Name: 订货单细胞和单胚胎的三维约束：高内涵筛选新设备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 了解利用PDMS微腔阵列技术对哺乳动物细胞进行三维约束培养的方法，观察细胞器形态与动态变化。该技术可减少实验变异性，适用于高内涵药物筛选和细胞生物学研究。

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我们感谢 L. Brino（法国伊尔基希IGBMC高通量筛选平台）提供抗Giantin抗体，M. Labouesse 实验室（IGBMC）提供 C. elegans，B. Séraphin 实验室（IGBMC）提供芽殖酵母，E. Paluch 和 A. Hyman（德国德累斯顿MPI-CBG）提供荧光标记的HeLa细胞，J. Moseley（达特茅斯医学院）和 J.Q. Wu（俄亥俄州立大学）提供裂殖酵母细胞；感谢 A. Hoël 和 F. Evenou 提供实验协助，C. Rick（法国斯特拉斯堡IBMC）提供技术帮助，以及 J.C. Jeannot（法国Femto-st）在微加工方面的协助。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、斯特拉斯堡大学、Conectus、法国医学研究基金会以及斯特拉斯堡ci-FRC的资金支持。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

采用复制模塑技术制备“蛋杯”结构。该 fabrication 过程无需洁净室环境，操作简便，但可能需要一定的实践经验。其中，脱模步骤是获得大面积高质量“蛋杯”的最关键环节，因此需特别谨慎操作。若反复出现脱模失败，建议优化等离子清洗仪在硅烷化及等离子键合前的参数。硅烷化不充分会导致印章与 PDMS 薄膜之间粘连过强。若观察到此现象，应延长硅烷化试剂孵育时间。&#160;可增加试剂用量。需注意，还可采用其他技术与材料制备“蛋杯”结构，并可利用多种配体（纤连蛋白、明胶、胶原蛋白）对其进行功能化修饰。 等等。）。特别是，可使用定制的热压印技术在聚苯乙烯材料上轻松制备微腔结构，从而确保生物相容性，并能与标准培养皿中获得的结果进行直接比较。同样，为优化填充率，需要特别注意操作细节并积累实践经验。其中，清洗步骤尤为关键，需确保微腔适当填充，同时避免细胞过量，以免增加信号的噪声和背景干扰。若细胞容易从微腔中脱落，可考虑调整微腔的尺寸或深度。
“蛋杯”结构通过简单的操作流程为细胞提供类似三维的培养环境，并适用于高内涵筛选分析。通过将单个细胞置入独立的微腔（“蛋杯”）中，可轻松观察在...

当前 体外 基于细胞的检测通常采用二维（2D）培养方式。这种培养条件对于哺乳动物细胞而言并非自然状态，因此不具有生理相关性。 1细胞表现出多样化的形态、大小以及异质性的表型。当应用于筛选实验时，这些方法存在额外的严重局限性，例如细胞在平面内分布无序，以及细胞器表型异常（尤其是应力纤维）。这一问题在用于药物测试的临床试验中尤为突出，每年需投入巨额资金。然而，大多数药物在早期药物筛选阶段采用人工的二维培养条件，导致其在后续动物模型实验中失败。此外，使用此类方法无法清晰观察特定的细胞器结构，例如细胞有丝分裂过程中的收缩环（actomyosin ring），以及通常位于观察平面垂直方向上动态变化的其他结构。为克服上述缺陷，已提出一些新型二维检测方法，并由此获得了关于细胞骨架组织的重要发现。 2,3然而，这些检测仍存在一个严重局限性：细胞表现出明显的铺展表型，与实际观察到的情况截然不同 在体内，其中细胞呈现三维结构。这些与培养方法相关的假象可能引发非生理性的特征，例如应力纤维增强 1,4,5.
与二维环境相比，三维细胞培养实验具有多种优势6,7。其生理相关性更高，因此实验结果更具意义。例如，包埋在水凝胶中的细胞可形成类似三维的结构，但其形态在不同细胞之间存在差异8,9。然而，由于细胞形态各不相同，这给筛选应用带来了困难。另一种策略是将单个细胞嵌入微加工制备的微腔中10,11。此时，细胞的位置、形状、极性以及细胞内结构可实现标准化。微腔不仅能为细胞提供类似三维的结构，还适用于高内涵筛选研究10,12-14；可将单个细胞有序排列成微阵列，从而并行观察细胞器及其动态变化。这种规律性使得仅用较少数量的细胞即可获得良好的统计学结果，并提高时间和空间分辨率。有效化合物&#160;更易于被可靠地识别。
本研究展示了用于高内涵筛选应用的一种新型类三维单细胞培养系统的构建与应用10,12,13。该装置由弹性体微腔阵列（105 个腔体/cm2）组成，被称为“卵杯”（EC）。本研究中 EC 的尺寸和总体积已优化至接近细胞分裂期间单个 NIH3T3 和 HeLa 细胞的典型体积。微腔的形态（圆柱形）经过选择，以适当地调控细胞形状，便于对动态过程进行观察。采用复制模塑技术将 EC 阵列加工到粘附于玻璃盖玻片上的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上15,16。细胞通过离心方式引入 EC 中。本文报道了在三维环境（EC）中细胞器（如肌动蛋白应力纤维、高尔基体和细胞核）的观察结果及其形态标准化，并与相同细胞在二维（平面）表面上的表现进行了比较。我们还报道了对细胞有丝分裂过程中收缩环（由肌动蛋白-肌球蛋白构成）闭合等动态活性过程的观察结果17。最后，我们展示了该方法在其他具有刚性细胞壁的体系中的应用结果，包括芽殖酵母、裂殖酵母和C. elegans胚胎，证实了本方法适用于多种模式生物系统。
接下来，我们将提供一个详细而全面的实验方案，用于制备和应用“卵杯”进行三维微加工。我们的方法简便，无需洁净室环境。我们预计，这一新方法将在药物筛选实验和个性化医疗中具有重要意义，可作为替代&#160;培养皿的新选择。最后，我们的装置将有助于研究细胞对外界刺激响应的分布情况，例如在癌症18&#160;或基础研究19中的应用。

