Name: 在植物和绿藻的捕光配合体外重组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学习在体外重组植物和绿藻的捕光色素蛋白复合物的方法，通过从菠菜叶片提取色素并在E. coli中表达APA蛋白实现。该技术可获得高产量的复合物并用于光谱特性分析。

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本工作由欧洲研究理事会（ERC）向 RC 提供的启动/巩固资助以及荷兰物质研究基金会（FOM）通过 FOM 项目（10TM01）资助完成。

1. 从菠菜叶片中提取总色素
<ol>
	<li>将一把菠菜叶片（约20 g）在100 ml冷的研磨缓冲液中匀浆（见 表1使用搅拌机搅拌20秒。</li>
	<li>用孔径为20 μm的尼龙布过滤溶液两遍，然后将滤液在4 °C下以1,500 x g离心10分钟。</li>
	<li>用软毛艺术家画笔在1 ml预冷的洗涤缓冲液中重悬含有叶绿体的沉淀（参见 表1将沉淀重悬后，加入50 ml洗涤缓冲液，在4 °C下以10,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>去除上清液，并将沉淀（类囊体）在50 ml洗涤缓冲液中轻轻重悬（见 表1).</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，彻底去除上清液。此后所有操作均需在避光条件下进行，以避免色素氧化。</li>
	<li>加入约 20 ml 用 Na 缓冲的 80% 丙酮2CO3 （参见 表1) 提取色素。将溶液置于冰上静置10分钟，期间偶尔涡旋振荡。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 x g 离心 15 分钟，沉淀细胞组分。 
	注意：如果色素未完全提取，沉淀将呈绿色，应重复步骤 1.6。</li>
	<li>将上清液收集至分液漏斗中。加入0.4倍体积的乙醚，剧烈振荡，并打开活塞排气。</li>
	<li>加入0.8体积的0.33 M NaCl，剧烈混匀。静置约10分钟，待分层。上层乙醚相含有提取的色素。移除下层澄清相。 
	注意：如果分层不明显，可将溶液冷冻后再融化，以改善相分离效果。</li>
	<li>从分液漏斗顶部将乙醚倒入合适的玻璃容器中以去除乙醚。加入一勺颗粒状无水硫酸钠进行干燥。轻轻旋摇溶液，静置约5分钟，使干燥剂吸收乙醚中的水分。 
	注意：如果硫酸钠明显结块，请重复此步骤；当乙醚充分干燥时，应仍有部分游离的晶体存在。若出现水层，需先用巴斯德吸管将其移除，然后再加入无水硫酸钠。</li>
	<li>将乙醚倾入新的玻璃容器中，留下硫酸钠固体。</li>
	<li>在旋转真空浓缩仪（rotary speedvac）中或氮气流下蒸发乙醚2.</li>
	<li>将色素完全溶解于10 ml 100%丙酮中。</li>
	<li>将少量（约 3 µl）稀释至 1 ml 80% 丙酮中，测定吸收光谱并确定叶绿素（Chl）含量 a/b 比例以及叶绿素浓度，采用Porra所述方法 等. (1989)15.</li>
	<li>分装色素并在旋转浓缩仪中干燥，或在氮气下干燥2 流至丙酮完全蒸发。将干燥后的色素在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
2. 从菠菜中提取类胡萝卜素
<ol>
	<li>按照步骤 1.1 至 1.5 操作。此后，需在避光条件下进行以下步骤，以避免色素氧化。</li>
	<li>将类囊体沉淀重悬于约 50 ml 用 Na 缓冲的 96% 乙醇中2一氧化碳3 （参见 表1) 提取色素。将溶液置于冰上静置5分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以12,000 × g离心15分钟，使细胞组分沉淀。 
	注意：如果色素未完全提取，沉淀将呈绿色，应重复步骤 2.2。</li>
	<li>收集上清液，加入0.1倍体积的80% KOH（w/v）以启动皂化反应。</li>
	<li>将溶液于4 °C避光过夜，盖紧容器。</li>
	<li>将溶液收集至分液漏斗中。加入1体积的乙醚，轻轻混合。</li>
	<li>加入0.8倍体积的0.33 M NaCl，轻轻混匀。静置约10分钟，待分层。上层橙色醚相含有皂化后的类胡萝卜素。通过分液漏斗的活塞排出并去除下层绿色下相。</li>
	<li>加入3倍体积的水，轻轻混匀以去除氢氧化钾。静置分层。注意：如果上层相呈现浑浊，可加入少量NaCl（例如， 3 g NaCl 溶于 200 ml 溶液中，轻轻摇动使其溶解。</li>
	<li>通过分液漏斗的活塞排出下层液相。</li>
