Name: 在小鼠大脑的各个区域端粒酶活性：非放射性端粒酶重复序列扩增法（TRAP）分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习使用非放射性TRAP分析法检测小鼠大脑各区域的端粒酶活性，比较雌雄小鼠脑组织差异。该方法高效经济，适用于神经科学与脑衰老研究。

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本工作部分得到了内盖夫技术 B.G. 和琳达·鲍尔斯贡献的支持。

动物实验已获得本-古里安大学动物实验伦理委员会的批准（IL-39-08-2010）。
1. 小鼠脑组织蛋白提取
<ol>
	<li>准备3个15 ml的离心管，每管加入5 ml林格氏液，并将离心管置于冰上。</li>
	<li>使用异氟烷麻醉（注意：需在化学通风橱中操作）处死小鼠，持续10-20秒，随后进行颈椎脱位并立即断头。</li>
	<li>从颅骨中取出脑组织，并用冰冻的林格氏液冲洗数秒，以防止脑组织受损。</li>
	<li>使用手术刀将小脑（CR）和脑干（BS）从前额皮层分离。接着将小脑与脑干分离，并从前额皮层切下额叶（FL）；去除额叶上的嗅球。将这三个脑区分别放入指定的15 ml离心管中。</li>
	<li>将每管中的组织匀浆。加入新鲜的冰冻林格氏液，使每管总体积相等，然后在800 × g条件下离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，向每管中加入100 µl CHAPS裂解缓冲液。通过21 G针头的1 ml注射器反复抽吸溶液约10次，充分混匀，冰上孵育30分钟。</li>
	<li>将每管内容物转移至新的微量离心管中，在13,000 × g条件下离心30分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，采用已建立的方法测定蛋白浓度。将蛋白提取物以10 µl分装，于-80 °C保存。</li>
</ol>
2. TRAP 检测的仪器准备、反应溶液配制及蛋白质稀释计算
<ol>
	<li>准备适当数量的已标记微型离心管，用于蛋白质提取物稀释和端粒酶反应缓冲液。在本方案的所有移液操作中均使用滤芯吸头，以防止污染。</li>
	<li>将以下溶液置于冰上解冻：TRAP 反应混合液（10x）、TS 引物、dNTPs、超纯水（UPW）以及蛋白质提取物（试剂及其浓度参见材料表）。</li>
	<li>使用超纯水（UPW）将蛋白质提取物溶液稀释至终浓度为 1 µg/µl。</li>
</ol>
3. 端粒酶反应
<ol>
	<li>在微量离心管中加入以下组分，配制端粒酶反应混合液：2 µl TRAP 混合液（10x）、1 µl TS 引物（0.1 µg）、1 µl dNTPs（10 mM）和 15 µl 超纯水（UPW）。若处理多个样品，将上述体积乘以样品数量再加1。</li>
	<li>向每个反应管中加入 19 µl 反应混合液，并向每管加入 1 µl 稀释后的蛋白提取物（含 1 µg 蛋白质），最终反应体积为 20 µl。</li>
	<li>将反应管置于预热至 30 °C 的水浴中，孵育 45 分钟。</li>
</ol>
4. PCR 反应
<ol>
	<li>在端粒酶反应结束前15分钟，解冻以下溶液：ACX引物、Titanium Taq缓冲液、UPW。</li>
	<li>在微量离心管中加入以下组分配制PCR反应混合液：2.5 µl Titanium Taq缓冲液（10x）、1 µl ACX引物（0.1 µg）、2 µl UPW（若使用内参则为1 µl）和0.5 µl Titanium Taq聚合酶（50x）。若处理多个样本，将上述体积乘以样本数加2。</li>
	<li>向每个PCR管中加入6 µl PCR混合液，并将端粒酶反应液全部（20 µl）加入各PCR管中，最终体积为26 µl。</li>
	<li>将PCR管放入PCR扩增仪中，运行以下程序： 
	- 90 °C – 2 min。 
	- 94 °C – 30 sec.* 
	- 60 °C – 30 sec.* 
	- 72 °C – 45 sec.* 
	- 72 °C – 2 min。 
	PCR产物保存于-20 °C。 
	* = 34个循环</li>
</ol>
5. 琼脂糖微型凝胶制备、样品电泳及凝胶染色
<ol>
	<li>取一个体积为缓冲液体积2-4倍的烧杯，加入25 ml预冷的电泳缓冲液（TBE）和一个搅拌子，在快速搅拌的同时缓慢撒入1.125 g高分辨率（HR）琼脂糖粉末。移除搅拌子，用塑料封口膜覆盖烧杯，并刺一个小孔用于通气。将烧杯放入微波炉中，先以&#34;低&#34;功率加热3分钟，然后切换至&#34;高&#34;功率，以短脉冲方式小心加热，避免溶液溢出。注意当加热产生的泡沫变为大气泡并在数秒内消失时，表明琼脂糖已完全溶解。</li>
	<li>将凝胶倒入水平小型凝胶装置中，待凝胶在室温下完全凝固后，于4 °C冰箱中预冷20分钟再使用。</li>
	<li>每条加样孔加入25 µl TRAP样品（含20 µl TRAP PCR产物和5 µl 6x上样染料），在4 °C冷室中以110 V恒压电泳运行3小时。</li>
	<li>配制核酸染料的3x工作液：将15 µl 10,000x核酸染料原液加入含0.1 M NaCl（0.29 g）的50 ml双蒸水（DDW）中，混匀。将凝胶置于该染色液中，轻轻振荡染色20分钟。</li>
	<li>使用波长为302 nm的紫外透射仪观察TRAP梯状DNA条带。</li>
</ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通过TRAP法分析小鼠脑组织中的端粒酶活性主要包括4个步骤：1）从脑组织特定区域提取蛋白质；2）端粒酶对TS引物进行延伸——端粒酶反应；3）通过PCR扩增端粒酶反应产物；4）利用高分辨率琼脂糖凝胶分离PCR产物。
这种改进的TRAP检测方法解决了传统检测中的两个主要难题：传统方法需要使用放射性dCTP来灵敏地检测PCR产物，以及需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离DNA梯状条带。高分辨率琼脂糖凝胶电泳相比难以操作的测序级PAGE，可更简便地检测端粒酶反应产物（即DNA梯状条带）。此外，核酸染色剂为无毒溶液，且具有高灵敏度，能够检测微量DNA。
需特别注意以下关键步骤：1）尽量缩短组织取出与匀浆之间的时间，以保持蛋白质完整性；2）避免反复冻融CHAPS裂解缓冲液；3）蛋白质提取物应分装保存，使用前仅 thaw 一次，避免样品反复冻融。
在凝胶制备步骤中可能会出现问题，因为高浓度琼脂糖凝胶在加热过程中容易溢出，需要密切注意。该技术存在若干局限性，例如必须在低温室中进行电...

