a> Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍一种在实验室小鼠中评估自主跑步耐力的方法，该方法使用电动跑步机且无需电击网格。此方法能够揭示在白细胞介素-15（IL-15）表达水平不同的C57BL/6小鼠亚系之间存在的差异，而这种差异继而导致影响运动耐力的相关因子表达水平的不同16,17。依据实验动物科学中的“3R原则”，该方法可作为使用电击网格的强制运动实验方案的一种更为人道的替代方法或优化改进8-11。强制运动还可能引入心理应激和回避行为等混杂因素，从而影响跑步参数以及运动后指标（如血清细胞因子和激素）的测定结果12。
该技术的一个局限性在于，持续最大跑步速度的确定、拒绝跑步的行为以及力竭终点的判断均依赖于观察者的主观评估。然而，大多数年轻小鼠在缓慢适应仪器后会自愿跑步；此外，小鼠在跑步后通常会表现出明确的拒绝继续跑步和达到力竭状态的行为特征。尽管如此，成功实施该技术仍要求观察者对动物状态具有一定的敏感性。因此，建议在一项研究中的所有力竭跑步测试均由同一名观察者完成，且最好由对处理分组设盲的观察者执行，以尽量减少在判断这些参数时引入观察者偏倚。尽管跑步...

肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病是相互关联的代谢性疾病，对美国及全球人群的健康产生深远影响1-4。耐力运动既可用于预防，也可用于治疗这些疾病5,6。此外，在临床实践中，步速和耐力的评估被用作诊断人体衰弱、肌肉减少症以及其他疾病（如慢性阻塞性肺疾病）后果的检测指标7。
利用基因修饰或药物处理后运动能力增强或减弱的小鼠，研究人员正逐步阐明耐力运动对身体成分和胰岛素敏感性有益作用背后的生化通路8-11。然而，许多此类研究使用配备电击网格的电动跑台来强迫小鼠奔跑8-11。当小鼠停止奔跑时，移动的跑带会将其推至一个通电的网格上，使其足部受到电击；为逃避这种负面刺激，小鼠被迫重新在跑带上奔跑。这类操作可能引入心理应激和回避行为，从而作为混杂因素影响实验参数12。其他评估耐力的方法，例如使用光束中断装置定量测量自主活动，或在笼内转轮上记录跑步情况，也可能受到昼夜节律变化、焦虑、无意中的训练效应或觅食行为的干扰12-16。此外，这些方法通常需要单只饲养，而单笼饲养本身也是小鼠的一种心理应激源。因此，亟需一种不受应激干扰的、对运动耐力的直接测量方法。
为消除这些顾虑，本实验室开发并验证了一种方法，用于评估未经训练、无跑台经验的小鼠在未配备电击网格的电动跑台上的最大跑步能力和持续跑步速度。跑带末端原本安装电击网格的空间，现成为小鼠休息的平台，也为拒绝跑步的小鼠提供一个停留区域，直至被移出装置。实验人员通过轻柔敲击或使用压舌板触碰小鼠，结合对小鼠自主跑步意愿的敏感观察，鼓励其跑步。该方法已用于量化在肌肉来源的细胞因子白细胞介素-15（IL-15）表达水平上存在差异的基因修饰型与对照型C57BL/6小鼠之间运动耐力的不同16,17。该方法是一种人道的改进措施，可减少因使用电击网格引发的负向强化所带来的混杂效应。

<table><tbody><tr><td>开放式啮齿类动物跑步机 Exer-3/6</td><td>Columbus Instruments, Columbus OH</td><td>1050RM</td><td>此目录编号适用于无电击网格的型号。旧型号（Eco 3/6）的电击网格可手动移除。</td></tr><tr><td>Sani Cloth 杀菌擦拭巾</td><td>PDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NY</td><td>通常通过本地机构订购</td><td>含 10% 异丙醇；可使用任何等效产品。</td></tr><tr><td>压舌板</td><td>任何本地供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室计时器</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-15 TG 小鼠*</td><td>JAX, Bar Harbor, ME</td><td>011002</td><td>小鼠 IL-15 转基因由修饰后的人α-骨骼肌动蛋白启动子驱动表达，并改变信号序列以促进分泌。</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠（野生型）*</td><td>JAX, Bar Harbor, ME</td><td>000664</td><td>IL-15 TG 小鼠的对照小鼠</td></tr><tr><td>IL-15 KO 小鼠*</td><td>Taconic Farms, Germantown, NY</td><td>4269-M</td><td>在 C57BL/6 背景上的纯合 IL-15 &quot;基因敲除&quot; 小鼠</td></tr><tr><td>C57BL/6NTac（野生型）*</td><td>Taconic Farms, Germantown, NY</td><td>B6-M</td><td>IL-15 KO 小鼠的对照小鼠</td></tr><tr><td>*可选；小鼠品系及处理方式可根据实验方案具体设定。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

