Name: 在肾小管上皮细胞胞浆钙的测量流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用流式细胞术检测肾小管上皮细胞胞浆钙离子浓度变化的方法。该技术通过荧光染料负载和温和胰酶消化处理细胞，实现快速、高通量的钙信号动力学分析，适用于化合物筛选和细胞生理学研究。

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实验室研究工作由德国慕尼黑弗里茨-本德基金会（Fritz-Bender Foundation）（资助T.D.）以及维滕/黑尔德克大学校内研究基金（资助W.-K.L.）提供支持。谨此感谢弗兰克·特沃诺德教授（Frank Thévenod）博士（生理学与病理生理学研究所） &amp;#38; 毒理学，维滕/黑尔德克大学）提供的有益建议。

1. 试剂与溶液的准备
<ol>
	<li>配制改良的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（单位：mM：136.9 NaCl，5.37 KCl，0.34 Na2HPO4，0.44 KH2PO4，4.17 NaHCO3，pH 7.2，不含酚红）。4 °C保存。</li>
	<li>使用蒸馏水配制1.5 M CaCl2和2 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH 7.2）的储备液。</li>
	<li>配制250 mM的丙磺舒储备液。对于游离酸形式（通常称为水不溶性），将丙磺舒粉末溶于1 N NaOH中，加入蒸馏水至最终体积的四分之三，再缓慢滴加1 N HCl至pH 7.4。4 °C保存。</li>
	<li>将荧光膜通透性钙结合染料溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mM的储备浓度。避光保存于-20 °C。</li>
	<li>每次实验前，新鲜配制含丙磺舒的HBSS灌流（PHF）缓冲液：将改良HBSS与以下成分混合（终浓度）：1.5 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.2）、5%胎牛血清、2 mM丙磺舒和5.55 mM葡萄糖。预热至37 °C。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>在6孔板或35 mm培养皿中，每孔接种2.5 × 105个肾近端小管细胞（WKPT-0293 Cl.2），加入标准培养基，培养2天，使细胞融合度达到约70%。</li>
</ol>
3. 钙离子染料负载
<ol>
	<li>对于每个孔或培养皿，混合1 ml含5%胎牛血清、4 µM细胞通透性钙结合染料和2 mM丙磺舒的培养基。</li>
	<li>将每个孔中的培养基替换为1 ml染料负载混合液，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育30分钟。用铝箔覆盖培养板，以防止荧光指示剂漂白。</li>
</ol>
4. 流式细胞术样品的细胞制备
<ol>
	<li>将0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液预热至37 °C。</li>
	<li>吸除每孔中的钙离子负载染料溶液，并沿孔壁加入1 ml胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>在37 °C孵育，直至所有细胞完全脱落。</li>
	<li>将细胞转移至1.5 ml离心管中，在微量离心机中以10,000 g离心1分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>加入1 ml PHF缓冲液洗涤细胞，并通过反复吹打重悬细胞。</li>
	<li>以10,000 g离心1分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>重复步骤4.6和4.7共两次。</li>
	<li>将细胞重悬于终体积为500 µl的PHF缓冲液中，并在1小时内用于实验。</li>
	<li>可选：计数细胞以确定细胞浓度，每项检测使用5 × 104 – 1 × 105个细胞。</li>
</ol>
5. 流式细胞仪设置
<ol>
	<li>启动流式细胞仪，打开流体系统抽屉，拨动鞘液罐的排气阀开关以增加鞘液罐内的气压。</li>
	<li>对仪器进行“启动”操作，以清除内部管路和流动室中可能存在的气泡。</li>
	<li>在流式细胞仪软件中打开两个点图窗口。
	<ol>
		<li>第一个点图的X轴参数设置为前向散射光（FSC），Y轴参数设置为侧向散射光（SSC），分别用于通过细胞的大小和颗粒度来评估样品中细胞的质量。</li>
		<li>第二个点图用于测量钙离子结合染料的荧光强度。Y轴参数选择合适的荧光检测通道并采用对数刻度，X轴参数设置为时间（单位：秒），采用线性刻度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将流速设置为“高”。</li>
</ol>
6. 流式细胞术检测
<ol>
	<li>在室温下进行测量。在流式细胞仪样品管（11.5 × 75 mm）中加入 480 µl PHF 缓冲液。</li>
	<li>加入 20 µl 细胞悬液，并短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将管架臂移至一侧，将样品管置于样品进样管上方，直至形成紧密密封。然后将管架臂恢复至居中原始位置。</li>
	<li>通过调节荧光通道，使样品的平均荧光强度在 y 轴上约为 102，以优化测量参数。保存该设置并用于后续实验。</li>
	<li>开始实验时，重复步骤 6.1 至 6.3。</li>
	<li>记录 50 秒的基线荧光信号。</li>
	<li>暂停测量，取出样品管，加入待测化合物，短暂涡旋混匀后立即放回样品进样管。此步骤应不超过 15 秒。</li>
	<li>恢复测量，并持续进行至总时长为 204.8 秒。</li>
	<li>分别使用钙离子载体（如离子霉素，10 µM）和钙螯合剂（如乙二醇四乙酸 EGTA）、MnCl2 或 CoCl2（2 mM）作为阳性与阴性对照。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用专用的流式细胞术离线分析软件（如由斯克里普斯研究所流式细胞术核心设施 Joe Trotter 开发的免费软件 WinMDI）进行数据分析。</li>
	<li>打开包含 SSC 和 FSC 参数的散点图。</li>
	<li>使用“区域”工具（右键单击图像）选择用于分析的细胞区域，以在数据分析中排除位于左下角的死细胞或细胞碎片（图 1）。</li>
	<li>象限分析（图 2）
	<ol>
		<li>打开一个密度图，横轴为时间，纵轴为荧光强度。使用所有事件。</li>
		<li>使用与步骤 7.3 相同的设门区域。</li>
		<li>使用“象限”工具对数据进行定量分析。</li>