端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶（TERT，端粒酶的催化亚基）和RNA组分（TERC）构成。端粒酶的经典功能是通过在端粒末端添加重复序列（TTAGGG）来维持端粒的适当长度，从而促进基因组完整性和细胞增殖1。此外，TERT在细胞中还具有其他功能，例如，它可赋予细胞抵抗多种损伤因子诱导的凋亡能力2，保护人源间充质干细胞免受氧化应激损伤3，并通过与TIA1阳性RNA颗粒结合，在完全分化的神经元中发挥促存活作用4。
TERT 主要在体细胞分裂细胞以及大多数类型的癌症中表达并具有活性，而在非分裂细胞中，该酶的表达水平和活性受到严格调控5,6。研究表明，在啮齿类动物大脑中，出生后第10天时端粒酶活性已无法检测到，而 TERT mRNA 在成年期仍维持在较低水平7。其他研究证实，成年动物的脑室下区、嗅球、海马、成年小脑和大脑皮层中存在端粒酶活性8。我们最近的研究表明，能够增强脑和脊髓中端粒酶表达和活性的新型化合物，在 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）注射小鼠模型中具有神经保护作用，可延缓 SOD1 转基因小鼠肌萎缩侧索硬化症的发病和疾病进展，并增加这些小鼠脊髓中运动神经元的存活率9。为了充分理解端粒酶在神经元和大脑中的促生存作用，有必要建立一种简单、相对灵敏且快速的检测方法，用于检测大脑不同区域的端粒酶活性。
端粒重复扩增程序（TRAP）是一种广为人知的高灵敏度检测方法，结合了端粒酶的经典活性与聚合酶链式反应（PCR）。在该检测中，端粒酶向端粒酶底物（TS引物）寡核苷酸添加TTAGGG重复序列，随后通过PCR扩增产生间隔为6个碱基对（bp）的DNA梯状条带，扩增所用反向引物为ACX。使用32P标记的dCTP来检测微量的PCR产物。DNA梯状条带通过测序级聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离。DNA条带的强度和DNA梯状条带的长度分别反映了活性酶分子的数量及其持续合成能力10。
这种传统检测方法存在一些主要困难：接触放射性物质的危险性、体积大且难以操作的测序用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）板，以及电泳运行和放射性产物胶片曝光所需的时间消耗（两种情况均需过夜）。
本方案提供了一种改进的非放射性琼脂糖微型凝胶检测方法。使用4.5%高分辨率琼脂糖凝胶分离DNA 6 bp阶梯标记物，并通过高灵敏度核酸染料实现检测。结合高分辨率琼脂糖微型凝胶与高灵敏度核酸染料，该方法操作简便，避免了放射性暴露风险，并将整个检测时间从3天显著缩短至数小时。