<table><tbody><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0（超纯）</td><td>Millipore</td><td>-</td><td>始终使用新鲜的水。</td></tr><tr><td>Parafilm（塑料薄膜）</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>使用少量水滴将Parafilm粘附于实验台表面，并确保其完全平整。</td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>Selba</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.selba.ch/&quot; 名称=&quot;RANGE!D4&quot;&gt;http://www.selba.ch&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>硅片</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.siltronix.com/&quot;&gt;http://www.siltronix.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>2000系列</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&quot;&gt;http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>必须在通风橱中操作；更多信息请查阅制造商提供的数据表。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&quot;&gt;http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>须在通风橱中操作；更多信息请参阅制造商提供的数据表</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=zh&amp;&region=CA&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp;&region=CA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>可从多家公司获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote（硅化试剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;&region=FR&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;&region=FR&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>有害，必须在通风橱中操作；更多信息请参阅制造商提供的数据表。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯三甲基硅烷（TMCS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&amp;&region=FR&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS 可引起急性吸入和皮肤毒性，且高度易燃（点火回火可在较远距离发生），因此应在远离火源的通风橱中使用</td></tr><tr><td>腈手套</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m&quot;&gt;http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>可从多家公司获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 #0</td><td>克尼特尔玻璃</td><td>KN00010022593</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.knittelglass.com/index_e.htm&quot;&gt;http://www.knittelglass.com/index_e.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>非常脆弱，请轻柔操作。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尖头直镊子</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>可从多家公司获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184 试剂盒</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>包装包含PDMS基础剂和固化剂。类似的弹性体可从多家公司获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dutscher.com/frontoffice/search&quot;&gt;http://www.dutscher.com/frontoffice/search&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>可从多家公司获得。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&amp;&keyWord=41965-039&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&quot;&gt;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&amp;&keyWord=41965-039&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>牛犊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;&region=CA&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;&region=CA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&quot;&gt;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;amp;store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&amp;storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&quot;&gt;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS 为 10 倍浓缩液，需使用 ddH₂O 稀释至 1x&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&quot;&gt;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=PROD&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>无 CO₂ 环境培养基&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 对照</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;F1141-5MG&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&焦点=产品&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;amp;term=F1141-5MG&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;amp;N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>青霉素 &amp;& 链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=CHEM&quot;&gt;http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp;&store=Scientific&amp;&nav=0&amp;&offSet=0&amp;&storeId=10652&amp;&langId=-1&amp;&fromSearchPage=1&amp;&searchType=CHEM&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P35 培养皿</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.greinerbioone.com/&quot;&gt;http://www.greinerbioone.com/zh/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P60 培养皿</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.greinerbioone.com/&quot;&gt;http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>P94 培养皿</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.greinerbioone.com/&quot;&gt;http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>3% 多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp;amp;region=FR&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp;&region=FR&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>对眼睛有害，必须在通风橱内操作；更多信息请查阅制造商提供的数据表。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;&term=93443-100ML&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;amp;term=93443-100ML&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;amp;mode=match%20partialmax&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-绿色荧光Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>将粉末溶于1.5 ml甲醇中</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>PBS 1x 中 1:200 稀释</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 Giantin 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>PBS 1x 中 1:500 稀释</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&quot;&gt;http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 anillin 抗体</td><td>由 M. Glotzer 提供，发表于 Piekny, A. J. &amp;安尼林是一种在胞质分裂过程中连接 RhoA、肌动蛋白和肌球蛋白的支架蛋白。《当代生物学》18, 30&amp;ndash;6 (2008).</td><td></td><td>PBS 1x 中 1:500 稀释</td></tr><tr><td>抗磷酸酪氨酸</td><td>转导实验室</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3山羊抗兔&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究所</td><td>111-166-047</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&quot;&gt;http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>1:1,000 稀释于 1× PBS 中</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp;&region=FR&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp;&region=FR&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>1 mg/ml，1 分钟</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;&term=G2025&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;&term=G2025&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;amp;mode=match%20partialmax&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;amp;term=M8410-500ML&amp;&lang=zh&amp;amp;region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;amp;term=M8410-500ML&amp;&lang=zh&amp;&region=CA&amp;&focus=product&amp;&N=0+220003048+219853082+219853286&amp;&mode=match%20partialmax&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>-</td><td>-</td><td>哺乳动物细胞可从多家公司获得。另请参见 &lt;strong&gt;表 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NIH3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>-</td><td>哺乳动物细胞可从多家公司获得。另请参见 &lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>裂殖酵母&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>有关菌株的详细信息，请联系通讯作者。&amp;nbsp; 参见 &lt;strong&gt;表 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 线虫</td><td>-</td><td>-</td><td>详情请与通讯作者联系。&amp;nbsp; 另请参见 &lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>YES（琼脂）+ 5 种附加补充剂</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp;和&s=搜索&quot;&gt;http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp;和&s=搜索&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>准备：按照以下步骤进行&amp;nbsp; 按照包装盒上的说明进行操作</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>YES（培养基）+ 5 种添加物（补剂）</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp;和&s=搜索&quot;&gt;http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp;和&s=搜索&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>准备时：按照包装盒上的说明进行操作</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM（培养基）</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp;和&s=搜索&quot;&gt;http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp;和；s=搜索&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>准备：按照以下步骤进行&amp;nbsp; 按照包装盒上提供的说明进行操作</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>过滤除菌 EMM 培养基（培养基）——仅用于成像</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>准备时：按照包装盒上的说明进行操作。使用 0.22 &amp;micro;使用 m 滤器过滤代替高压灭菌。这种方法可提高培养基的透明度，并降低自发荧光。</td></tr><tr><td>补充剂（用于EMM）</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp;amp；s=搜索&quot;&gt;http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp;和&s=搜索&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;（在高压灭菌或过滤前，将225 mg/L加入EMM培养基中）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup 和 Steritop 真空驱动无菌滤器</td><td>Millipore</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp;&tab1=2&amp;amp;tab2=1#tab2=1:tab1=2&quot;&gt;http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp;&tab1=2&amp;&tab2=1#tab2=1:tab1=2&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