	<li>按照步骤 1.10 至 1.13 进行操作。</li>
	<li>将少量（约 3 µl）样品稀释至 1 ml 80% 丙酮中，在 80% 丙酮中测定 440 nm 处的吸收光谱。使用类胡萝卜素的平均消光系数（ε440 = 255)16 在以下公式中：Car [mg/ml] = (Abs440 nm/225) × 11（光程）＝ 1 cm</li>
	<li>分装并在真空浓缩仪或氮气下干燥类胡萝卜素2 流至所有乙醚完全蒸发。将干燥后的色素在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
3. Chlamydomonas reinhardtii 总色素和类胡萝卜素的提取
<ol>
	<li>通过将少量液体培养物涂布于培养皿中的固体TAP培养基表面，培养C. reinhardtii17。在20 μmol photos PSA m-2 sec-1的连续光照条件下培养，直至可见一层绿色细胞层。</li>
	<li>使用无菌接种环，从固体TAP培养基上刮取少量C. reinhardtii，并将细胞转移至1 L锥形瓶中的500 ml TAP培养基17中。在25 °C、170 rpm振荡及20 μmol photos PSA m-2 sec-1连续光照条件下培养该培养物。</li>
	<li>培养5–6天后，培养物应达到对数生长期末期（细胞密度为6 × 106 个细胞/ml，或在750 nm处的光密度为2–2.5）。在4 °C下以4,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>如需提取总色素，请执行步骤1.6至1.15。</li>
	<li>从500 ml完全生长的C. reinhardtii培养物开始提取，总色素提取物的产量约为5 ml溶液，其浓度为0.5 mg 叶绿素a+b/ml。</li>
	<li>如需提取类胡萝卜素，请执行步骤2.2至2.12。</li>
</ol>
4. 包涵体的纯化
<ol>
	<li>将目标LHC蛋白的编码序列通过标准分子生物学方法克隆至表达载体中，使其表达产物带有C末端His标签。将该重组质粒转化至 E. coli 宿主菌株，例如 BL21 (DE3)。</li>
	<li>制备裂解缓冲液、去垢剂缓冲液、Triton 缓冲液、TE（表1），1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和 LB 培养基18 使用适当的抗生素。</li>
	<li>选择一个单一的 E. coli 从新鲜划线的平板中挑取含有表达克隆的菌落，按照标准操作将其接种于约5 ml含有适当抗生素的LB培养基中6在37 °C、220 rpm振荡条件下培养至少16小时。</li>
	<li>将2.5 ml过夜培养物加入含250 ml LB培养基的1 L锥形瓶中，LB培养基中添加适当的抗生素。</li>
	<li>将细胞培养 2–3 小时（或直至 OD600 在37 °C、220 rpm条件下，OD600约为0.6。</li>
	<li>加入IPTG至终浓度为1 mM。继续在37 °C、220 rpm条件下培养细胞3-4小时。</li>
	<li>在预称重的离心管中，于4 °C条件下以5,000 x g离心10分钟。彻底弃去上清液，通过再次称重并减去离心管重量，确定沉淀物的重量。</li>
	<li>重悬 E. coli 用0.8 ml/g裂解缓冲液通过剧烈涡旋重悬细胞沉淀。 
	注意： alternatively，细胞沉淀物可在 -80°C 冻存以备后续使用。若起始材料为冷冻沉淀物，需先完全解冻，再加入裂解缓冲液。</li>
	<li>每克细胞加入2 mg溶菌酶，在湿冰上孵育30分钟，期间偶尔涡旋振荡。</li>
	<li>加入 20 μg/ml DNA酶和 10 mM MgCl₂2，1 mM NaCl，20 µg/ml RNA酶。涡旋混匀，冰上放置30分钟。</li>
	<li>每克细胞加入 2 ml 冷洗涤缓冲液，充分混匀，室温放置 5 分钟。</li>
	<li>转移至2 ml离心管中（如有必要，分装至两个离心管）。在4 °C条件下，以12,000 × g离心10分钟，使包涵体沉淀。</li>
	<li>加入1 ml冷的Triton缓冲液，通过超声处理完全重悬沉淀（50%功率，5秒/次，重复3次，每次间隔20秒）。注意：超声过程中将离心管置于盛有冰水的小烧杯中以保持低温。若处理多个样品，重悬后将所有包涵体合并至同一离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，使包涵体沉淀。</li>
	<li>重复步骤 4.13 和 4.14 两次。</li>