		<li>调整象限分界线，使垂直线位于化合物添加的时间点，水平线位于对照组基线荧光的中心位置。确保所有样本中的象限分界线位置一致。</li>
		<li>每个象限中细胞的百分比显示在各象限的角落（图 2）。比较各样本之间的右上象限（UR）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直方图分析（图 3）
	<ol>
		<li>在直方图窗口中打开对照数据，横轴为荧光强度，纵轴为事件数。使用所有事件。</li>
		<li>为获得直观的比较效果，将待测数据作为叠加图添加至对照图中（依次点击 文件 → 打开文件 → 选择文件 → 叠加）。</li>
		<li>进行定量分析时，必须使用单独的直方图窗口。使用步骤 7.3 中的 R1 区域对细胞群进行设门。</li>
		<li>在未处理的对照样本中，使用“标记”功能（“Markers”）标记分析区域，起始点为对照峰最小与最大荧光强度的中点，终点为最大荧光强度。计算该区域内细胞的百分比。</li>
		<li>从统计窗口中提取数据。对剩余的数据文件重复此操作，使用相同的标记区域进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光强度分析（图 4）
	<ol>
		<li>打开一个散点图，横轴为时间，纵轴为荧光强度。使用所有事件。</li>
		<li>启用“动力学模式”和“叠加动力学曲线”。散点图中将出现一条蓝色线，代表平均荧光强度。</li>
		<li>通过创建多个矩形区域来量化相对钙离子内流。每个区域的宽度应约为“50”，相当于“10 秒”。最多可定义 15 个矩形区域。</li>
		<li>从统计窗口中获取量化数据，并复制到电子表格中。</li>
		<li>使用 y-均值数据进行分析。计算 R2 至 R6 的均值，相当于 20 至 50 秒，作为基线值。</li>
		<li>选择合适的钙离子内流分析时间区间（取决于起始时间、持续时间和强度）。</li>
		<li>计算该时间区间内各区域相对于平均基线值的钙信号，即以化合物添加前的荧光信号为 100%。确定化合物添加后各区域的均值和标准差；该值即为化合物诱导的平均钙信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+pumps+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger%2C+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li>
<li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li>
<li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+proteins%3A+dynamic+calcium+signal+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li>
<li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li>
<li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+and+pumps+in+cancer%3A+changes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li>
<li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+the+heart%3A+when+it%27s+good%2C+it%27s+very+very+good%2C+but+when+it%27s+bad%2C+it%27s+horrid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li>
<li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li>
<li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+immunopathology+research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li>
<li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li>
<li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+Ca2%2B+flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li>
<li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li>
<li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li>
<li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li>
<li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benemid%2C%27+p-%28di-n-propylsulfamyl%29-benzoic+acid%3B+its+renal+affinity+and+its+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li>
<li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li>
<li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations%2C+anions+and+zwitterions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li>
<li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li>
<li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li>
<li>Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li>
<li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102(2010).</li>
<li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li>
<li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li>
</ol>