生物细胞通常在平坦（二维）表面上进行观察。这种条件并不符合生理状态，且表型和形态具有高度变异性。因此，基于此类环境中的细胞进行的筛选存在严重局限性：细胞器表现出极端表型，细胞形态和大小具有异质性，和/或特定细胞器无法被清晰可视化。此外，体内（in vivo）的细胞位于三维环境中；在此情况下，细胞表现出不同的表型，主要归因于其与周围组织细胞外基质的相互作用。为了在与生理相关的三维环境中标准化并建立单细胞的有序排列，以用于基于细胞的检测，本文报道了一种用于体外（in vitro）三维细胞培养的装置的微加工及其应用。该装置由微腔的二维阵列（通常为105 个微腔/cm2）构成，每个微腔中填充单个细胞或胚胎。细胞的位置、形状、极性及内部组织结构由此得以标准化，呈现出三维结构。我们采用复制模塑技术，在附着于盖玻片的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上构建出微腔阵列（“蛋杯”状结构）。微腔表面涂覆纤连蛋白以促进细胞黏附。细胞通过离心方式插入。每种系统的填充率均经过优化，最高可达80%。细胞和胚胎的存活率已得到验证。我们将该方法应用于细胞器（如细胞核和高尔基体）的可视化，并用于研究细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合等活跃过程。该装置有助于识别新特征，例如在胞质分裂环闭合期间肌球蛋白和肌动蛋白的周期性聚集与不均匀分布，以及高尔基体与细胞核排列的紧凑表型。我们针对哺乳动物细胞、裂殖酵母、芽殖酵母和秀丽隐杆线虫（C. elegans）对该方法进行了表征，并在每种情况下进行了特定优化。最后，该装置的特性使其在药物筛选检测和个体化医学中具有特别重要的应用前景。

