Name: 杀手人工抗原提呈细胞（KaAPC）为有效在体外人抗原特异性T细胞耗竭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习制备杀手人工抗原提呈细胞（KaAPC）用于体外特异性清除人抗原特异性T细胞的方法。该技术通过HLA IG分子与抗体共价连接铁葡聚糖颗粒实现，为自身免疫病治疗提供精准靶向工具。

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本工作得到了德国研究基金会（DFG）SCHU-2681/1-1（C.S.）和KFO 146（M.F.）、美国国防部（DOD）资助项目PC 040972（M.O.）以及美国国立卫生研究院资助项目RO1 CA108835、RO1 Ai44129（J.P.S.）的支持。

1. 基于HLA-A2-Ig的KaAPC的制备
<ol>
	<li>制备无菌硼酸盐缓冲液。将硼酸溶解于水中，配制成 0.1 M 的溶液，并调节 pH 至 7.0。使用 0.22 μm 滤器无菌过滤缓冲液，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>制备无菌珠洗缓冲液。使用不含镁和钙的磷酸盐缓冲液（PBS）。加入人 AB 血清，使其终浓度为 3%。加入乙二胺四乙酸（EDTA），使其终浓度为 2 mM。加入叠氮化钠（NaN3），使其终浓度为 0.01%。使用 0.22 μm 滤器无菌过滤缓冲液，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>从储备液中转移 250 μl 环氧基微珠（约 100 × 106 颗微珠）至无菌螺口玻璃小瓶中。</li>
	<li>加入 250 μl 硼酸盐缓冲液。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于磁铁上，静置 2 分钟使微珠吸附；吸除缓冲液后将玻璃小瓶从磁铁上取下。</li>
	<li>用 1 ml 硼酸盐缓冲液洗涤微珠一次。</li>
	<li>将微珠重悬于 550 μl 含 0.018 μg/ml HLA-A2-Ig 和 3.64 μg/ml 抗人 CD95 单克隆抗体（克隆号 CH11）的溶液中，轻轻振荡混匀。（更多信息请参见讨论部分。）</li>
	<li>将玻璃小瓶置于旋转仪上，于 4 °C 颠倒旋转孵育 24 小时。</li>
	<li>在 300 × g 离心 2 分钟，使微珠沉淀。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于磁铁上 2 分钟，吸除“KaAPC 负载溶液”；将玻璃小瓶从磁铁上取下，加入 1 ml 珠洗缓冲液，轻轻振荡重悬微珠。</li>
	<li>重复步骤 1.10 两次。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于旋转仪上，于 4 °C 在 1 ml 珠洗缓冲液中孵育 24 小时。此时，珠洗缓冲液中含有的人 AB 血清将封闭所有残留的蛋白结合位点。</li>
	<li>在 300 × g 离心 2 分钟，使微珠沉淀。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于磁铁上 2 分钟，吸除珠洗缓冲液；将玻璃小瓶从磁铁上取下，更换为 1 ml PBS。</li>
</ol>
2. KaAPC 的质量控制、肽段加载、洗涤、储存与稳定性
<ol>
	<li>将 1.5 × 105 个 KaAPC 细胞转移至流式管中，加入 1 ml FACS 洗涤缓冲液洗涤。</li>
	<li>将磁珠重悬于 100 μl FACS 洗涤缓冲液中，加入 1 μl 抗小鼠 IgG1 PE（用于检测 HLA-A2-Ig 的 Fc 段）和 1 μl 抗小鼠 IgM FITC（克隆号 R6-60.2，用于检测抗人 CD95 单克隆抗体）。</li>
