Name: 药品监督管理局多个斑马鱼的新方法（斑马鱼）和退出的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解一种同时对斑马鱼群体进行乙醇给药的新方法，用于研究戒断行为。该方法通过光暗任务和运动追踪软件精确量化焦虑水平变化，为神经药理学研究提供可靠工具。

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作者声明无利益冲突。

所有实验操作和行为学测试均经麦克文大学动物研究伦理委员会根据协议编号06-11-12批准，该协议符合加拿大实验动物护理委员会关于实验动物护理与使用的指南。
1. 准备给药罐、溶液及给药方案
<ol>
	<li>制定给药时间表，确保动物在相同环境和每天的同一时间进行给药，以避免时间因素或视觉刺激带来的干扰。</li>
	<li>根据实验分组数量，准备足够数量的相同规格、1.5 L透明聚丙烯产卵缸。每缸放置8条鱼，以便后续实验中每天可同时测试两组鱼（见步骤3）。每组需配备一个暂养缸和一个给药缸（共需缸数为组数的两倍）。
	<ol>
		<li>在所有暂养缸中放置400 µm产卵隔板。使用栖息地用水或反渗透水将水箱注满，并调节至适宜温度（对于斑马鱼，为25–28 °C），该温度应与鱼类常规饲养温度保持一致。 
		注意：某些药物可能与缓冲型栖息地用水中的化学成分发生不良相互作用。在此情况下，药物处理组及对照组均应使用反渗透水，并添加极少或不添加水族盐进行缓冲。</li>
		<li>确保水箱处于中性环境中，以避免在给药期间鱼类对外部视觉刺激产生条件化反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制药物溶液。将适量药物与栖息地用水混合于产卵缸中。配制0.2%乙醇溶液：取3 ml高纯度乙醇（95%非变性乙醇）与1,497 ml水混合。配制1.4%乙醇溶液：取21 ml乙醇与1,479 ml水混合。</li>
</ol>
2. 捕捞鱼类及乙醇给药操作步骤
<ol>
	<li>小心地用网从栖息水族箱中捞出鱼类，并将其转移至含有产卵插槽的相应暂养水族箱中。理想情况下，可将鱼类直接饲养在产卵插槽内，以完全避免使用网捞操作。</li>
	<li>当所有鱼类均置于各自的暂养水族箱后，轻轻将产卵插槽从暂养水族箱中取出，并放入相应的药物溶液水族箱中（图1A）。
	<ol>
		<li>根据需要记录给药时间。本实验方案中，使用乙醇溶液处理的时间为30分钟。</li>
		<li>若条件允许，可安排助手同时将所有实验组转移至药物溶液中，以确保精确的给药时间。若无法同时操作，则可逐组转移，并分别记录每组的给药时间（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成规定给药时间后，小心地将产卵插槽从药物溶液中取出，将鱼类移出乙醇溶液，并轻柔地放回暂养水族箱中。</li>
	<li>用网小心地将暂养水族箱中的鱼类捞出，并放回其原始栖息环境中，直至下一次预定的给药时间；或可将产卵插槽重新放回暂养水族箱中，以避免网捞操作。</li>
	<li>如前所述，若动物饲养设备条件允许，可将动物始终饲养在用作暂养水族箱的同一水族箱及产卵插槽中。这样可在整个给药过程中完全避免网捞操作。</li>
</ol>
3. 行为学测试
<ol>
	<li>获取一个宽9.5 cm、长55 cm、深9.5 cm的明暗穿梭箱，底部为白色防水材质（图1B）。使用魔术贴将白色和黑色的防水无反光纸固定在穿梭箱内壁，使箱子的一半内壁覆盖白色纸，另一半覆盖黑色纸。向箱内注入25–28 °C的栖息环境水，水深达5 cm，并在整个实验过程中维持该温度。</li>
	<li>通过构建一个三面白色的围挡结构，将穿梭箱置于其中，以尽量减少外部视觉刺激。确保测试区域具有均匀的顶部漫射光源，避免水面产生反光，同时保证光照强度足以支持运动追踪软件运行，或便于后续通过视频图像进行人工手动定量分析。</li>
	<li>将穿梭箱放入围挡结构中，并设置行为追踪软件的录像与运动分析参数。根据研究问题设定单次实验时长为5–15分钟。 
	注：本实验中采用5分钟。</li>
	<li>将待测鱼群连同其栖息水箱一起转移至实验区域，并将水箱放置在穿梭箱围挡之外。让鱼群适应环境10分钟。</li>
	<li>从相应组别中轻轻用网捞出一条鱼，将其放置于明暗穿梭箱的中央位置，确保释放时鱼体方向与穿梭箱长轴平行，以避免人为引导其偏向明亮区或黑暗区。</li>
	<li>在释放动物后立即开始记录行为。密切观察软件是否出现追踪异常，或鱼是否出现跳跃、僵直等异常行为。在完成一半受试个体的测试后，将穿梭箱旋转180°，以消除因穿梭箱某一端朝向围挡开放端所可能导致的方向偏好干扰。</li>
	<li>实验结束后，轻轻用网捞出鱼并将其从穿梭箱转移至暂养水箱或原栖息水箱中。</li>
</ol>
4. 分析
<ol>
	<li>检测在明区与暗区所花费的时间。对每组中的每条鱼，获取其在明区和暗区所花费的相对时间，并使用单样本 t 检验（或对非参数数据采用Wilcoxon符号秩检验；与总实验时间一半即150秒的差异）分析，以确定各组是否显著偏好某一区域。</li>
	<li>为比较偏好性，通过从暗区停留时间中减去明区停留时间计算偏好指数，并比较各组间的差异。t 检验可用于比较两组；必要时，采用单因素方差分析并结合Tukey’s HSD事后检验比较多个组（或对非参数数据采用Kruskal-Wallis检验并结合Dunn’s多重比较事后检验）。</li>
	<li>比较各组间的运动速度、区域转换次数、游动轨迹曲折度及静止不动时间。必要时采用单因素方差分析并结合Tukey’s HSD事后检验（或对非参数数据采用Kruskal-Wallis检验并结合Dunn’s多重比较事后检验）。</li>
</ol>