作者无披露信息。

钙作为第二信使信号分子以及内质网与线粒体之间通讯的媒介，在多种细胞过程中发挥关键作用。检测胞质游离钙浓度变化的能力是一种有用的技术，可应用于细胞生物学的各个领域。目前有多种方法可用于检测胞质钙信号。传统上，通过荧光成像系统监测比率型钙指示剂（如 Fura-2）在活细胞中的信号，并通过测定最小和最大荧光强度来推算出绝对钙浓度。然而，该技术需要专门的设备，例如荧光显微镜、活细胞成像系统及分析软件。本文介绍一种利用流式细胞术检测贴壁上皮细胞胞质中钙离子的简便方法，该方法大多数实验室均可实现。
上皮细胞拥有一系列负责代谢物、外源性物质和药物转运的转运蛋白。其中尤为重要的是SLC22A超家族，包括有机阳离子转运蛋白和有机阴离子转运蛋白22，以及ATP结合盒（ATP）超家族，后者包含多药耐药P-糖蛋白ABCB1和多药耐药蛋白（MRPs）等成员23。最初使用大鼠肾近端小管细胞系WKPT-0293 Cl.2进行的实验，如Gergely et al.16论文中所述。将细胞悬浮并用Fluo-3 AM负载，但在使用10 ...