无需使用电击网格的小鼠运动耐力评估：一种替代强制运动的方法

Assessment of Murine Exercise Endurance Without the Use of a Shock Grid: An Alternative to Forced Exercise

利用实验室小鼠模型，耐力运动代谢益处背后的分子通路正逐步被阐明。目前评估小鼠运动耐力最常用的方法是使用配备电击网格的机动跑步机进行强迫跑步。当动物停止奔跑时，移动的跑步机传送带会将其推至一个释放电足部刺激的网格上；为逃避这种负面刺激，小鼠会重新回到传送带上奔跑。然而，使用电击装置可能引发回避行为和心理应激，从而干扰跑步耐力的定量评估，并混淆运动后血清激素和细胞因子水平的测量结果。本文中，我们展示并验证了一种改进的方法，可在不使用电击网格的情况下，利用机动跑步机测定未经训练的C57BL/6实验室小鼠的跑步耐力。当小鼠预先适应跑步机环境后，它们会以符合自身步态速度自愿奔跑。本方法以操作者使用压舌板进行轻柔鼓励代替电击刺激，并结合对小鼠自愿奔跑意愿的敏感观察。每只小鼠力竭前的跑步时间具有明确的终点指标，表现为力竭行为特征，如身体呈伸展姿势和呼吸费力等。该方法是一种人道的改进方案，同时可减少应激对实验参数的干扰。

该运动耐力测定方法能够准确反映在细胞因子IL-15表达水平上存在差异的C57BL/6小鼠不同品系的分子与代谢特征16,17。与同窝对照小鼠相比，过表达IL-15的转基因小鼠（IL-15 TG小鼠）在力竭前的跑步时间显著延长；而缺乏IL-15的小鼠（IL-15 KO小鼠）在达到力竭前的跑步时间则显著缩短（图1A）。已有研究报道，IL-15 TG小鼠的肌肉向更具氧化性的表型转变16；相反，IL-15 KO小鼠的肌肉则向氧化性较低的表型转变17。这些肌肉表型变化与在光束中断装置中测得的自发性体力活动水平，以及通过自主跑步至力竭实验测得的运动耐力具有相关性。来自两个不同来源（本单位饲养种群与商业供应商）的野生型对照C57BL/6小鼠在跑步时间上无显著差异（图1A）。
仅在IL-15基因敲除小鼠中观察到最大持续跑步速度的差异（图1B）。跑步距离（未显示）也可进行计算和统计分析；然而，将两个参数（力竭时间与速度）分开分析可获得更...