“蛋杯”（EC）是一种新型的高内涵筛选方法，可在三维环境中实现对定向细胞和胚胎的可视化观察。此外，一些在标准二维（平面）培养中难以观察到的细胞过程，也可通过这一新方法进行观察。图1a展示了EC微加工流程的概要（参见上述方案中的第1部分）。该方法简单、快速、高效，且无需特殊设备。图1b和图1c分别为“蛋杯”的大尺度图像及其放大的扫描电子显微镜图像。如图所示，其形状和尺寸非常规整。该方法具有高度灵活性，可轻松制备不同形状和尺寸的结构，并适用于不同的模式系统。“蛋杯”的尺寸选择依据如下：在二维表面上测量进行分裂的细胞的尺寸，这些细胞呈球形，其直径被作为确定EC直径的良好参考指标。例如，细胞在“蛋杯”中会沿其长轴伸长并定向排列进行细胞分裂。该尺寸取决于具体的系统——即细胞和胚胎类型，因此需针对每种情况分别评估。
图2展示了所需的材料（图2a）以及使用“蛋杯”（‘eggcups’）的逐步操作流程（图2b</s...

我们报道了一种用于研究细胞和胚胎的装置及新方法。单个细胞被精确地排列在微腔阵列中。这种三维限制更接近生理条件下的三维环境，有助于细胞器的定向排列。通过控制细胞形态，该装置可最大限度地减少标准检测中常见的变异性。

生物细胞通常在平坦（2D）表面进行观察。这种条件并不符合生理状态，细胞表型和形态具有高度变异性。基于此类环境中的细胞所开展的筛选因此存在严重局限性：细胞器呈现极端表型，细胞形态和大小具有异质性，和/或特定细胞器无法被清晰可视化。此外，体内细胞处于三维（3D）环境中；在此情况下，细胞表现出不同的表型，主要归因于其与周围组织细胞外基质的相互作用。为了在与生理相关的三维环境中对单细胞进行标准化并建立有序排列，以用于基于细胞的检测，本文报道了一种用于体外三维细胞培养的装置的微加工制备及其应用。该装置由二维排列的微腔阵列（通常为105个腔/cm²）组成，每个微腔容纳单个细胞或胚胎。细胞的位置、形状、极性及内部结构由此得以标准化，呈现出三维结构特征。我们采用复制模塑技术，在贴附于盖玻片的薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）上制备出微腔阵列，即“卵杯”结构。微腔表面包被纤连蛋白以促进细胞黏附。细胞通过离心方式插入。针对不同体系优化了填充率，最高可达80%。细胞和胚胎的存活率已得到验证。本方法已应用于细胞器（如细胞核和高尔基体）的可视化，以及活跃细胞过程（如细胞有丝分裂过程中胞质分裂环的闭合）的研究。该装置有助于发现新特征，例如在胞质分裂环闭合过程中肌球蛋白和肌动蛋白的周期性聚集与分布不均，以及高尔基体和细胞核排列的紧凑表型。我们针对哺乳动物细胞、裂殖酵母、芽殖酵母和秀丽隐杆线虫对该方法进行了表征，并针对每种体系进行了特定优化。最后，该装置的特性使其在药物筛选检测和个体化医学中具有特别重要的应用前景。