	<li>4 °C 孵育 15 分钟，用 1 ml FACS 洗涤缓冲液洗涤，再重悬于 250 μl FACS 洗涤缓冲液中，通过流式细胞术检测染色结果。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术直方图、HLA-A2-Ig 和抗 CD95 分析、细胞事件比较。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 按本方案部分所述制备的 KaAPC 批次的质量控制染色结果。 染色操作按方案第 2 部分所述进行。HLA-A2-Ig 使用抗小鼠 IgG1 PE 单克隆抗体检测，而抗人 CD95（抗 Fas）则使用抗小鼠 IgM FITC 单克隆抗体检测（见方案第 2.2 节）（蓝色线条）。实心黑色图谱代表分别用抗小鼠 IgG1 PE 单克隆抗体或抗小鼠 IgM FITC 单克隆抗体染色的空白微球。右上角数字表示平均荧光强度（MFI）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>进行多肽负载时，将 20 × 106 个 KaAPC 转移至新的无菌玻璃小瓶中，置于磁铁上 2 分钟，吸除 PBS，然后将珠子重悬于含 5 μg 多肽的 500 μl 新鲜 PBS 中（注意：只有 HLA-A2 限制性多肽才能结合到二聚体上！）。</li>
	<li>将负载多肽的 KaAPC 储存于 4 °C，至少保存 3 天，以确保多肽充分结合至 HLA-A2-Ig 二聚体上。</li>
	<li>使用前立即按照步骤 1.14 所述方法洗涤负载多肽的 KaAPC；重复此步骤至少 6 次。 
	注意：此步骤至关重要，必须彻底去除游离多肽，以避免出现假阳性杀伤结果；已有研究表明残留的游离多肽可诱导抗原特异性 T 细胞培养物发生凋亡9。为排除可溶性多肽的影响，应设置负载并洗涤后的 KaAPC 上清液对照样本（见 3.8）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对珠子进行计数，并标注日期、多肽名称及浓度。 
	注意：负载多肽的 KaAPC 在 4 °C 下至少可保持功能活性一个月。超过一个月后，重新用相同多肽负载，可使 KaAPC 继续使用长达一年。</li>
</ol>
3. KaAPC 体外 杀伤实验
<ol>
	<li>制备共培养基。制备完全RPMI培养基，添加3% T细胞生长因子（实验室制备6）和3%供体自体血浆。若无供体自体血浆，可使用热灭活的人AB血清。</li>
	<li>制备Annexin V结合缓冲液。将8.12 g氯化钠（NaCl）和0.12 g氯化钙（CaCl2）溶解于990 ml去离子水（ddH2O）中，再加入10 ml 1M HEPES缓冲液。</li>
	<li>制备人源抗原特异性T细胞。（详细方案请参见先前发表的利用人工抗原呈递细胞（aAPC）的研究7。）通过四聚体染色法确认肽段特异性至少达到&gt;75%。</li>
	<li>每份样品中，将2 × 105个抗原特异性T细胞/孔（置于96孔圆底培养板中）与KaAPC以1:1比例在200 μl共培养基中共同孵育48小时，孵育条件为37 °C、5% CO2的湿润培养箱。</li>
	<li>收集样品并转移至FACS管中，加入1 ml Annexin V结合缓冲液洗涤，300 × g离心5分钟，弃上清液，重悬于100 μl Annexin V结合缓冲液中。</li>
	<li>在室温下用1 μl Annexin V-FITC和5 μl 7-AAD染色10–15分钟，加入1 ml Annexin V结合缓冲液洗涤，300 × g离心5分钟，弃上清液，重悬于250 μl Annexin V结合缓冲液中。</li>
	<li>立即上流式细胞仪检测样品。</li>
	<li>准备以下样品以评估KaAPC介导的抗原特异性杀伤作用：仅T细胞；T细胞 + 可溶性抗CD95抗体；T细胞 + 未负载肽段的KaAPC；T细胞 + 负载非同源肽段的KaAPC；T细胞 + 负载同源肽段的KaAPC；T细胞 + 负载同源肽段KaAPC的上清液。</li>
</ol>
<img alt="T细胞凋亡的流式细胞术分析；Annexin V 与 PI 点图，比较不同实验条件。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. KaAPC 杀伤实验。 将负载多肽的KaAPC或对照珠（仅含HLA-A2-Ig的珠）与CMVpp65特异性T细胞（约80%）以1:1比例共培养48小时，收集细胞后用Annexin V和碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术检测细胞凋亡（见方案第3.3–3.7节）。“同源”指负载CMVpp65的珠，“非同源”指负载Mart-1多肽的珠。数值表示每个图左下象限中活T细胞的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="9">
	<li>为进行交叉实验，需制备两种不同特异性的抗原特异性T细胞。</li>
	<li>通过同时分析异质性T细胞群体中抗原特异性T细胞的清除情况，进一步评估KaAPC的抗原特异性耗竭能力。（详细实验方案请参见Schütz et al.10）。</li>
</ol>