介绍了一种在不使用电击网格的情况下评估实验小鼠运动耐力的方法。该方法是一种人道的改进措施，可减少应激对实验参数的混杂影响。

利用实验室小鼠模型，耐力运动代谢益处所涉及的分子通路正逐步被阐明。最……

本实验的总体目标是测定自主运动耐力。在实验室小鼠中，首先让小鼠在其饲养笼中适应实验操作室环境一到两个小时。随后让小鼠适应跑步机及其电机运转的声音。接下来，逐渐增加跑步机的速度，直到小鼠能够在其最大可持续速度下舒适地奔跑。最后一步是确定小鼠何时达到力竭状态。最终，小鼠跑至力竭所持续的时间反映了其运动耐力，且避免了使用电击网格所带来应激干扰的影响。该技术的主要优势在于，它是对现有测定小鼠运动耐力方法的改进，主要是因为其不使用电击网格来促使小鼠奔跑，从而减少了动物本身及实验过程中应激因素的干扰。在实验前应预先确定实验分组以及小鼠运动后的处理流程。将跑步机放置在专用于该操作的安静房间内的稳固推车或桌面上。进行跑步实验时，将跑步机设置为适合小鼠跑道的尺寸，并根据实验方案调整适当的倾斜角度。此处采用正五度的倾斜角度，以避免小鼠在下坡跑过程中因离心运动导致肌肉损伤。在跑步机滚筒下方放置吸水垫，以收集粪便。将小鼠连同同伴一起置于运输用的饲养盒中，放入实验操作室适应环境1至2小时。选取一只小鼠，记录其耳标编号。同时称量小鼠体重并记录数值。将小鼠放入跑步机中，不开启电机，使其适应约五分钟。随后打开电源，但不启动跑步机传送带，让小鼠再适应机器噪音五分钟。此时，将久坐组的小鼠从跑步机上移除，并放回其笼中，或根据实验设计进行运动后相关操作。适应环境后，将跑带调至低速。当动物在跑带上探索且未停留在平台上时，使用压舌板轻轻敲击或抬起小鼠后肢部位一到三次，以鼓励不愿运动的小鼠留在跑台上并开始跑步。当小鼠以每分钟10米的初始速度开始跑步时，启动实验室计时器，并缓慢增加跑速。当小鼠在跑带上以每分钟一米的速度递增，约每两分钟到达跑带顶端时，将速度调回之前的设定。若小鼠反复以短时冲刺方式奔跑而非保持稳定速度，大多数小鼠会 readily 跑步，但有时会短暂停止。可使用压舌板轻轻敲击或抬起动物后部，以促使其恢复奔跑。通常，小鼠仅看到带有压舌板的手靠近就会开始进一步奔跑。对于奔跑过程中的短暂中断，不要停止计时器。通过调节速度并观察小鼠，记录其能够持续奔跑的最高速度，以此确定每只小鼠的最大持续奔跑速度。一些小鼠会完全拒绝跑步。这类小鼠只会短时间奔跑，随后停止运动，进行理毛或踩踏动作，即坐在平台上并用前肢在跑带上踩动。小鼠拒绝运动时的典型姿态是弓背，四肢紧贴身体下方站立，以防止被压舌板推回到跑步机上。偶尔，当小鼠不愿奔跑时，会表现出对压舌板的攻击性行为，例如啃咬压舌板或试图沿压舌板向上攀爬以逃避。在实验开始后的前五分钟内，即可明确判断小鼠是否会进行奔跑。将拒绝跑步的小鼠从分析中剔除并予以识别，但不得将其计入久坐小鼠。根据实验设计的不同，拒绝跑步的小鼠可在另一天重新测试。力竭的定义为连续三次停止跑步，并且尽管给予轻柔刺激仍拒绝继续奔跑。以及呼吸费力、四肢伸展等疲劳的生理表现。识别出疲劳的小鼠并停止计时。记录小鼠在所有速度下跑步的总时间。根据实验设计，将小鼠放回笼中，或立即进行运动后操作，例如采集血液或组织样本。按照机构指南，每次测试完一只小鼠后，需使用杀菌湿巾清洁跑带，以避免前一只小鼠的气味影响后续测试小鼠的行为。每只小鼠均应使用新的压舌板。同笼饲养的小鼠可在同一天内依次进行测试，无需额外适应操作室环境。运动耐力能够准确反映不同品系C57黑六小鼠的分子与代谢特征，这些小鼠在肌肉来源的细胞因子IL-15表达水平上存在差异：过表达IL-15的转基因小鼠与对照组相比，力竭前跑步时间显著延长；而缺乏IL-15的小鼠在达到力竭前的跑步时间则显著缩短，低于野生型对照组。来自两个不同来源的C57黑六小鼠之间未表现出显著不同的跑步时间。仅在IL-15基因敲除小鼠中观察到最大持续跑步速度的差异。该技术的一个不可避免的局限性在于，部分小鼠拒绝自愿跑步。约10%的年轻野生型对照小鼠拒绝跑步；在四月龄时，拒绝跑步的比例上升至20%；在八月龄时进一步增加，并在16月龄时超过60%。然而，IL-15 转基因小鼠在较老年龄组中的拒绝率显著较低。在进行该操作时，重要的是要保持冷静和放松，并注意小鼠的行为表现。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用跑台测定小鼠的运动耐力，且无需使用 e chakra。

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