平地板的空气解禁平台：一种新方法与显微镜或电对清醒结合行为自由移动鼠害

大家好，我是赫尔辛基大学近科学中心的研究生 Hel Lin。今天，我和我的同事将向您展示如何在清醒的头部固定中进行光学和电生理记录，但其他情况下可以自由移动和行为的动物。我们的方法为鼠标创造了一个有形的、熟悉的环境来导航和探索。

在需要牢固固定动物头部的显微成像或单细胞电生理记录期间，我们植入了一个慢性颅窗，并使小鼠习惯于一个空运的移动房屋笼子，该笼子在动物的脚下滑动。在平坦表面上运动时，可以将移动房屋笼子放置在标准正置显微镜下进行双光子成像，或放置在用于唤醒小鼠大脑中膜片钳记录的电生理学设置中。此处介绍的所有实验程序均已获得当地伦理委员会的批准。

我们根据已发布的方案植入颅窗，并在颅窗植入后进行微小的修改。在此恢复期内，允许动物恢复至少两到三周，窗口通常会恢复其透明度。具有任何残留术后炎症迹象的动物被排除在实验之外。

训练被选中进行研究的动物，使它们习惯于头部固定。在移动房屋笼中，冷静地处理鼠标 5 到 10 分钟，避免突然的移动和噪音，然后将其放回家笼中。以不等的间隔重复该过程 2 或 3 次。

移动房屋笼子允许在头部固定之前无需麻醉动物即可进行头部固定。用抹布以不等的间隔将鼠标包裹两到三次。确保动物在包裹时保持冷静。

否则，请重复该过程，直到鼠标完全习惯为止。处理完成后的第二天开始对移动房屋笼上的小鼠进行每日两次训练。在每次训练前为动物称重。

体重减轻超过 10% 的动物应被排除在研究之外。调整头部固定臂的位置以匹配受过训练的动物的大小。将移动房屋笼式设备的进气口连接到标准的实验室加压出风口。

确保气压足以使气升的家笼自由漂浮。开始在移动房屋笼子中训练习惯动物。将鼠标包裹在抹布中，使其固定。

将连接到动物头部的金属支架插入头部固定臂，并通过拧紧螺钉将其牢固固定。打开气流，使空运的家笼悬浮。取下抹布，让老鼠探索家笼。

在第一次训练期间，小鼠可能会表现出冻结和颤抖的行为以及尾巴勃起。为了使动物适应噪音，请在所有训练课程和实验期间使用无线电翻译或录制的音乐和语音等方式持续暴露在环境声音中。为避免慢性压力，请在训练的第一个小时使用强光照明。

第一个小时后，在黑暗中进行训练，并使用近红外摄像头监控动物的行为。训练完成后，松开螺丝，将动物从头部固定臂上松开。在下一次训练之前，将动物放回笼子至少两个小时。

将鼠标与两只或更多其他老鼠一起关在笼子里会降低压力水平。或者，您可以将空运的笼子与动物一起放在其家笼中。这将丰富环境，并可能加强动物对移动房屋笼子的居住。

在最后一次训练期间，小鼠习惯于头部固定，并且应该表现出无压力的行为，在空运的家笼周围平静地导航。在没有可见光的情况下，可以通过使用近红外相机或光学计算机鼠标监测笼子的运动来跟踪鼠标的运动轨迹。在持续超过一两个小时的长时间训练期间，请考虑手动或使用连接到移动房屋笼架的移液管架为鼠标提供饮用水。

下图总结了典型实验研究的时间表。该研究从小鼠处理前两周植入颅窗开始，并继续进行八次每日两次的训练课程。典型的研究包括许多成像会话或膜片钳记录会话，间隔数小时到数天或数周。

光学和电生理实验可以与认知或行为刺激和读数同时进行。双光子显微镜是一种独特的非线性光学技术，可以实时观察啮齿动物大脑深层皮层中的细胞甚至亚细胞结构。要进行双光子显微成像实验，请将训练有素的动物放在移动房屋笼子中，调整塞子以保护显微镜光学元件免受意外损坏。

清洁颅窗的盖玻片以去除灰尘颗粒。将浸入液滴在盖玻片上。我们建议使用内脏溶液，因为水分会迅速蒸发。

该平台可以使用荧光显微镜的宽视场模式和长通发射滤光片放置在典型的电动光学平台顶部。评估脑脉管系统并选择感兴趣的区域。为了成像皮质脉管系统注射到头部固定和固定的动物的尾静脉中，一个 70 公斤的德克萨斯州道尔顿红色共轭文本 Tran。