	<li>将包涵体重悬于1 ml预冷的TE缓冲液中，进行超声处理以彻底去除Triton缓冲液。4 °C条件下，12,000 × g离心10分钟，沉淀包涵体。</li>
	<li>将沉淀物用1 ml冷的TE缓冲液通过超声处理重新悬浮。</li>
	<li>通过标准方法（如Bradford法）测定蛋白质浓度19将包涵体分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
5. 重悬
该方案通常可获得1-2 ml的复溶蛋白，当在Qy区（600-750 nm）测量吸光度时，其OD值为4。产量可根据需要进行调整，但在操作过程中应注意保持适当的比例。
<ol>
	<li>按照表1所述配制以下溶液：2倍重悬缓冲液（2x Reconstitution Buffer）、20% OG、2 M KCl、TE。以下所有步骤均需在弱光条件下进行。</li>
	<li>在2 ml离心管中，用总共400 μl TE缓冲液重悬800 μg LHC包涵体。加入400 μl 2倍重悬缓冲液，短暂涡旋混匀。</li>
	<li>加入0.6 μl β-巯基乙醇（储存液浓度14.8 M），使终浓度为10 mM。将蛋白样品在98 °C加热1分钟，短暂涡旋后置于室温静置3分钟。</li>
	<li>在30 μl 100%乙醇中剧烈涡旋1分钟，或置于水浴超声仪中处理1–2分钟，以充分重悬500 μg总干燥叶绿素色素和80 μg类胡萝卜素色素。</li>
	<li>在4 °C、15,800 × g条件下离心约30秒，检查是否形成沉淀。若出现沉淀，需重复涡旋和/或超声处理。重要提示：色素重悬并离心后，必须立即加入蛋白溶液中，否则色素可能发生聚集，需重新溶解。</li>
	<li>在持续涡旋条件下，缓慢将色素混合液加入已冷却的蛋白溶液中。继续涡旋5–10秒，随后将离心管置于湿冰上。注意避免过度涡旋，以防蛋白溶液溢出管外。</li>
	<li>加入94 μl 20%辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG），使终浓度为2%，短暂涡旋后冰上孵育10分钟。</li>
	<li>加入90 μl 2 M KCl溶液，使终浓度为150–200 mM，短暂涡旋后冰上孵育20分钟。注意：此时可开始进行层析柱的准备工作（第6节）。</li>
	<li>在4 °C、15,800 × g条件下离心10分钟。小心移取上清液（沉淀为析出的LDS），转移至10 ml离心管中。保持低温并避光保存。</li>
</ol>
6. 镍柱纯化
<ol>
	<li>按表1所述配制以下溶液：OG缓冲液、OG洗涤缓冲液、洗脱缓冲液。</li>
	<li>将Ni-Sepharose柱（1 ml）或等效柱连接至蠕动泵，确保此步骤及后续步骤中无空气进入柱内。</li>
	<li>将泵速设为1 ml/min，用5–10 ml水冲洗柱子，以去除保存液。</li>
	<li>用3–4 ml OG缓冲液平衡柱子。</li>
	<li>向蛋白样品中加入3–4 ml OG缓冲液，并上样至柱子。注意：若蛋白在去除LDS后于冰上放置超过10分钟，需在4 °C下以15,800 × g离心1分钟，以去除可能产生的额外LDS沉淀。</li>
	<li>用5 ml OG缓冲液洗涤柱子。</li>
	<li>用2 ml OG洗涤缓冲液洗涤柱子。</li>
	<li>用3 ml洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白。收集含有重组蛋白的绿色洗脱液。注意：通常总体积约为1 ml。</li>
</ol>
7. 蔗糖梯度离心
<ol>
	<li>按照表1所述配制以下溶液：蔗糖溶液、0.06% β-DM、0.01 M HEPES，pH 7.6。</li>
	<li>将超速离心管装满蔗糖溶液后，在 -20 °C 过夜或在 -80 °C 至少冷冻 1 小时。</li>
	<li>从冰箱中取出离心管，于 4 °C 静置解冻。注意：冻融过程可形成 0.1 至 1 M 的蔗糖梯度。一支 15 ml 的离心管通常约需 3 小时完成解冻。</li>
	<li>小心地从顶部移除与第 6.8 步中从镍-Sepharose 柱洗脱出的绿色组分相同体积的液体，然后缓慢地将重组样品加至梯度顶部，避免扰动梯度。</li>
	<li>将离心管配平后，在 4 °C 条件下使用 SW-41 或 SW-60 摆桶转子的超速离心机以 200,000 × g 离心 18 小时，设置为慢加速，且停止时不使用刹车。</li>
	<li>用镊子小心地将梯度管从管架中取出。使用带有长针头（针头开口钝端）的注射器从顶部收集组分。注意：也可通过针头穿刺管底，从底部逐滴收集各组分。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突