以下实验的总体目标是在模拟生理条件下三维环境的微腔阵列上，观察细胞器的形态与动态。对于具有刚性细胞壁的细胞（如裂殖酵母），微腔可组织并定向细胞结构。该目标首先通过母版制备PDMS柱阵列，再经复制成型获得PDMS微腔阵列（称为“卵杯”）来实现。第二步，将“蛋杯”用细胞外基质蛋白进行功能化处理，并放入含有定制圆柱形塑料部件的试管中，该塑料部件可支撑微腔样品，并允许将单个哺乳动物细胞分别引入各个微腔。随后，取出载有细胞的蛋杯，并与目标药物或化合物共同孵育，以研究细胞在三维限域环境中的表型及动态过程。实验结果表明，与基于细胞取向的传统二维体外实验相比，细胞表型存在差异，并可观察到新的动态结构。与现有的标准 2D 细胞培养检测等方法相比，该技术的主要优势在于，哺乳动物细胞在“蛋杯”中所处的 3D 环境类似于生理微环境，同时细胞排列有序且标准化。对于裂殖酵母而言，细胞的有序性和取向性也得到了显著改善。该方法有助于回答细胞骨架和药物发现领域中的关键问题，例如通过高内涵筛选鉴定新的抗癌药物。该技术的应用可拓展至癌症等多因素疾病的诊断，因为借助“蛋杯”可轻松进行并分析药物筛选实验，使该方法在个体化医疗领域具有重要意义。该方法能够揭示单个哺乳动物细胞和裂殖酵母细胞中有序结构与动态行为的关键信息，也可应用于组织化研究以及秀丽隐杆线虫（C.elegans）和水稻花粉（ri-so-flu-a）等发育胚胎的研究。在本实验方案中，通过复制模塑法将微腔阵列（即“蛋杯”）图案化于粘附在盖玻片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层表面。第一步是制备模具，此过程不会展示，但文本方案中有详细描述。模具制备完成后，下一步是制作PDMS复制品。在50毫升试管中，按1比10的重量比或体积比，将交联剂与预聚物充分混合，总质量为30克。将离心管在1,800 × g条件下离心五分钟，以去除气泡。轻轻将PDMS滴加到模具表面。如果出现气泡，则对混合物进行脱气处理。将样品置于65摄氏度的烘箱中加热四小时。PDMS固化后，使用手术刀轻轻切割出约一平方厘米的感兴趣区域，该区域包含约10的5次方个微腔或卵杯结构。然后轻轻剥离PDMS印模。开始复制模塑操作时，先将PDMS印章用氧气等离子体处理30秒以进行活化。将活化后的印章暂时存放在密闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。在通风橱内操作，将活化的PDMS印章放置于培养皿中，使带有微结构的一面朝上或倒置朝上，并将其置于一个15毫升瓶盖旁边。用 200 微升三甲基氯硅烷填充瓶盖。盖上培养皿，让印章硅烷化七分钟。将 PDMS 印章放置在旋涂仪上，使结构面朝上。在结构顶部滴加少量液态PDMS。以1500 RPM转速旋涂30秒，使PDMS在结构表面形成一层薄层。将印模置于65摄氏度的烘箱中加热四小时，固化旋涂沉积的PDMS层。接下来，将PDMS印章朝上放置，并与玻璃盖玻片一同置于氧气等离子体清洗仪中处理30秒，以激活薄PDMS层。立即让印章与玻璃盖玻片接触，并用镊子轻轻按压印章表面四周，使其粘合。随后，在印章顶部保持恒定压力约10秒钟。30 分钟后，小心地将印模从盖玻片上剥离，以释放出卵杯结构。操作时务必格外小心，避免损坏样品。用乙醇彻底冲洗卵杯，并进行干燥。如果在去针步骤期间PDMS卵杯未附着在玻璃盖玻片上而发生脱落，请考虑调整等离子清洗仪的设置，并重新开始复制 molding 的步骤。为了便于后续对样品的操作，建议将一小块固化的PDMS粘附在盖玻片边缘。对于本视频中所展示的哺乳动物细胞，必须用细胞外基质的黏附蛋白对PDMS表面进行功能化处理。将“蛋杯”置于氧气等离子体清洗仪中亲水化处理30秒。随后，用紫外光照射5分钟以对“蛋杯”进行灭菌。加入少量纤连蛋白溶液，覆盖整个“蛋杯”区域，并在室温下孵育1小时。防止样品干燥。使用塑料移液管，用约一毫升的 PBS 轻轻冲洗“蛋杯”结构，重复冲洗共三次。接下来，将定制的圆柱形塑料件放入一个 50 毫升的离心管中。向管中加入 13 毫升细胞培养基。培养基液面应至少高出圆柱形塑料件 2 厘米，以确保样品完全浸没。使用锋利且笔直的镊子夹住样品的 PDMS 手柄，小心地将卵杯放入管内，轻轻按压盖玻片，使其位于塑料片的上表面并完全浸没。待引入卵杯的细胞应培养至 80% 至 100% 汇合度，并重悬于五毫升培养基中。用移液器吸取 200 微升细胞悬液，滴加在卵杯上方，尽量将细胞滴加在卵杯中央位置，但避免与卵杯发生物理接触。这将防止样品破损和/或损坏。