<ol><li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells%3A+the+synthetic+embodiment+of+a+%E2%80%9Cguided+missile%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+but+not+immature+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415</a> 5406-5413 (2003).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+by+Fas+ligand+%28FasL%2FCD95L%29-expressing+Killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li>
<li>Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li>
<li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li>
<li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li>
</ol>

C.S. 和 M.F. 无任何利益冲突需要披露。
根据NexImmune公司与约翰斯·霍普金斯大学之间的许可协议，Schneck博士和Oelke博士有权获得大学因本文所述aAPC产品销售所获特许权使用费的部分收益。他们还持有NexImmune公司的股票，该持股受大学政策规定的某些限制。Schneck博士担任该公司&#34;董事会及科学顾问委员会成员。此项安排的相关条款由约翰斯·霍普金斯大学依照其利益冲突政策进行管理。

该实验方案中最关键的步骤是确保信号1（肽-MHC）与信号2（抗Fas单克隆抗体）之间的适当比例。我们已进行了大量的滴定实验以确定信号1和信号2的最佳比例；结果表明，HLA-A2 Ig二聚体或抗Fas单抗浓度的微小差异均可能干扰KaAPC的功能。因此，即使从商业来源获取，也应始终验证两种信号的浓度，并定期检测两种蛋白质的质量。此外，应始终使用相同的检测方法来确定浓度，因为不同的检测方法可能导致浓度测定结果不同。HLA-A2-Ig的功能也可能因复性不完全和/或肽段加载效率低下而受损。此外，二聚体分子可能在不同程度上发生聚集，这可能影响蛋白质的功能活性。因此，生成具有功能性和特异性的KaAPC所需的二聚体实际用量可能会有所变化。另外，我们发现KaAPC上诱导死亡信号的抗Fas单抗的理想浓度范围极为严格。在我们的实验中，浓度超过3.64 μg/ml会导致对Fas阳性T细胞的非特异性杀伤，而低于3.64 μg/ml则会导致杀伤活性呈剂量依赖性降低。尽管这些条件较为严格，但关注这些细节将有助于成功生成具有功能性和特异性的KaAPC。
尽管目前的KaAPC表型在清除活化的抗原特异性T细胞方面具有功能，但早期针对初始态或静息态抗原特异性T细胞的实验表明，这些细胞群体中Fas表达水平较低，因而未能显著诱导抗原特异性凋亡。因此，可以设想在KaAPC上添加共刺激信号，以诱导静息T细胞上调Fas表达，从而使其成为KaAPC的靶标。虽然这一策略在理论上可行，但必须谨慎滴定所有三种信号，以确保获得具有功能性的KaAPC表型。
将微珠平台调整为生物相容性或可生物降解的基质将增强KaAPC 体内 适用性。最近，Shen 等 已报道成功的 体内 利用KaAPC的使用 5 μm 与抗 Fas（克隆 Jo2）和抗 His/H2-K 偶联的乳胶微球b-TRP211我们已能够证明，人工抗原呈递细胞（aAPC）的通用概念可成功地从 μm 从微米级颗粒到纳米级颗粒12 且该功能受颗粒几何形状的影响13因此，通过改变未来KaAPC设计的大小和/或形状，可能能够对其产生影响 体内 功能与生物分布，这对于器官特异性自身免疫性疾病的成功治疗可能至关重要。
KaAPC 克服了基于细胞的耗竭策略的主要缺陷，是一种易于使用、可即取即用、高效节省时间与成本的方法，且不受供体状态和预处理的影响。KaAPC 不会成为自身或旁分泌杀伤信号的靶点，也不易受细胞毒性T淋巴细胞（CTL）裂解效应功能的影响。KaAPC 的应用需要确定相关疾病抗原，并依赖于其特定的 HLA 类型。尽管目前已有大量适用于 1 型糖尿病、移植物抗宿主病（GvHD）和多发性硬化症的 HLA-A2 限制性抗原被鉴定出来2，但更多 HLA I 类二聚体分子的开发以及新的自身免疫相关抗原的持续发现，将进一步提升并拓展 KaAPC 的适用范围。此外，还可考虑使用靶向不同表位的 KaAPC，以同时靶向多种抗原。
总之，KaAPC 代表了一种用于抗原特异性 T 细胞耗竭的灵活平台技术。其“乐高样”的特性使得可在不同基质上引入新的信号，例如额外的共刺激或抑制性信号（如 PD1 或 TRAIL），从而拓展并增强其后续应用潜力。 体外 和 体内 适用性。本文中，我们提供了生成KaAPC的逐步实验方案，这是首个基于微珠的技术方法，可用于从具有不同特异性的T细胞混合物中清除抗原特异性T细胞。
<img alt="流式细胞术点图，CTL 激活，Annexin V-APC 与 7AAD 分析，效应记忆细胞。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. KaAPC 以抗原特异性方式清除 CTL。 将来自同一供体的 PKH26 标记的活化 Fas+ 效应记忆 CTL 与 PKH67 标记的 CMVpp65 特异性 CTL 按 1:1 比例混合，并与 CMVpp65KaAPC 共同培养 48 小时。对照组培养物分别用 未负载KaAPC 或 1 µg/ml 可溶性抗 Fas 单克隆抗体（克隆号 CH11）处理。在未经处理的混合 CTL 培养物（Tmix）中，存活细胞的损失极小。图中显示了 Tmix 中每种 CTL 群体的原始 FACS 数据。细胞凋亡分析如先前文献所述，通过分别设门分析两个 T 细胞群进行10。左上象限所示数值代表占总细胞的百分比。本图来自三次独立实验中的一次代表性实验。该研究最初发表于《Blood》。Schütz, C. et al. 杀伤性人工抗原呈递细胞：一种清除特异性 T 细胞的新策略。Blood. 2008; 111, 3546–52。美国血液学会版权所有。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