膜蛋白的研究并不容易。分离天然膜蛋白的过程因需要使用去垢剂溶解脂双层而变得复杂，而去垢剂可能会损伤蛋白质并去除必需的辅因子。这些蛋白质在生物膜中的含量也可能很低，或与结构相近的蛋白质混合存在，例如捕光复合物的情况，这使得单一复合物的纯化十分困难。通过在E. coli中进行异源表达并结合体外重组 ，有望避免上述问题。体外重组与折叠蛋白的纯化所获得的复合物具有与天然复合物非常相似的特性20,21,23，因此可用于研究那些无法被纯化至均一状态的复合物24–27。
本方法使用全年易得的菠菜作为总色素和类胡萝卜素制备的来源。对于某些藻类来源的蛋白质重构，由于色素组成不同，优先使用从藻类中纯化的色素。无论色素来源如何，叶绿素a/b比值和叶绿素/类胡萝卜素比值均保持不变。
需要认识到，重建反应的效率通常约为35%28。因此，在重建完成后，必须从溶液中去除未结合的色素和未折叠的脱辅基蛋白。本方案中介绍了一种两步纯化流程（另见结果部分）。但应注意，蔗糖梯度步骤无法实现脱辅基蛋白与全蛋白的完全分离。对于大多数分析而言，这并非问题，因为脱辅基蛋白不含色素，因此不会干扰功能测定。然而，如果必须将脱辅基蛋白从含有重建复合物的组分中彻底去除（例如，用于计算色素与蛋白的化学计量比），则可使用阴离子交换柱（详见Passarini et al. 200929）。
重组捕光蛋白与分离色素的复性能力 体外 通过以不同方式改变重建的“环境”，为“操控”复合物提供了机会，从而改变所形成复合物的特性。例如，在重建过程中改变色素组成可获得具有不同色素组成的复合物。该特性可用于研究各种色素对复合物结构和稳定性的影响。通常，从菠菜中获得的色素制备物含有叶绿素 a/b 3:1，Chl/car 比值为 2.9:1。该比值通常可获得与天然蛋白性质相同的重组蛋白。然而，可根据需要调整 Chl a/b 通过添加纯化的叶绿素来测定比值 a 或 b 由于结合位点的选择性不同，可能影响各种色素的结合30–33。这成为可能是因为大多数色素结合位点对叶绿素（Chl）并非完全具有选择性 a 或 Chl b，但可容纳两者，尽管亲和力不同10,30,34类似地，类胡萝卜素结合位点也被证明能够容纳多种叶黄素类物质8,35–38. 采用不同色素组成的CP26（高等植物的另一种色素-蛋白质复合物）的重建实验如图所示 表 2 39这些重建产物用于评估结合位点对特定色素的亲和力39值得注意的是，为了获得与天然复合物具有相同色素组成的复合物，需要叶绿素 a/b 色素混合物的比例必须为3:1。这似乎是所有高等植物LHC复合物的共同特征20,40.
将分子生物学与重组技术相结合，可更深入地研究叶绿素结合复合物的特性。通过截短脱辅蛋白或进行随机诱变，已确定了不同蛋白结构域对复合物稳定性与折叠的重要性，以及它们在蛋白-蛋白相互作用中的作用8,41–44。还可通过定点诱变改变对不同色素配位起关键作用的单个氨基酸残基，以分析单个色素的特性，或评估其对复合物功能与稳定性的贡献10,28,29,45–52。图6展示了在216位组氨酸发生突变的重组Lhcb4（CP29）53。对野生型与突变型复合物的色素组成进行比较，发现该突变导致一个叶绿素a分子的丢失，表明在野生型复合物中，该靶向位点结合了一个叶绿素a。在色素含量归一化后，野生型与突变型吸收光谱的差异也揭示了丢失色素的吸收特性。在此例中，差异主要体现在680 nm处的主吸收峰，表明由His216配位的叶绿素a在该波长处发生吸收（有关此突变体及其光谱特性的更多细节，参见Mozzo et al. 200853）。突变分析还可用于确定微环境对色素光谱特性的影响54。
总之，光捕获蛋白可以轻松地被重建 体外 从而获得与天然复合物性质极为相似的色素-蛋白质复合物。通过这种方法，可避免分离天然蛋白质的困难，同时获得高产量和高纯度的蛋白质样品，用于后续研究。3:1 叶绿素 a/b 在生成天然复合物的过程中，组分比例的重要性被着重强调，并通过重建的野生型和突变型LHCs实例来展示该技术的应用。