该图像序列显示了行为小鼠在移动房屋笼子周围导航时大脑皮层中场所和动脉的延时记录。通过绘制横跨血管管腔的线条轮廓，可以测量血管直径的变化和各个血管段的运动。动脉和静脉中的血流速率可以通过沿着平行于血管壁绘制的线扫描来测量。好。

台湾启动子下的神经元亚群中表达 YFP 的转基因小鼠中可以看到神经元形态的细节。这两个 Zacks 比较了麻醉动物和清醒动物之间的成像稳定性。右侧面板显示了用氯胺酮甲苯噻嗪混合物麻醉的动物的树突。

而左侧面板显示了一只清醒的动物在移动房屋笼子周围行走的树突图像。清醒动物的个体脊柱形态可以以与麻醉小鼠相同的可靠性和精度进行分析。动物奔跑过程中大脑的位移通常不超过一到一微米半。

这些运动发生在水平方向上，很少导致成像平面的偏移，因此不需要校正运动伪影。在大多数情况下，长期监测清醒活体大脑中神经元活动的能力对于了解神经系统的组织和功能至关重要。使用 tie 1 G Camp 3 转基因小鼠，我们对在移动房屋笼中行为的清醒小鼠的自发神经元活动进行成像。

该延时图像序列显示了神经元细胞体、虱卵和轴突中钙峰值的代表性示例。基于本征信号的光学成像允许绘制功能域的空间分布，以执行本征光学成像实验。将训练有素的动物放在位于相机物镜下方的家笼中。

清洁盖玻片上的灰尘。滴一滴甘油，并用 5 毫米的圆形盖玻片盖住。调整高速摄像机的位置。

将带有吹气管的机械手放在对侧振动器的对面。使用绿灯对船舶地图进行成像。聚焦于皮层更深处，皮质血管下方约 400 微米处。

在相机前放置带通滤光片，并用红光照亮皮层。让鼠标适应平台至少 30 分钟。记录 6 分钟剧集中的基准活动。

每 10 秒用气吹刺激一次 vibra，总时长为 6 分钟。该图像显示了神经活动沿体感皮层传播，以响应频率为 0.05 赫兹的振动刺激。要进行单细胞电生理记录，请将植入倒颅窗的训练有素的动物放入移动房屋笼中。

缓慢而小心地从金属支架上取下盖玻片。刷新皮质缓冲液并用止血卫生棉条清洁颅窗上的碎屑。将接地电极放入皮质缓冲液中。

用细胞内溶液填充膜片钳移液器。使用电动微型机械手对记录移液器施加正压，将移液器加深到皮层中，并获得与感兴趣细胞的千兆密封接触。记录后，取出移液器，刷新皮质缓冲液，然后将盖玻片中的胶水粘在金属支架上关闭颅窗。

使用空运的家笼可以将成像和电生理学与经典行为范式（如学习、康复或焦虑相关行为）相结合。嗅觉是小鼠的重要感觉输入，可用于记忆测试中的刺激，以及评估对新奇事物的反应。要进行习惯性嗅觉测试，请将受过训练的动物放在移动房屋笼子中并让它收养。

使用双面胶带将一块浸泡在自来水中的干净棉花粘在移动房屋笼子的内壁上 30 分钟。五分钟后，将家笼壁上的干净棉花换成浸泡在含有香草气味的液体中的新棉花。重复 5 分钟的香草气味暴露 3 次，两次间隔 5 分钟。

测量对气味的兴趣程度。计算动物面向目标区域所花费的累积时间和移动房屋笼子的总时间。在最后的第五次会议中，呈现一种具有社会意义的气味。

用几滴异性小鼠的尿液润湿新的棉花涂抹器。为了评估对新奇事物的反应，将移动房屋笼子分为四个区域。将两块棉布相对连接。颜色。

在第一次试验期间，用家笼壁外侧的标记对它们进行编码。放置两块干净的棉布。然后用浸泡在 1% 香草提取物中的棉花替换它们。

在第三次试验中，将香草棉放在第一区，将浸泡在 1% 香蕉提取物中的棉花放到该区。第二，衡量对无气味的偏好。计算动物面对无气味所花费的时间占面对其他区域的累积时间的百分比。

大家好，我是赫尔辛基大学神经科学中心（Neuroscience Center of Helsinki）的首席研究员Leo Kiro。我希望您喜欢观看该视频并发现它很有用。在过去的五年里，我们一直在研究体内显微镜的双重作用，一般和美学的使用一直是一个非常令人担忧的问题，因为美学会干扰大脑功能、血液流动和一切。

今天，我很高兴我们可以在清醒的动物中工作，进行稳定的显微成像实验，并验证和验证我们之前在麻醉动物中获得的结果。我确信，使用移动房屋笼和我们今天介绍的方法将增加体内研究的总体相关性，并将导致新的突破性结果，我很期待。