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</ol>

作者感谢Joshua Gallup提供用于拍摄图1的摄影设备。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金（授予T.J.H.）的资助。

先前涉及斑马鱼给药的研究仅依赖使用网具将鱼从饲养缸中捞出并转移至药物溶液中12,16。然而，使用网具操作并不总是稳定，且常因斑马鱼的逃避反应而耗时超出预期，而这种逃避反应在个体间存在显著差异。传统的转移方法虽然有一定用途，但仍有改进空间，例如可减少鱼类离水的总时间，并降低不同个体间转移时间的变异性。除了提升操作的实用性外，本方法还使研究人员能够在溶液中同时对大量鱼类进行精确时长的给药。以往的方法要么只能对单条鱼进行给药，要么需尝试同时用网捕捞整群鱼。前者效率低下，降低了通量；而后者操作笨拙且困难。此外，能够同时评估多条鱼行为的运动追踪系统也可从本方法的精确性中获益。鱼类可直接从产卵插槽转移至群游实验区域，从而确保所有个体几乎在同一时间进入该区域并暴露于实验环境中。
在为期21天的时间内，对三组斑马鱼实施这一新方法后获得了显著结果。对照组鱼类未接受酒精，每日适量组鱼类每天接受一次少量酒精，而每周暴饮组鱼类在21天期间每周接受一次大剂量酒精。在明/暗任务中，给药程序并未改变对照条件下斑马鱼对暗区的正常偏好。然而，在乙醇戒断2天后，每日适量组的斑马鱼更偏好实验区域的...