<table><tbody><tr><td>TRAP反应混合液（10倍浓度）</td><td></td><td></td><td>手动配制，将以下成分溶于超纯水（UPW）：630 mM KCl、200 mM Tris-HCl（pH 8.2）、10 mM EDTA、15 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1 mg/ml BSA、0.5% TWEEN（购自Sigma）。分装后于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>林格氏液</td><td></td><td></td><td>手动配制，将以下成分溶于双蒸水（DDW）：124 mM NaCl、3 mM KCl、1.25 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、2 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、26 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;、1.802 g/L 无水D-(+)-葡萄糖。</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>在通风橱中小心操作</td></tr><tr><td>dNTPs（10 mM）</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS引物（5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'）</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解</td></tr><tr><td>ACX引物（5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'）</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解</td></tr><tr><td>钛聚合酶/缓冲液（Titanium Taq Polymerase/Buffer）</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>任何高质量的高分辨率琼脂糖均可适用</td></tr><tr><td>小型凝胶电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>核酸染料（GEL-RED）</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC引物（5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3'）</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA寡核苷酸以冻干形式订购，根据所需浓度加入超纯水（UPW）溶解</td></tr><tr><td>CHAPS裂解缓冲液</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9852S</td><td>加入PMSF（蛋白酶抑制剂）至终浓度为1 mM</td></tr><tr><td>超纯水（UPW）</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1小鼠</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脑部不同区域的端粒酶活性：非放射性端粒重复扩增检测（trap）实验