钙是一种重要的第二信使，负责细胞生理和病理生理信号的传递1。细胞质中的钙离子浓度通过钙泵和钙交换体的活性维持在较低水平。肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）以ATP依赖的方式将钙离子重新泵入内质网（ER），作为“泵-漏”系统的一部分；而质膜钙离子ATP酶（PMCA）则以ATP依赖的方式将钙离子排出至细胞外空间2。生理信号分子（如激素或神经递质）通过G蛋白偶联受体传递信号，激活磷脂酶C，后者水解质膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2），生成二酰甘油和三磷酸肌醇（IP3）3。其中，二酰甘油保留在质膜中，而IP3扩散至细胞质，与位于内质网膜上的IP3受体（IP3Rs）结合；IP3Rs是一类配体激活的钙离子通道，其激活导致内质网腔内储存的钙离子释放，最终引起细胞质钙离子浓度升高4。钙离子进入细胞质的另一途径是通过质膜上存在的钙离子通道和交换体。这两个区室之间存在串扰：一种是钙诱导的钙释放（CICR），即细胞外钙离子诱导内质网储存钙的释放5；另一种是储存耗竭型钙内流（SOCE），即当内质网钙库耗竭时，STIM蛋白感知该状态，并引起质膜上的Orai钙通道开放，促进内质网钙库的重新充盈6。
在病理生理条件下，细胞钙反应失调，胞质钙浓度在缺乏生理性刺激因子的情况下升高1。钙反应可能以多种方式受到影响：钙信号持续延长、胞质钙清除延迟、钙库耗竭或局部钙变化。此外，线粒体在钙缓冲和释放过程中发挥核心作用7。持续和/或超最大强度的胞质钙升高可导致细胞死亡。事实上，钙几乎总是参与细胞的病理生理反应，是多种疾病中的关键事件，这些疾病包括神经退行性疾病、心脏病、癌症、骨病和肾病，主要与细胞死亡以及器官或组织功能的丧失或改变相关8-10。此外，钙信号的扰动还与细胞适应以及细胞功能和反应的改变有关。
传统上，钙信号通过带负电荷的荧光钙指示剂进行检测，该指示剂以细胞可渗透的乙酰氧基甲酯（AM酯）形式加载到细胞中。一旦被细胞内的酯酶切割，荧光指示剂便保留在细胞内，并在结合钙离子时荧光强度增强。最著名且应用最广泛的钙指示剂是Roger Tsien及其同事开发的比率型Fura-211。具有不同钙亲和力的钙指示剂可用于监测不同的钙池。检测方法包括活细胞成像、荧光酶标仪和流式细胞术。由于钙信号的动力学相对较快（通常在几秒至几分钟内），活细胞成像是获取钙信号特征最多信息的最佳方法。除了钙信号本身快速的动力学特性（可在毫秒级发生），活细胞成像也是研究单个细胞内钙信号亚细胞区室化分布的更优方法12。根据Grynkiewicz et al.11所述，通过分别添加钙螯合剂和对细胞进行透化处理，测定钙指示剂的最小和最大荧光值，即可计算出钙的绝对浓度。
利用流式细胞术检测钙信号最早于20世纪80年代在免疫细胞中建立，当时由于可同时测量多个参数（如细胞膜完整性和细胞群体的区分），且悬浮细胞的需求与单波长钙指示剂的发展相结合，使流式细胞术成为一种理想且便捷的检测方法13-15。对于贴壁细胞，活细胞成像能够提供最丰富的钙信号信息，尤其是动力学特征，但该方法需要复杂的设备，包括荧光显微镜、灌流系统、细胞环境（如温度）的维持，以及用于数据采集和分析的专业显微镜软件。其他替代方法，如荧光酶标仪或使用钙螯合剂的药理学手段，在所获取信息的丰富程度上均无法与之相比。尽管如此，流式细胞术正被越来越广泛地用于监测贴壁细胞的胞质钙水平，但在大多数研究中仅进行终点测量。通过采用Gergely et al.最初在免疫B细胞中建立的方法16，已成功在癌性上皮细胞及癌干细胞杂交体中，利用流式细胞术实时监测样本细胞群体中单个细胞的荧光强度变化，从而测定胞质游离钙浓度的动态变化17。该方法随后进一步优化，适用于难以负载钙指示剂的贴壁上皮细胞18。
本文采用一种源自大鼠肾近端小管S1段的永生化贴壁上皮细胞系（WKPT-0293 Cl.2）19，介绍了一种通过流式细胞术检测细胞质钙离子浓度变化的优化简化方法。由于许多上皮细胞表达多种有机阴离子转运体，细胞负载钙离子指示剂时常面临困难。为防止钙离子指示剂外排，孵育过程中需同时加入丙磺舒（probenecid）——一种经典的有机阴离子转运体抑制剂，最初用于减少青霉素的肾脏排泄20。细胞在单层培养状态下进行钙离子指示剂负载，随后悬浮并立即在加入化合物后检测钙信号。

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1241&amp;nbsp;</td><td>细胞可渗透</td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8761</td><td>水不溶，溶于1 N NaOH</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>衣霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur 流式细胞仪 + CELLQuest 软件</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术Windows多文档界面（WinMDI）</td><td>Joe Trotter，斯克里普斯研究所</td><td></td><td>请注意，这是一个较旧的16位应用程序，可读取符合FCS 2.0标准的文件，但无法识别FCS 3.0数字数据。</td></tr><tr><td>WKPT-0293 Cl.2 大鼠肾近端小管细胞系</td><td></td><td></td><td>由乌尔里希·霍普弗博士（生理学系）提供 &amp;amp; 生物物理学，凯斯&lt;br/&gt; 凯斯西储大学，克利夫兰，俄亥俄州</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术测量肾上皮细胞中的胞质钙离子浓度

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

多种生理和病理生理过程均需要或受钙离子调控，例如胞吐作用、线粒体功能、细胞死亡、细胞代谢以及细胞迁移等。细胞质中的钙离子浓度通常维持在低纳摩尔水平；而内质网、线粒体基质及细胞外空间中的钙离子浓度则处于高微摩尔至毫摩尔范围。在受到刺激时，细胞质钙离子浓度会出现短暂升高，从而触发下游事件。检测细胞质钙离子变化通常采用活细胞成像系统，结合钙离子结合染料，这些染料在结合钙离子后会表现出荧光强度增强或发射波长发生偏移。然而，并非所有研究人员都能方便地使用活细胞成像系统。已有其他检测方法被优化用于免疫细胞的流式细胞术分析，以及非免疫性贴壁细胞的荧光酶标仪检测。本文中，我们描述了一种使用单波长钙离子结合染料，通过流式细胞术检测上皮细胞钙离子变化的优化且简便的方法。将通常难以负载染料的贴壁性肾近端小管上皮细胞在丙磺舒存在下负载荧光可渗透的钙离子结合染料，制成细胞悬液后，分别在加入毒胡萝卜素（thapsigargin）、衣霉素（tunicamycin）和离子霉素（ionomycin）前后监测钙离子信号。