斑马鱼（Danio rerio）是一种原产于印度的小型硬骨鱼类，是行为学1和医学研究2,3中常用的一种模式生物。斑马鱼也常用于测试多种药理学物质，以表征这些物质对行为的影响。已有研究采用不同的剂量和给药方案，考察了兴奋剂4、抗焦虑药物5和乙醇6-8等化合物对斑马鱼行为的影响。
本实验室研究了不同乙醇给药方案对斑马鱼在经过充分验证的明暗实验（light/dark assay）9,20 中焦虑行为和运动活性的影响，该实验也常被称为趋暗实验（scototaxic assay）。我们开发了一种新的乙醇给药方法，以提高长期（21天）重复性每日给药的效率6。以往的方法虽具可行性，但我们希望开发一种能减少捞网操作及其相关时间成本，并可同时、精确控制大量斑马鱼给药时间的新方法。在传统的乙醇研究中，斑马鱼通常通过捞网从一个水箱转移至另一个含有特定浓度乙醇与水混合液的水箱10-12。尽管该方法被广泛接受，但捞网操作可能导致每次将鱼放入和取出药物溶液所需时间存在差异，从而在重复给药实验过程中造成实际药物暴露时间的不一致。因此，减少因转运时间变异所导致误差的方法具有重要意义。采用我们的方法，可实现所有斑马鱼的同时转移，确保每条鱼的给药时间完全一致。在完成乙醇暴露（如本文所述）后，可对斑马鱼进行多种行为学检测，包括评估焦虑水平的实验。使用新方法对鱼群进行给药，其优势不仅在于能够准确复制和标准化个体间及组间的给药过程，还具有更广泛的实用性。随着可同时追踪多条斑马鱼行为的新软件的出现，研究人员可能更倾向于采用我们的方法，以确保实验的可重复性和准确性。鉴于斑马鱼作为行为神经科学研究模型生物的广泛应用，该方法将显著提升未来药理学研究的效率和实用性。
在本实验范式中，采用了一种重复给药方案，该方案大致模拟了人类的饮酒模式。鱼类被随机分配至以下三组之一：对照组、每日适量饮酒组或每周暴饮组。给药周期持续21天，选择该时长是因为其显著超过了以往研究中的暴露时间7。对照组鱼类不接受酒精，每日适量饮酒组每天接受一次0.2%的酒精，而每周暴饮组每周接受一次1.4%的酒精。在停药2天后，采用明暗箱实验评估焦虑水平。该测试操作相对简单，使用一个矩形实验箱，其中一侧箱壁为白色，另一侧为黑色9。在对照条件下，成年斑马鱼显著偏好实验箱的黑色区域6,9,13。焦虑水平升高被操作性定义为在暗区停留的时间显著增加；而当鱼类在明区停留的时间相对更长时，则可推断其焦虑水平降低。通过运动轨迹追踪软件，还可量化其他具有信息意义的变量，包括平均速度、静止时间、游动轨迹曲折度以及区域穿梭次数14。
我们实验室开发的给药方法可适用于任何需要向一条或多条斑马鱼施用可溶于水的化合物的研究。目前，许多其他可能受益于该方法的药理学试剂正在斑马鱼中进行测试。常见的测试化合物包括尼古丁、氯氮䓬、丁螺环酮和东莨菪碱，这些化合物的溶解方式与乙醇类似，即将适量的化学物质混入水中。因此，该实验方法的通用性广泛，并不仅限于乙醇。此外，在连续多天给药后，明暗行为测试只是可采用的多种行为学检测方法之一。在药物给药后或戒断期间，还可使用其他常见的检测方法，如新水箱潜水测试15以及群集行为（shoaling）等社会行为测试16。以下实验流程将概述一种高效的方法，用于反复将斑马鱼群体或单条斑马鱼转移至含有目标药理学化合物的溶液中。此外，还将描述在长期酒精暴露后处于戒断状态的斑马鱼群体中，利用明暗测试评估焦虑行为的具体过程。

<table><tbody><tr><td>三层台式饲养系统</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.5 L 产卵缸，配备 400 &amp;mu;m 挡板</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>纯谷物乙醇</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethovision XT 运动轨迹追踪软件</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>明暗行为箱</td><td>定制</td><td></td><td>根据操作说明构建，尺寸为 9.5 cm 宽、9.5 cm 深、55 cm 长。</td></tr></tbody></table>

一种向多条斑马鱼（danio rerio）给药的新方法及其戒断反应的量化

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

斑马鱼的焦虑测试通常与药理学物质的应用相结合进行研究。在这些研究中，鱼类通常需要从家庭水族箱中用网捞出，并在不同给药水箱之间转运。为了提高化合物给药的便利性，我们开发了一种新的鱼类转移方法用于药物给药。该方法利用专为产卵设计的插入装置，将整组鱼类转移至药物溶液中，从而实现对群体中所有个体的精确给药。这种方法提高了给药的精确性和效率，尤其在需要长期重复给药的实验方案中显得尤为重要。我们已在一项研究中应用了该操作流程，用于检测在不同21天给药周期下，乙醇给药后斑马鱼在明暗箱实验中的行为变化。结果显示，在每日适量饮酒暴露的鱼类中，停药2天后其位置偏好与对照组相比存在显著差异；然而，在每周一次性大量饮酒（暴饮）暴露的组别中，未观察到位置偏好的显著差异。
该方案可推广应用于所有水溶性化合物，并可在需要检测鱼类在长期给药期间或之后行为变化的任何情况下使用。明暗测试也是评估戒断引起焦虑变化的有效方法。