在过去的二十年中，人们对自身免疫性疾病的致病机制有了许多深入的认识。然而，目前最常用的治疗方法仍然依赖于皮质类固醇以及嘌呤类似物、烷化剂和钙调神经磷酸酶抑制剂等免疫抑制药物1。这些药物的使用显著改善了患者的预后，但并不能治愈潜在的免疫系统功能障碍。此外，患者因此更容易发生感染，并且患癌风险增加。
因此，治疗T细胞介导的自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应的最终目标是特异性地靶向致病性T细胞，同时保持免疫系统的其余部分不受影响，并维持其应对其他免疫相关疾病的能力。早在20世纪70年代，多个研究团队首次描述了利用抗原呈递细胞（APC）作为治疗手段来抑制外周T细胞反应。自那时起，已发展出多种基于细胞的治疗方法（详见Schütz综述）&#160;等2使用表达FasL的杀伤性APC作为免疫调节细胞的策略已显示出良好的效果，提示其在治疗自身免疫病、同种移植物排斥反应及慢性感染方面具有治疗潜力。然而，利用FasL杀伤性APC的策略仍存在显著局限性，最终限制了其临床应用：（i）APC的生成或分离过程耗时、费力且成本高昂；（ii）因免疫抑制导致血细胞减少症的患者所能提供的细胞数量有限且质量较差；（iii）通过FasL等凋亡诱导信号对APC进行包被或转导会导致表型高度变异；（iv）杀伤性APC易受T细胞细胞毒性效应功能的影响，从而降低其治疗潜力。因此，难以保证获得可重复、定义明确的杀伤性APC表型，用于抗原特异性T细胞反应的调控 体内.
基于我们先前关于表达FasL的杀伤性APC的研究3-5 以及人工抗原呈递细胞（aAPC）6,7 我们开发了一种基于微珠的方法（KaAPC），用于抗原特异性地抑制或清除自身反应性T细胞 体外KaAPC 由共价固定在直径为 4.5 μm 的顺磁性乳胶微球表面的 HLA-A2-Ig 二聚体（信号 1）和抗 Fas 单克隆抗体（诱导凋亡信号）组成。它们可通过 Fas/FasL 介导的方式，以抗原特异性、且不依赖于活化诱导的细胞死亡（AICD）通路的机制，从多种特异性的 T 细胞培养物中清除抗原特异性 T 细胞。在靶向 T 细胞中，可在处理 30 分钟后迅速诱导剂量依赖性的细胞凋亡。8.
KaAPC 可以以受控方式轻松制备，确保获得定义明确的即用型表型，并克服大多数基于细胞的耗竭策略的不足之处。因此，KaAPC 在治疗T细胞介导的自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有巨大潜力，推动了T细胞特异性治疗策略领域的发展。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450环氧磁珠</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1磁力架</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>螺口玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix管式旋转混合仪</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>抗CD95抗体（克隆CH11）</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig二聚体</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>2 ml冻存管</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgG1-PE</td><td>BD/Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgM-FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>FACS管</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