将50毫升离心管在1,800 × g下离心2分钟。再用移液器将200微升细胞加到卵杯顶部，并在1,800 × g下再次离心2分钟。重复此步骤共三次，以优化填充率。最后一次离心后，使用显微镜检查卵杯的填充率。用镊子夹住PDMS手柄，小心地将样品从管中取出，避免扰动卵杯中的细胞，并将样品放入含有培养基的培养皿中。为去除未进入卵杯中的多余细胞，用移液器在微结构阵列的每一侧轻轻吹打上下三次进行冲洗。最后，更换为新鲜培养基以清除未贴附的细胞。为观察固定的细胞器，将含有固定样品的卵杯置于倒置荧光显微镜的载物台上，并选择60倍油镜。在此示例中，样本为 NIH 3T3 成纤维细胞，其中高尔基体、细胞核和肌动蛋白纤维已被染色。使用明场照明仔细对焦，直至卵杯和细胞处于观察平面上。选择并聚焦目标区域，然后开始图像采集。开始此操作时，先将卵杯放入显微镜载物台支架中，并加入一毫升含10%FCS的L15细胞培养基。将支架安装在显微镜载物台上。为避免蒸发，将玻璃盖板盖在支架上方。使用配备60倍油镜的倒置落射荧光显微镜观察细胞。本示例采用表达荧光标记肌球蛋白和肌动蛋白的HeLa细胞，这两种分子是细胞有丝分裂过程中胞质分裂环闭合的关键组分。选择感兴趣的区域，并通过GFP或Texas Red通道寻找胞质分裂环。准确对焦。在两个通道中运行自动采集，直至收缩环完全闭合。卵杯的扫描电子显微镜图像显示，其形状和尺寸非常规则。对于具有 rigid 壁的细胞（如裂殖酵母），卵杯结构可引导胞质分裂环的定向。对于哺乳动物细胞，比较其在 3D 卵杯结构与 2D 平面表面上的生长情况发现，前者形成具有均一球形样表型的有序阵列，而后者则呈现无序且异质的形态。此外，在卵杯结构上生长的细胞其应力纤维数量减少，这一点可通过 Blebbistatin 处理产生的轻微效应数量减少得以证实。在二维培养条件下，高尔基体通常呈现延展的表型，而在“蛋杯”结构中则表现出更为紧凑的表型。该现象已通过高尔基体表型的定量分析得以证实。此外，在二维表面上，细胞核的取向是随机的；而在蛋杯结构中，无论是野生型细胞还是经Blebbistatin处理的细胞，其细胞核均在xy平面上呈正交取向。细胞核球形度值的测定结果显示，卵杯结构不会影响细胞核正常的球形度。然而，卵杯上野生型细胞与经Blebbistatin处理的细胞之间的差异表明，卵杯能够揭示药物在二维培养中被掩盖的真实效应。利用卵杯进行的活细胞研究可识别出在标准培养条件下无法观察到的新型活性过程。例如，在 HeLa 细胞中观察到有丝分裂过程中随着分裂收缩环的闭合，肌球蛋白出现周期性聚集并呈径向移动的现象。一旦掌握技术，可在六小时内利用模具复制制备出“卵杯”结构，细胞填充过程约需 15 分钟。在尝试该操作时，需特别注意“卵杯”的尺寸应与所研究的细胞大小相匹配。该方法还可进一步适用于制药公司的高内涵筛选平台，用于大规模筛选，也可用于患者的个性化诊断检测，以评估个体化的特异性治疗方案。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和使用“卵杯”微腔结构。“卵杯”可为多种类似系统建立标准化并生成有序排列，适用范围从无细胞壁的单个细胞（如哺乳动物细胞）到具有细胞壁的系统（如酵母和胚胎）。

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我们描述了一种用于细胞和多细胞类器官三维培养及实验的装置构建方法。该装置可实现对细胞在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号响应的分析。类器官在检测微弱且含噪声的输入信号方面优于单个细胞。...

趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

本方案介绍了如何制备和装载细菌样品以进行活体三维成像，以及如何从这些图像中重建大肠杆菌（E.

用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。...

一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

了解利用PDMS微腔阵列技术对哺乳动物细胞进行三维约束培养的方法，观察细胞器形态与动态变化。该技术可减少实验变异性，适用于高内涵药物筛选和细胞生物学研究。

在三维限域中排列单细胞与单胚胎：一种用于高内涵筛选的新装置

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