植物和藻类的光合作用装置包含结合叶绿素a（chl a）、叶绿素b（chl b）以及类胡萝卜素（car）的内在膜蛋白。这些色素-蛋白复合物在捕获光能方面具有活性，并将激发能传递至反应中心，在反应中心用于促进电荷分离2。它们还参与调控反馈机制，以保护光合作用装置免受强光损伤3,4。光捕获复合物（LHCs）由植物和藻类中一大类相关的蛋白质组成5。
由于该家族各成员的化学和物理性质高度相似，其均一纯化一直较为困难。此外，纯化过程常常导致色素或其他潜在辅因子（如脂质）的丢失。体外重建是一种克服上述问题的有力方法。与光系统II相关的捕光复合物（LHC-II）最早于1987年由Plumley和Schmidt在体外成功重建1。研究人员分别从植物叶绿体中提取去脂蛋白和色素，然后在十二烷基硫酸锂（LDS）存在下将热变性的蛋白与色素混合，并进行三次冻融循环1。他们发现，重建后的LHC复合物的光谱特性与从植物中纯化的复合物非常相似。由于LHC色素-蛋白复合物易于重建，可能源于其内在的自组装特性，加之从生物体中分离纯化复合物存在困难，该方法迅速被其他研究者采纳。1990年，Paulsen及其同事实现了在大肠杆菌（E. coli）中过表达的光合蛋白的重建6。在E. coli中，过表达的膜蛋白通常存在于包涵体中，这有利于其纯化。通过在LDS存在下对含有重组蛋白的包涵体进行热变性，随后加入色素以启动蛋白折叠，即可实现重建。LHCII复合物的折叠是一个两步过程：首先，叶绿素a在不到1分钟内结合；随后，叶绿素b在数分钟内结合并趋于稳定7。
除了提供有关折叠动力学的信息外， 体外 结合定点突变的重组技术已能够鉴定出对稳定性具有重要作用的特定氨基酸例如， 8,9）或色素配位（例如， 10). 通过调节色素组成或去垢剂等参数来改变复性条件，也已鉴定出对正确折叠至关重要的因素，例如LHCII复合物的形成需要叶黄素。例如，&#160;1,11）。此外，通过重建的复合物，已有可能研究结合在这些复合物上的单个色素的性质。 体内 (例如， 10).
本文所述方法首先从菠菜和绿藻Chlamydomonas reinhardtii中分离色素（叶绿素和类胡萝卜素）。随后详细描述了以包涵体形式从大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化LHC蛋白的过程，接着进行LHC的重建，并通过镍亲和柱进行后续纯化。最后一步中，通过蔗糖梯度离心进一步纯化重建的复合物，以去除游离色素和未折叠的脱辅基蛋白。该方案整合了多个实验室在不同时期引入的若干优化改进，代表了一种优化后的操作流程1,6,10,12–14。