用于高效杀伤的杀手型人工抗原呈递细胞（kaapc） 体外 耗竭人抗原特异性t细胞

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

目前对T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗主要依赖于全身性免疫抑制策略，而长期使用这类方法会伴随不良副作用，例如控制感染或恶性肿瘤的能力下降。因此，需要开发新的治疗方法，能够仅靶向致病细胞，同时保持免疫系统的其余部分完整无损。在过去十年中，已开发出多种基于细胞的免疫治疗策略，用于调节T细胞介导的免疫反应。这些方法大多依赖于诱导免疫耐受的抗原呈递细胞（APC）。然而，这类基于细胞的疗法不仅技术上复杂且操作繁琐，还极易受到细胞毒性T细胞反应的影响，从而限制了其治疗潜力。本文介绍一种非细胞型杀伤性人工抗原呈递细胞（KaAPC）的制备方案，该方法可在不影响其余免疫系统功能的前提下，选择性清除致病性T细胞。KaAPC是一种细胞免疫治疗的替代方案，有望通过抗原特异性方式调控异常的T细胞反应，用于治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应。

该方案的特点在于可明确地生成一种KaAPC表型，同时表达HLA-A2-Ig（信号1）和抗Fas单克隆抗体（凋亡信号），与基于细胞的方法相比，其不受包被或转导效率的影响，且在生产过程中易于调节（图1）。此外，KaAPC 对 T 细胞的细胞毒性效应功能不敏感，其功能在自体抗原呈递细胞处理前后均不依赖于后者的质量。 体外 操作。
KaAPC 能够耗竭抗原特异性的 T 细胞 体外 当负载同源肽时，而负载非同源肽的KaAPC则不会耗竭T细胞（图2）。因此，KaAPC 以抗原特异性的方式诱导T细胞凋亡。随后，我们利用KaAPC从具有不同T细胞特异性的混合物中选择性清除抗原特异性T细胞，证明仅有极少量的细胞毒性扩散至邻近的T细胞图3因此，KaAPC 是一种用于体外特异性清除人源活化抗原特异性T细胞的精巧工具，在治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有潜在的临床应用价值。

本文介绍了杀伤性人工抗原呈递细胞（KaAPC）的制备指南，KaAPC是一种高效的工具，用于 体外 耗竭人类抗原特异性T细胞，以及在不损害其余免疫系统的前提下，以抗原特异性方式治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的细胞免疫治疗替代方案。

用于高效杀伤的杀手型人工抗原呈递细胞（KaAPC） 体外 耗竭人抗原特异性T细胞

目前对T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗主要依赖于全身性免疫抑制策略，这种策略长期使用会伴随……

