用于高效杀伤的杀手型人工抗原呈递细胞（KaAPC） 体外 耗竭人抗原特异性T细胞

本实验的总体目标是生成一种非细胞的、基于HLA IG的杀伤性人工抗原呈递细胞（K-A-A-P-C），用于清除自身反应性或不需要的T细胞群体。首先，将HLA IG分子和抗FA单克隆抗体共价连接到细胞大小的铁葡聚糖颗粒上，以生成具有功能的K-A-A-P-C。第二步，通过流式细胞术对K-A-A-P-C进行表征，以确保其功能正常。随后，将K-A-A-P-C负载不同的目标多肽，以靶向清除不需要的抗原特异性T细胞群体。

最终，可通过流式细胞术分析来检测T细胞对由相应抗原负载的K-A-A-P-C介导的抗原特异性抗脂肪杀伤作用。我们最初产生该方法的想法，是在研究基于细胞的杀伤性抗原呈递细胞开发过程中遇到问题时，同时我们也在进行基于微珠平台的技术开发，用于免疫细胞调节。生成K-A-A-P-C的首要步骤是：将250 µL储存液中的环氧微珠与250 µL freshly prepared硼酸盐缓冲液加入无菌螺口玻璃小瓶中。

将离心管置于磁力架上静置两分钟，使磁珠吸附，吸除缓冲液后将离心管从磁力架上取下。用另一毫升 Bore 8 缓冲液洗涤磁珠一次，随后将磁珠重悬于 550 微升 HLA A2 IG 和抗人 CD95 单克隆抗体（MAB）中。轻轻振荡离心管以混匀磁珠与抗体，随后将磁珠在 4 摄氏度下以头尾翻转旋转仪孵育 24 小时。

第二天，在室温下以 300 × g 离心珠子两分钟，然后将离心管放回磁力架上。两分钟后，吸除上样缓冲液。将离心管从磁力架上取下，加入一毫升洗涤缓冲液，轻轻振荡洗涤珠子。

第三次洗涤后，将小瓶在1 mL新鲜的磁珠洗涤缓冲液中旋转，以封闭任何残留的蛋白质结合位点。第二天，再次离心磁珠，并将小瓶放回磁铁上。两分钟后，吸去洗涤缓冲液。

将小瓶从磁铁上取下，向KAPC中加入1毫升PBS。为检测磁珠的质量，取1.5 × 10⁵个K-A-A-P-C转移至流式管中，用1毫升流式洗涤缓冲液（fax wash buffer Resus）洗涤。将磁珠沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中，加入1微升PE标记的抗小鼠IgG1抗体以检测HLA-A2-Ig，再加入1微升TC标记的抗小鼠IgM抗体以检测抗人CD95单克隆抗体（MAB）。

然后在4°C孵育15分钟，用1毫升Fax洗涤缓冲液重悬珠子。将其悬浮于250微升洗涤缓冲液中，并在流式细胞仪上检测样品的肽段加载情况。取两份各10的7次方个K-A-A-P-C细胞，转移至新的无菌玻璃小瓶中。

将珠子置于磁铁上两分钟后，吸除PBS，并将珠子重悬于500微升含有5微克肽段的新鲜PBS中。在管子上标记日期及所加载肽段的名称K-A-A-P-C。随后将加载了K-A-A-P-C的样品在4摄氏度下保存至少三天，以确保肽段充分加载至HLA A2 Ig二聚体上，用于后续进行A-K-A-A-P-C体外杀伤实验。

用洗涤液至少洗涤负载多肽的K-A-A-P-C六次，以去除所有游离多肽。然后将K-A-A-P-C与两份10的5次方抗原特异性T细胞以1:1的比例转移至96孔圆底培养板的每个样品孔中，每孔加入200微升共培养培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养48小时。随后将样品转移至相应的流式管中，并用1毫升Annexin V结合缓冲液洗涤。

接下来，将沉淀重悬于 100 µL 的 Annexin V 结合缓冲液中，然后在室温下向样品中加入 1 µL Annexin V-FITC 和 5 µL 7-AAD，孵育 10 至 15 分钟。孵育后，用 1 mL Annexin V 结合缓冲液洗涤样品，并将沉淀重悬于 250 µL Annexin V 结合缓冲液中。随后立即使用流式细胞仪检测样品。

K-A-A-P-C 可同时展示 HLA A 二聚体和抗原特异性单克隆抗体，与基于细胞的方法相比，其表达不受编码或转导效率的影响，并且在生产过程中易于调控。当负载特异性肽段时，K-A-A-P-C 能够在体外耗竭抗原特异性 T 细胞，而负载非特异性肽段的 K-A-A-P-C 则不会耗竭 T 细胞，因此 K-A-A-P-C 以抗原特异性方式诱导 T 细胞凋亡。

随后，当仅使用 K-A-A-P-C 从不同特异性 T 细胞的混合物中选择性清除抗原特异性 T 细胞时，对邻近 T 细胞的细胞毒性作用极小。因此，K-A-A-P-C 成为一种极为精确的体外工具，可用于清除活化的抗原特异性人 T 细胞，在治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有潜在的临床应用价值。该技术的建立为细胞免疫学领域的研究人员探索 T 细胞介导的自身免疫性疾病及移植排斥反应的新治疗方法开辟了道路。