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>尼龙布&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;m 孔径</td></tr><tr><td>软毛绘画笔&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>辛基-&amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Sigma</td><td>O8001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP 培养基</td><td></td><td></td><td>参见参考文献 17</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td></td><td></td><td>参见参考文献 19</td></tr></tbody></table>

体外重建植物与绿藻的光捕获复合物

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

在植物和绿藻中，光能由捕光复合体（LHCs）捕获，这是一类整合膜蛋白家族，可结合叶绿素和类胡萝卜素。 体内，这些蛋白质与色素折叠形成复合物，并嵌入叶绿体的类囊体膜中。由于该家族成员在化学和物理性质上具有高度相似性，且在分离过程中容易丢失色素，因此难以将其纯化至天然状态。Plumley 和 Schmidt 于 1987 年提出了一种获得均一LHCs制备物的替代方法。1，表明这些复合物的重建是可能的 体外 从纯化的色素和去折叠的脱辅基蛋白开始，获得性质与天然复合物非常相似的复合物。这为使用细菌表达的重组蛋白铺平了道路 体外 重建。重建方法具有多种优势：（1）可获得单一复合物的纯化制备物，（2）可控制色素组成以评估其对结构和功能的贡献，（3）可对重组蛋白进行突变以研究各个残基的功能作用例如， 色素结合位点）或蛋白质结构域（例如， 蛋白质-蛋白质相互作用，折叠）。该方法已在多个实验室中得到优化，并已应用于大多数捕光复合物。本文所述方案详细介绍了捕光复合物的重建方法 体外 目前在我们实验室中使用， 并提供了描述该方法应用的示例。