为了在斑马鱼药理学研究中保持准确性和可控性，必须如上所述一致且准确地控制乙醇给药的持续时间。我们的实验流程可提高给药操作的便捷性和通量。无论是采用每周一次的暴饮模式还是每日适量给药模式，与对照组相比，斑马鱼的焦虑水平均发生了改变，该结果通过明暗箱实验进行测定。在末次给药后两天进行测试时，对照组斑马鱼（未接受酒精处理，但仍被转移至给药用鱼缸）表现出预期的行为模式，即对照组鱼在实验装置的暗区停留时间显著更长（图2A），这与以往其他研究中未经处理的斑马鱼行为相似6,9,13。每周暴饮组的斑马鱼在末次乙醇给药两天后进行测试时，对明区或暗区均无明显偏好（图2B）。有趣的是，每日适量组的斑马鱼则显著偏好实验装置的明区（图2C），这与对照组形成鲜明对比。偏好指数显示，对照组与每日适量组之间存在显著差异（图2D）。各组之间在游泳速度或静止时间上均无显著差异（表1），因此，该效应并非由斑马鱼运动功能障碍所致。
<p class="jove_content" ...

介绍了一种减少鱼类药物暴露过程中变异性的新方法。在明暗穿梭避暗实验中，暴露于不同乙醇暴露模式的鱼类在戒断期间表现出焦虑水平的改变。

一种向多条斑马鱼（Danio rerio）给药的新方法及其戒断反应的量化

斑马鱼焦虑行为测试常与药理学物质的应用相结合进行研究。在这些研究中，鱼类通常……

本实验的总体目标是通过准确、高效地对斑马鱼群体进行乙醇给药，以评估重复给药对乙醇戒断行为的影响。首先采用一种新开发的方法对斑马鱼进行给药，该方法可实现整群鱼类同时暴露于药物，并精确控制暴露时间。第二步是按照特定时间表持续给药，以便检测乙醇戒断的特定效应。接下来，在戒断期间，使用运动追踪软件记录每条鱼在明暗穿梭实验中的个体活动。最后一步是分析数据，以研究乙醇戒断对斑马鱼行为的影响。最终，采用所述方法进行重复乙醇给药，在停药两天后会对斑马鱼的行为产生短暂但显著的影响。该技术的主要优势在于，能够同时向大量鱼类给药，非常适合需要长期反复暴露于药物、药物或毒素的研究。该方法有助于回答神经药理学领域的一些关键问题，例如戒断相关行为的量化分析。我们最初产生该方法的想法，是在尝试同时向多条鱼施用乙醇时，发现用网捞取是一种既不准确又不精确的给药方式。首先，制定给药时间表，确保动物在相同环境条件下且每天同一时间给药，以避免时间因素或视觉刺激带来的干扰。接着，根据实验所需的组数，准备足够数量的相同规格的1.5升透明聚丙烯产卵缸，以便每天可同时测试两组鱼类。每组使用八条鱼，每组需要一个暂养罐和一个给药罐。因此，罐的数量是组数的两倍。然后在所有暂养罐中放置400微米的产卵插入物。在此处使用栖息地用水或反渗透水，并调节至适当温度填充水箱。斑马鱼通常使用25至28摄氏度的水温。确保水箱处于中性环境中，以避免在给药期间使鱼类对外部视觉刺激产生条件化反应。接下来，通过将适量药物与饲养用水在给药容器中混合来配制药物溶液。此处通过将高纯度乙醇与水在容器中混合，配制出0.2%乙醇溶液和1.4%乙醇溶液。小心地用网从饲养容器中捕捞鱼类，并转移至含有产卵装置的相应暂养容器中。理想情况下，应将鱼类直接安置于产卵装置内，从而完全避免后续操作中的捞网处理，所有鱼类均应置于各自的暂养容器中。轻轻将产卵插件从饲养箱中取出，并放入相应的药物溶液箱中。如果可能，应由助手协助同时转移所有组别至药物溶液中，以确保给药时间精确。按要求记录给药时间。在完成必要的给药周期后，将鱼置于乙醇溶液中30分钟，用于本文所述的实验步骤。小心地将产卵插板从药物溶液中提起，将鱼从乙醇溶液中取出，并轻柔地放回饲养缸中。准备一个明暗行为箱，其尺寸为宽9.5厘米、长55厘米、深9.5厘米，底部为白色防水材质。使用魔术贴将一张黑白相间的防水无反光纸固定在实验区域的内壁上，实验区域一半覆盖白色，另一半覆盖黑色。加入栖息地水至水深五厘米，水温保持在25至28摄氏度。在整个测试过程中维持该温度，并通过为实验区域搭建一个白色的三面围挡以减少外部视觉刺激。确保测试区域具有均匀的顶部漫射光照。光照条件应避免在水面产生反光，同时足够明亮，以便运动追踪软件或后续通过视频图像进行人工量化分析。随后，根据研究问题设定行为追踪软件的录制和运动分析参数，试验持续时间为5

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