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

端粒酶是一种核糖核蛋白，负责维持端粒长度，从而促进基因组完整性、细胞增殖和寿命。此外，端粒酶可保护线粒体免受氧化应激损伤，并赋予细胞抵抗凋亡的能力，提示其在神经元等非分裂但高度活跃的细胞存活中可能具有重要作用。我们先前已证明新型端粒酶激活剂能够增加小鼠大脑不同区域的端粒酶活性和表达水平，并保护运动神经元细胞免受氧化应激损伤。这些结果进一步支持端粒酶参与了神经元抵抗多种损伤的保护机制。为了阐明端粒酶在大脑中的作用，本文比较了雄性和雌性小鼠大脑中端粒酶活性的差异及其对年龄的依赖性。TRAP 法是检测各种组织或细胞系中端粒酶活性的标准方法。本文展示了通过使用 CHAPS 裂解缓冲液进行非变性蛋白提取，继而对标准 TRAP 法进行改良，用于分析小鼠大脑三个区域中端粒酶活性的方法。
在此两步法检测中，内源性端粒酶通过添加TTAGGG六碱基对重复序列（端粒酶反应）来延长特定的端粒酶底物（TS引物）。端粒酶反应产物通过PCR扩增，形成以6 bp为增量的DNA梯状条带。通过4.5%高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离DNA梯状条带，随后使用高灵敏度核酸染料染色进行分析。
与传统的TRAP检测方法相比，本方案采用非毒性且节省时间的TRAP检测法来评估小鼠脑组织中的端粒酶活性。传统TRAP检测使用32P标记的放射性dCTP进行DNA检测，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳解析DNA梯状条带，而本方法能够检测雌性和雄性小鼠不同脑区中端粒酶活性的差异。

采用改良型TRAP检测法和放射性TRAP检测法时，分别从3只1月龄和3只3月龄的CD-1雌性小鼠及3只1月龄和3只3月龄的CD-1雄性小鼠的额叶（FL）、脑干（BS）和小脑（CR）组织中制备全细胞蛋白提取物；而用于放射性TRAP检测法的样本则来自3只2月龄的CD-1雄性小鼠。使用改良型TRAP检测法在1 µg蛋白提取物中检测端粒酶活性，而放射性TRAP检测法则使用2 µg蛋白提取物。通过放射性TRAP检测法与改良型TRAP检测法对端粒酶活性的检测结果表明，改良型检测法在端粒酶DNA产物的可视化效果和分辨率方面更优，这可通过DNA梯状条带的长度和强度得以体现（图1A 与 1C 和 1D 对比）。当逐步降低来源于胶质母细胞瘤U-251细胞系的蛋白提取物浓度时，可观察到端粒酶DNA产物呈渐进性减少，提示改良型TRAP检测法在较低蛋白提取物浓度下仍具有较高的端粒酶活性检测灵敏度（图1B）。
在3月龄雌性和雄性小鼠中，FL和BS区域的端粒酶...

端粒酶在新生小鼠脑组织以及成年小鼠脑的特定区域均有表达。本文介绍一种无毒且节省时间的TRAP检测法，用于分析小鼠脑不同区域的端粒酶活性，并检测雄性和雌性小鼠脑之间端粒酶活性的差异。