为了提高细胞质钙水平，将两种药理学化合物应用于负载了细胞膜通透性钙结合染料 Fluo-3-AM 的肾近端小管细胞（WKPT-0293 Cl.2）。未经处理的对照样本在存在丙磺舒的情况下加载钙结合染料，并进行混合，但不添加任何化合物。毒胡萝卜素（Thapsigargin, TG）是一种经典的 SERCA 泵抑制剂，可导致内质网中的钙泄漏，从而引起细胞质钙浓度升高。衣霉素（Tunicamycin, TUN）通过阻断蛋白质的 N-糖基化，激活未折叠蛋白反应，同时也可增加细胞质钙水平18,21。作为阳性对照，使用钙离子载体离子霉素（ionomycin, IONO），其可使细胞膜对细胞外钙离子通透。在分析时，通过在 SSC/FSC 散点图中选择一个区域（图1中的 R1）来圈定细胞群体。针对每个数据文件生成荧光强度随时间变化的密度图。利用象限分析功能，将散点图划分为四个区域，分别代表化合物添加前后以及高于或低于基础荧光水平的 Fluo-3 荧光强度。通过计算各象限中圈定细胞群体所占的百分比，可评估细胞质钙浓度的升高情况。在此示例中，3 µM TG 导致右上象限细胞百分比增加，表明钙信号被成功诱...

钙参与多种生理和病理生理信号通路。活细胞成像需要专门的设备，且耗时较长。本研究优化了一种快速、简便的方法，利用流式细胞仪检测悬浮状态下的贴壁上皮细胞胞质钙的相对变化。

多种生理和病理生理细胞过程均需要钙或受钙调控，包括胞吐作用、线粒体……

本实验的总体目标是检测肾上皮细胞中胞质钙离子的变化。首先，在阴离子转运体抑制剂probit存在的情况下，将细胞负载一种荧光钙离子响应染料。第二步是通过温和的胰蛋白酶消化使细胞悬浮。离心后，用含 HBSS 缓冲液的 probit 洗涤细胞。最后一步是使用流式细胞仪检测化合物诱导的变化。最终，通过流式细胞术展示肾上皮细胞胞质钙离子变化的动力学过程。与现有的生活方式成像等方法相比，该技术的主要优势在于操作简便、快速，适用于化合物的筛选。该肌肉模型有助于回答细胞内信号传导领域的关键问题，使研究人员能够在生理和病理生理细胞信号传导背景下探究钙离子的作用。本次实验操作将由本团队的技术员 Sylvia Kyle 演示。本实验采用一种源自大鼠肾近端小管S1段的永生化贴壁上皮细胞系。在钙成像染料加载前两天，将每孔2.5×10⁵个细胞接种于6孔板中，使用标准培养基培养。培养两天至细胞融合度约为70%。实验当天，为每孔配制钙成像染料混合液：取1毫升含5%胎牛血清的培养基，加入4 µM膜通透性钙离子结合染料Fluo-3 AM和2 mM丙磺舒。丙磺舒是有机阴离子转运体的抑制剂，可用于防止钙指示剂外排。将每孔中的标准培养基更换为一毫升染料负载混合液。用铝箔包裹培养板，以防止荧光指示剂漂白，并在含5%二氧化碳的湿润培养箱中37摄氏度孵育30分钟。为进行流式细胞术检测，吸除每孔中的钙指示剂负载溶液，沿孔壁加入一毫升胰蛋白酶。在37摄氏度下孵育，直至所有细胞脱落。将细胞转移至1.5毫升离心管中，并在10,000 ×g 条件下离心1分钟，形成细胞沉淀。小心吸除上清液，避免扰动沉淀。按照文本方案中的说明，用含有 HBSS 流式缓冲液或 PHF 缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于 500 µL 的 PHF 缓冲液终体积中，细胞应在一小时内用于实验。开始此操作前，先启动流式细胞仪，打开流体系统，并拨动阀开关。为增加鞘液储液罐的空气压力，需启动仪器以清除内管和流动室中可能存在的气泡。在流式细胞术软件中，打开两个点图窗口。启动流式细胞仪，然后将流速调至高速。流式细胞术检测在室温下进行。首先，向流式细胞仪样品管中加入 480 微升 PHF 缓冲液。然后加入 20 微升细胞悬液，短暂涡旋混匀。将管架臂移至一侧，将样品管置于样品进样管上方，直至形成紧密密封。将管架支撑臂恢复至初始居中位置。通过调节荧光通道，使样品的平均荧光强度在Y轴上约为10的2次方，优化测量参数，保存并用于后续实验。开始实验时，准备另一个样品，并将样品管置于样品进样管上方。与之前相同，将管架支撑臂恢复至初始居中位置。记录50秒的基线荧光信号。下一步操作必须快速且准确地进行，以确保捕获到信号。当所有准备工作都完成时，成功率会提高。每次操作均需在15秒内迅速完成以下步骤：暂停测量，取出样品管，加入目标化合物，短暂涡旋混匀，然后将样品管放回样品进样管