本方案详细描述了光捕获复合体的重建过程 体外这些内在膜蛋白可结合叶绿素和类胡萝卜素，负责在高等植物和绿藻中捕获光能。

在植物和绿藻中，光能由捕光复合体（LHCs）捕获，这是一类整合膜蛋白家族，可结合叶绿素……

以下实验的总体目标是在体外重建植物或藻类的光捕获色素蛋白复合物。该过程首先从菠菜叶片或藻类培养物中提取色素，并在大肠杆菌中过表达APA蛋白。第二步，将APA蛋白与色素混合，从而获得重建的复合物。接下来，将重组的色素蛋白复合物从过量色素和未折叠蛋白中纯化，获得的结果显示，该重组色素蛋白复合物与天然复合物在吸收光谱、荧光光谱和圆二色性光谱上具有相似的光谱特性。该方法的主要优势在于，能够获得相对大量的色素蛋白复合物，并可通过使用突变型蛋白以及不同组成的色素混合物对复合物进行操控，从而验证该实验方案的有效性。Alberto na，实验室的一名研究生，将开始演示从菠菜叶片中提取总色素的实验步骤。首先，取约20克的一把菠菜叶片，加入100毫升预冷的研磨缓冲液，用搅拌器匀浆20秒。用孔径为20微米的两层尼龙布过滤溶液，并在4摄氏度下以1,500 ×g离心10分钟。弃去上清液，加入1毫升冷洗涤缓冲液。使用柔软的艺术家画笔重悬含有叶绿体的沉淀。待沉淀完全重悬后，加入50毫升洗涤缓冲液，于4°C、10,000 ×g 离心10分钟。移除上清液后，轻轻将沉淀重悬于50毫升洗涤缓冲液中，再次于4°C、10,000 ×g 离心10分钟，此后彻底弃去上清液。该操作必须在避光条件下进行。为防止色素氧化，加入约20毫升用碳酸钠缓冲的80%丙酮以提取色素，并将溶液置于冰上10分钟。间歇性涡旋混匀后，于4°C、12,000 ×g条件下离心15分钟，以沉淀细胞组分。总色素提取后应得到白色沉淀。将上清液收集到分液漏斗中。加入0.4体积的二乙醚。剧烈振荡，并确保打开阀门以排出气体。加入0.8倍体积的33 mmol/L氯化钠溶液，充分混匀。静置约10分钟，使各层充分分离。上层的乙醚相含有提取的色素。移除并弃去下层透明的水相。通过将乙醚相从分液漏斗顶部倒入合适的玻璃容器中，以去除乙醚。加入一勺粒状无水硫酸钠以干燥乙醚。轻轻旋转溶液，静置约五分钟，使干燥剂充分吸收乙醚中的水分。当乙醚充分干燥后。应有一些游离的晶体，且硫酸钠无结块现象。将乙醚倾入新的玻璃容器中，留下硫酸钠固体，分装色素并在旋转浓缩真空干燥仪中干燥，直至丙酮完全蒸发。将干燥后的色素于负80摄氏度保存。本视频未展示从菠菜中提取角蛋白样物质的过程，但干燥后的色素同样在负80摄氏度下保存。用于重组的光捕获复合物（LHC）以包涵体形式在大肠杆菌中表达并纯化。重组成功的关键在于色素蛋白与所用缓冲液体积之间的比例。该操作应在弱光条件下进行。将800微克LHC包涵体重悬于总共400微升TE中。在2毫升离心管中加入400微升2×重悬缓冲液，并涡旋振荡。短暂加入0.6微升14.8摩尔的β-巯基乙醇CAPTA乙醇储备液。为获得10毫摩尔的终浓度，将蛋白质在98摄氏度加热一分钟。短暂涡旋后，于室温放置三分钟。将500微克总干燥叶绿素色素和80微克角黄素色素溶于30微升100%乙醇中，剧烈涡旋振荡1分钟。在4°C、15,800 G条件下离心约30秒，确认离心后无沉淀；随后在涡旋振荡条件下，将色素混合物缓慢加入已冷却的蛋白溶液中。注意不要剧烈振荡，以免蛋白质溢出管口。继续振荡5到10秒，然后将试管置于湿冰上。加入94微升20%的辛基-β-D-葡萄糖苷（octyl beta D glucoside，简称OG），使终浓度为2%。短暂涡旋混匀，冰上静置10分钟，再加入90微升2摩尔的氯化钾溶液，使终浓度为150至200微摩尔。涡旋混匀片刻，冰上静置20分钟。在4°C条件下以15,800 ×g离心10分钟。将上清液转移至10毫升离心管中，注意勿扰动沉淀。保持natin处于低温并避光。按照方案文本所述，先准备一个1毫升的镍SROs柱。向蛋白样品中加入3至4毫升OG缓冲液，然后将样品上样到柱子中。用 5 毫升 OG 缓冲液冲洗层析柱，随后用 2 毫升 OG 洗涤缓冲液冲洗。用 3 毫升洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白。收集含有重组蛋白的绿色洗脱液。蔗糖梯度的制备按照方案文本中所述方法进行。小心地从梯度顶部移除与镍 SROs 柱洗脱出的绿色组分相同体积的液体，然后缓慢地将重组后的样品加至梯度顶部，注意避免扰动梯度。将离心管及其配平管放入 S SW 41 或 SW 60 摇摆桶转子中，在超速离心机中以 200,000 ×g、4°C 离心 18 小时，采用缓慢加速和无制动的停机模式。超速离心完成后，使用镊子小心地从离心管架中取出梯度液。绿色条带为待收集的组分。CP 24 的吸收光谱。将体外重建的叶绿素a/b结合蛋白与天然复合物的光谱进行比较。相同的光谱表明其色素组成和排列几乎完全一致。重组复合物的质量也可通过荧光光谱法进行评估。由于色素在不同波长激发下会发出荧光，叶绿素A在440纳米、叶绿素B在475纳米、叶绿素Z在500纳米处被激发。重组的CP24野生型复合物的荧光发射光谱经最大值归一化后，显示出从叶绿素B和叶绿素XANTHE向叶绿素A高效的能量传递。未与蛋白质结合的游离叶绿素B可通过约650纳米处的额外肩峰识别；而游离叶绿素A的存在则导致约675纳米处出现额外的发射峰。重组型和天然型CP 24复合物在475纳米激发下的荧光发射光谱均显示在681纳米处有一个单一峰，表明重组复合物正确折叠。重组型CP 24与天然复合物的圆二色光谱也极为相似。可通过改变对不同色素配位起关键作用的单个氨基酸残基，来分析单个色素的性质，或评估其对复合物功能与稳定性的贡献。此处展示的是野生型和突变型 CP 29 的吸收光谱。绿色线条表示两条曲线之间的差异。当正确操作时，包括蔗糖梯度和超速离心在内的该技术可在 24 小时内完成。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在植物和绿藻的捕光配合体外重组

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本文介绍了一种研究冷冻断裂植物组织的方法。将高压冷冻的叶片样品进行冷冻断裂并双层镀膜，获得保存良好的冷冻水合样品，随后使用冷冻扫描电子显微镜在高倍率下成像，且电子束损伤最小。...

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关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜

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一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥,...

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利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

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利用自发荧光成像评估红藻生理状态

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Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

单分子显微镜技术为核转运过程提供了新的见解。...

单分子成像技术观察核转运

学习在体外重组植物和绿藻的捕光色素蛋白复合物的方法，通过从菠菜叶片提取色素并在E. coli中表达APA蛋白实现。该技术可获得高产量的复合物并用于光谱特性分析。

体外重建植物与绿藻的光捕获复合物

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