小鼠脑部不同区域的端粒酶活性：非放射性端粒重复扩增检测（TRAP）实验

端粒酶是一种核糖核蛋白，负责维持端粒长度，从而促进基因组完整性、细胞增殖和……

本实验的总体目标是测定正常脑组织中的端粒酶活性。首先，从不同脑组织中制备全细胞蛋白提取物，作为活性端粒酶的来源。第二步是将等量的蛋白提取物加入含有端粒酶活性所需底物和核苷酸的特异性端粒酶反应体系中。接下来，通过 PCR 扩增端粒酶反应产物，并利用高分辨率琼脂糖凝胶电泳进行分析。最后一步是通过使用高灵敏度的 DNA 染色剂对琼脂糖凝胶染色，以可视化扩增后的端粒酶反应产物。该端粒重复扩增检测（TRAP）方案的最终结果表现为六碱基对递增的 DNA 梯状条带，对应于不同脑组织中的端粒酶活性。与现有的方法（如放射性 TRAP 检测或商业化的 TRAP 检测试剂盒）相比，该技术的主要优势在于本方案提供了一种相对节省时间和成本的替代方法。尽管该方法可用于研究脑组织中的thous活性，但也可应用于任何其他活体组织或细胞培养。在开始此操作之前，准备三个15毫升离心管，每管含有5毫升任氏液。在从小鼠体内取出脑组织后，立即将离心管置于冰上。用冰冷的任氏液冲洗脑组织数秒钟，以防止脑组织受损。使用手术刀将小脑和脑干与额叶皮层分离。接着，将小脑与脑干分离。去除额叶的嗅球，并将额叶从额叶皮层上分离。将三个脑区分别放入指定的15毫升离心管中，对每管中的组织进行匀浆。接着，加入预冷的冰镇林格氏液，使每管液体体积相等，于800 ×g离心7分钟，弃去上清液，加入100 µL的CHAPS裂解液。向每管中加入缓冲液。用1毫升注射器将溶液反复吹打约10次以充分混匀，冰上孵育30分钟。30分钟后，将每管中的内容物转移至新的微量离心管中，离心30分钟。在13,000 × g条件下离心，将上清液转移至新的微量离心管中。使用先前建立的方法测定蛋白浓度后，将蛋白提取物以10 µL为一份分装，并于-80 °C保存。在冰上准备适量的已标记微量离心管，用于后续蛋白提取物的稀释以及端粒酶反应缓冲液的配制，由此开始本实验步骤。10 × TRAP反应混合液包含DS引物、dNTPs、超纯水和蛋白提取物，将蛋白提取物溶液稀释至终浓度为每微升1微克。使用超纯水进行所有移液操作，并使用滤芯吸头以防止污染或端粒酶反应受到干扰。每个样本所需的端粒酶反应混合液包括2微升TRAP Mix、1微升TS引物、1微升dNTPs以及15微升超纯水；多个样本可按比例配制。将这些体积乘以样本数加一，然后向每根反应管中加入19微升MASE反应混合液，再加入1微升稀释后的蛋白质提取物。为达到20微升的终体积，将反应管置于30摄氏度预热的水浴中孵育45分钟。在三重反应结束前15分钟，准备扩增三重反应产物，方法是准备好以下溶液：CX引物、钛烫缓冲液和超纯水。每个样品需要的PCR反应混合液包含2.5 µL的Titanium Tech缓冲液、1 µL的CX引物、2 µL的超纯水以及0.5 µL的Titanium Tech聚合酶（适用于多个样品）。将上述体积乘以样品数量再加2。向每个PCR管中加入6 µL的PCR反应混合液，并将含有Mase反应的全部体积加入每根PCR管中。最终体积为26微升时，将PCR管放入PCR扩增仪中，运行以下程序：90摄氏度2分钟，随后进行34个循环：94摄氏度30秒，60摄氏度30秒，72摄氏度45秒，最后在72摄氏度下延伸2分钟。PCR 反应完成后，将 PCR 产物于 -20 摄氏度保存。为准备制备微型凝胶用的胶液，首先向一个体积为缓冲液体积 2 至 4 倍的烧杯中加入 25 毫升预冷的 TBE 电泳缓冲液和一个搅拌子，并开始搅拌。然后缓慢撒入 1.125 克高分辨率琼脂糖粉末。在溶液快速搅拌的同时，取出磁力搅拌子。用塑料薄膜盖住烧杯，并戳一个小孔用于通风。加热琼脂糖时，必须达到沸点，以确保琼脂糖完全溶解。务必全程密切关注微波炉中的烧杯，确保产生的泡沫不会溢出。先将烧杯以低功率在微波炉中加热三分钟，随后调至高功率，采用短时脉冲方式加热溶液，并小心操作以避免溢出。将凝胶倒入水平小型凝胶装置中，在室温下静置使其凝固。待凝胶完全凝固后，于4°C条件下继续冷却20分钟。在用于电泳前，每条泳道加入 25 微升捕获样品，在 4 摄氏度冷室中以 110 伏电压运行 3 小时，同时进行凝胶电泳。通过将 15 微升 10,000 倍核酸染料原液加入含 0.1 摩尔氯化钠的 50 毫升双蒸水中，配制 3 倍核酸染料工作液。样品电泳完成后，在室温下轻轻振荡染色 20 分钟。最后，使用波长为 302 纳米的紫外透射仪观察。通过传统的和改良的 TRAP 检测法，在小鼠脑部区域检测到了端粒酶活性。改良法在端粒酶 DNA 产物的可视化和分辨率方面更优，表现为 DNA 梯形条带的长度和强度更为明显。在改良的TRAP检测中，随着蛋白提取物浓度的降低，端粒DNA产物呈逐渐减少的趋势，表明该方法在较低蛋白浓度下仍具有检测端粒酶活性的敏感性。通过改良检测法对一月龄雌雄小鼠三个脑区的端粒酶活性进行检测，结果显示无显著差异。然而，在三月龄小鼠中，前额叶和脑干的端粒酶活性高于小脑，这可通过DNA条带的强度以及DNA产物梯形长度来判断。在小鼠向成年过渡的过程中，前额叶的端粒酶活性升高，而脑干和小脑的端粒酶活性则下降。一些端粒活性在女性的额叶中也表现出更高水平，而男性的脑干和小脑中端粒活性则相对较高。一旦掌握，该技术若操作得当，可在六到七小时内完成。观看本视频后，您应能够很好地理解如何轻松测定您所选组织中的端粒活性。