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科研

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Biology

生物学

在肾小管上皮细胞胞浆钙的测量流式细胞仪

本文将详细介绍使用流式细胞术在固定细胞和活细胞中检测钙蛋白酶活性的实验方案。...

通过流式细胞术测量固定和活细胞中的钙蛋白酶活性

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

本视频介绍了一种基于共聚焦显微镜成像的检测方法，用于测量培养细胞中的线粒体钙离子摄取。该检测方法利用钙离子敏感的荧光染料...

用于测定培养细胞中线粒体钙摄取的钙离子内流检测法

足细胞内钙离子水平的变化是调控肾小球滤过功能最重要的机制之一。本文介绍了一种高通量方法，可用于检测新鲜分离的肾小球足细胞中钙离子的实时动态变化以及单个离子通道的活性。...

新鲜分离肾小球中足细胞的单通道分析与钙离子成像

在肾小管上皮细胞中表达的离子通道在多囊肾病的病理过程中起着重要作用。本文介绍了用于对从啮齿类动物肾脏新鲜分离的囊性上皮组织进行膜片钳分析和细胞内钙水平测定的实验方案。...

采用膜片钳与活细胞荧光显微技术监测新分离的多囊肾上皮细胞功能特性

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。...

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

我们介绍了靶向基因编码钙离子指示剂（GECI）CatchER 的应用方案+ 用于通过实时荧光显微镜监测 HEK293 细胞和骨骼肌 C2C12 细胞内质网/肌浆网（ER/SR）中快速钙瞬变的方案。一种用于 原位 Kd...

使用靶向 Ca2+ 传感器 CatchER+ 监测内质网/肌浆网钙释放

实时流式细胞术具有单细胞灵敏度，特别适用于定量活体培养物中多模态受体的功能。利用成年神经前体细胞，通过钙离子指示染料检测钙离子内流、溴化乙锭摄取检测跨膜孔道形成，以及使用荧光乳胶微球检测吞噬作用，对P2X7受体功能进行了评估。...

实时活细胞流式细胞术研究成年神经前体细胞中P2X7受体介导的钙离子内流、孔道形成及吞噬作用

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

活细胞钙信号成像被广泛用于研究在单层培养的稳定细胞系中的钙离子动员。本方案描述了利用活细胞染料对复杂原代组织进行活细胞荧光成像以检测钙信号，并结合机器学习软件同时量化数千个单个细胞的荧光强度，从而简化分析流程。...

基于荧光的钙成像结合自动细胞分割技术在原代人呼吸道上皮细胞培养中的应用

学习使用流式细胞术检测肾小管上皮细胞胞浆钙离子浓度变化的方法。该技术通过荧光染料负载和温和胰酶消化处理细胞，实现快速、高通量的钙信号动力学分析，适用于化合物筛选和细胞生理学研究。

通过流式细胞术测量肾上皮细胞中的胞质钙离子浓度

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