本实验的总体目标是生成一种非细胞的、基于HLA IG的杀伤性人工抗原呈递细胞（K-A-A-P-C），用于清除自身反应性或不需要的T细胞群体。首先，将HLA IG分子和抗FA单克隆抗体共价连接到细胞大小的铁葡聚糖颗粒上，以生成具有功能的K-A-A-P-C。第二步，通过流式细胞术对K-A-A-P-C进行表征，以确保其功能正常。随后，将K-A-A-P-C负载不同的目标多肽，以靶向清除不需要的抗原特异性T细胞群体。最终，可通过流式细胞术分析来检测T细胞对由相应抗原负载的K-A-A-P-C介导的抗原特异性抗脂肪杀伤作用。我们最初产生该方法的想法，是在研究基于细胞的杀伤性抗原呈递细胞开发过程中遇到问题时，同时我们也在进行基于微珠平台的技术开发，用于免疫细胞调节。生成K-A-A-P-C的首要步骤是：将250 µL储存液中的环氧微珠与250 µL freshly prepared硼酸盐缓冲液加入无菌螺口玻璃小瓶中。将离心管置于磁力架上静置两分钟，使磁珠吸附，吸除缓冲液后将离心管从磁力架上取下。用另一毫升 Bore 8 缓冲液洗涤磁珠一次，随后将磁珠重悬于 550 微升 HLA A2 IG 和抗人 CD95 单克隆抗体（MAB）中。轻轻振荡离心管以混匀磁珠与抗体，随后将磁珠在 4 摄氏度下以头尾翻转旋转仪孵育 24 小时。第二天，在室温下以 300 × g 离心珠子两分钟，然后将离心管放回磁力架上。两分钟后，吸除上样缓冲液。将离心管从磁力架上取下，加入一毫升洗涤缓冲液，轻轻振荡洗涤珠子。第三次洗涤后，将小瓶在1 mL新鲜的磁珠洗涤缓冲液中旋转，以封闭任何残留的蛋白质结合位点。第二天，再次离心磁珠，并将小瓶放回磁铁上。两分钟后，吸去洗涤缓冲液。将小瓶从磁铁上取下，向KAPC中加入1毫升PBS。为检测磁珠的质量，取1.5 × 10⁵个K-A-A-P-C转移至流式管中，用1毫升流式洗涤缓冲液（fax wash buffer Resus）洗涤。将磁珠沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中，加入1微升PE标记的抗小鼠IgG1抗体以检测HLA-A2-Ig，再加入1微升TC标记的抗小鼠IgM抗体以检测抗人CD95单克隆抗体（MAB）。然后在4°C孵育15分钟，用1毫升Fax洗涤缓冲液重悬珠子。将其悬浮于250微升洗涤缓冲液中，并在流式细胞仪上检测样品的肽段加载情况。取两份各10的7次方个K-A-A-P-C细胞，转移至新的无菌玻璃小瓶中。将珠子置于磁铁上两分钟后，吸除PBS，并将珠子重悬于500微升含有5微克肽段的新鲜PBS中。在管子上标记日期及所加载肽段的名称K-A-A-P-C。随后将加载了K-A-A-P-C的样品在4摄氏度下保存至少三天，以确保肽段充分加载至HLA A2 Ig二聚体上，用于后续进行A-K-A-A-P-C体外杀伤实验。用洗涤液至少洗涤负载多肽的K-A-A-P-C六次，以去除所有游离多肽。然后将K-A-A-P-C与两份10的5次方抗原特异性T细胞以1:1的比例转移至96孔圆底培养板的每个样品孔中，每孔加入200微升共培养培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养48小时。随后将样品转移至相应的流式管中，并用1毫升Annexin V结合缓冲液洗涤。接下来，将沉淀重悬于 100 µL 的 Annexin V 结合缓冲液中，然后在室温下向样品中加入 1 µL Annexin V-FITC 和 5 µL 7-AAD，孵育 10 至 15 分钟。孵育后，用 1 mL Annexin V 结合缓冲液洗涤样品，并将沉淀重悬于 250 µL Annexin V 结合缓冲液中。随后立即使用流式细胞仪检测样品。K-A-A-P-C 可同时展示 HLA A 二聚体和抗原特异性单克隆抗体，与基于细胞的方法相比，其表达不受编码或转导效率的影响，并且在生产过程中易于调控。当负载特异性肽段时，K-A-A-P-C 能够在体外耗竭抗原特异性 T 细胞，而负载非特异性肽段的 K-A-A-P-C 则不会耗竭 T 细胞，因此 K-A-A-P-C 以抗原特异性方式诱导 T 细胞凋亡。随后，当仅使用 K-A-A-P-C 从不同特异性 T 细胞的混合物中选择性清除抗原特异性 T 细胞时，对邻近 T 细胞的细胞毒性作用极小。因此，K-A-A-P-C 成为一种极为精确的体外工具，可用于清除活化的抗原特异性人 T 细胞，在治疗自身免疫性疾病和同种异体移植物排斥反应方面具有潜在的临床应用价值。该技术的建立为细胞免疫学领域的研究人员探索 T 细胞介导的自身免疫性疾病及移植排斥反应的新治疗方法开辟了道路。

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