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

科研

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Neuroscience

神经科学

在小鼠大脑的各个区域端粒酶活性：非放射性端粒酶重复序列扩增法（TRAP）分析

EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI...

高灵敏度检测Balb/C小鼠脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶

本文描述了一种准确、快速、精密且低成本的方法，利用qRT-PCR技术在多种组织和物种中检测端粒长度。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度检测的互补性基础实验。...

端粒长度与端粒酶活性：细胞衰老的阴阳平衡

我们描述了对新生小鼠进行标记和基因分型以及从中建立原代神经元培养物的实验步骤。该基因分型方法快速、高效且可靠，可实现核酸的自动化提取。这对于新生期致死的小鼠及其培养物尤其重要，因为这些实验要求在培养前完成基因分型。...

动物快速基因分型及脑神经元原代培养的建立

端粒和端粒酶在衰老和肿瘤发生中发挥着关键作用。本实验方案的目标是展示如何构建两种可诱导的小鼠端粒酶敲入等位基因，并说明如何利用这些模型研究组织退化/再生以及癌症。...

利用小鼠可诱导端粒酶等位基因研究组织退变/再生与癌症

RNA 原位 杂交（ISH）能够实现对细胞和组织中RNA的可视化。本文展示了如何将RNAscope...

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位 杂交

人端粒酶逆转录酶（TERT）不仅可合成端粒DNA，还可通过依赖RNA的RNA聚合酶活性合成双链RNA。本文介绍了一种新建立的检测内源性TERT依赖RNA的RNA聚合酶活性的实验方法。...

人端粒酶逆转录酶蛋白依赖RNA的RNA聚合酶活性的半定量检测

本文介绍一种在单个亚端粒区域插入MS2序列标签以生成癌细胞克隆的实验方案。该方法基于MS2-GFP系统，可在活细胞中实现对单个端粒来源的端粒重复序列包含RNA（TERRA）内源性转录本的可视化观察。...

通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

本文介绍了一种建立具有非随机X染色体失活的可存活雌性小鼠模型的方案，即在100%的细胞中母源遗传的X染色体处于失活状态。我们还介绍了一种在体内检测药物诱导失活X染色体重新激活的可行性、耐受性和安全性的实验方案。...

一种用于药物再激活X染色体上沉默Mecp2基因的非随机小鼠模型

我们成功将标准的端粒重复扩增方案（TRAP）检测改造为可用于微滴数字聚合酶链式反应。这种新检测方法称为ddTRAP，具有更高的灵敏度和定量能力，可更有效地检测多种人类细胞中的端粒酶活性，并进行更可靠的统计分析。...

液滴数字TRAP（ddTRAP）：端粒重复扩增实验方案在液滴数字聚合酶链式反应中的应用

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

学习使用非放射性TRAP分析法检测小鼠大脑各区域的端粒酶活性，比较雌雄小鼠脑组织差异。该方法高效经济，适用于神经科学与脑衰老研究。

小鼠脑部不同区域的端粒酶活性：非放射性端粒重复扩增检测（TRAP）实验

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