订货单细胞和单胚胎的三维约束：高内涵筛选新设备

以下实验的总体目标是观察细胞器在模拟生理条件下遇到的 3D 环境的一系列微腔上的形态和动力学。对于具有刚性壁的细胞，例如裂殖酵母，空腔可以组织和定向细胞结构。这是通过首先从母版制造一系列 PDMS 柱，通过复制成型获得一系列 PDMS 微腔，称为蛋杯来实现的。

作为第二步，将蛋杯与细胞外基质的蛋白质功能化，并引入带有圆柱形定制塑料件的试管中，该塑料件支撑微腔样品并允许在每个微腔上引入单个哺乳动物细胞。接下来，取出装满细胞的蛋杯并与感兴趣的药物或化合物一起孵育，以便在 3D 限制下研究细胞的表型和动态过程。获得的结果表明，与基于细胞方向的标准 2D 体外测定相比，观察到的细胞表型和新动态结构存在差异。

与现有方法（如标准 2D 细胞培养分析）相比，该技术的主要优点是，蛋杯中的哺乳动物细胞经历类似于逻辑微环境的 3D 环境，但按有序和标准化的等级排列。在裂殖酵母的情况下，顺序和方向也是显着的改进。该方法可以帮助回答细胞骨架和药物发现领域的关键问题，例如通过高内涵筛选确定新药和抗癌药物。

该技术的意义延伸到癌症等多因素疾病的诊断，因为可以通过蛋杯轻松进行药物筛选分析，这使得该方法对个性化医疗特别有趣。该方法可以为单个哺乳动物细胞和裂殖酵母细胞中的组织结构和动力学提供内部关键，也可以应用于组织研究、发育胚胎，如秀丽隐杆线虫和 ri-so-flu-a。在该协议中，将一系列微腔或蛋杯图案化到通过复制成型粘附在盖玻片上的聚二甲基硅氧烷或 PDMS 层上。

第一步是制造母版，不会显示，但在文本协议中进行了描述。制作主站后，下一步是制作 PDMS 副本。在 50 毫升试管中，以 1 比 10 的重量比或体积比将交联剂和预聚物充分混合，总共 30 克。

以 1， 800 倍 g 离心管 5 分钟以去除气泡。轻轻地将 PDMS 放在主控器顶部。如果出现气泡，请对混合物进行脱气。

将样品放入 65 摄氏度的烘箱中 4 小时。PDMS 固化后，用手术刀轻轻切开约 1 平方厘米的感兴趣区域，其中包括大约 10 到第 5 个微腔或蛋杯。轻轻撕下 PDMS 印章。

要开始复制成型程序，请通过氧气等离子体处理激活 PDMS 印章 30 秒。将激活的邮票暂时存放在封闭的培养皿中，以防止灰尘沉积。在通风橱中工作，将激活的 PDMS 印章将结构朝上或倒置的一侧放在 15 毫升瓶盖旁边的培养皿中。

用 200 微升三甲基氯硅烷填充盖子。盖上培养皿，让邮票盐化 7 分钟。将 PDMS 印章放在旋涂机上，结构朝上。

将一小滴液体 PDMS 放在结构顶部。以 1500 RPM 的速度旋涂 30 秒，以在结构顶部沉积一层薄薄的 PDMS。将印章放入 65 摄氏度的烘箱中 4 小时，以固化沉积的旋涂 PDMS 层。

接下来，通过将 PDMS 印章与玻璃盖玻片一起倒置在氧气等离子清洁器中 30 秒来激活薄 PDMS 层。立即将印章与玻璃盖玻片接触，然后用镊子轻轻按压印章的整个表面以进行粘合。之后，在邮票顶部保持恒定压力约 10 秒。

30 分钟后，轻轻地将印章从盖玻片上撕下，以释放蛋杯。请非常小心，不要破坏样品。用乙醇彻底冲洗蛋杯并干燥。

如果 PDMS 蛋杯不在玻璃盖玻片上并且在解钉步骤中脱落，请考虑调整等离子清洁器的设置并重新启动复制成型程序。为了便于以后对样品进行作，建议在盖玻片的边缘粘上一小块固化的 PDMS。对于本视频中介绍的哺乳动物细胞，PDMS 表面必须用细胞外基质的粘附蛋白功能化。

将蛋杯在氧气等离子清洗机中亲水 30 秒。之后，用紫外线对蛋杯消毒 5 分钟。滴入一小滴纤连蛋白溶液以覆盖整个蛋杯区域，并在室温下孵育 1 小时。

防止样品干燥。使用塑料分配移液管，用约 1 毫升 PBS 轻轻冲洗蛋杯。总共重复 3 次。

接下来，将定制的圆柱形塑料片放入 50 毫升的试管中。向试管中加入 13 毫升细胞培养基。介质应至少达到圆柱形件上方 2 厘米，以确保样品完全浸没。

使用锋利而笔直的镊子通过 PDMS 手柄固定样品，小心地将蛋杯放入试管内，轻轻按压盖玻片，直到它位于塑料片上侧的顶部并完全浸入。要引入蛋杯的细胞应培养至 80% 至 100% 汇合，并重悬于 5 毫升培养基中。将 200 微升细胞移液到蛋杯顶部，将细胞尽可能居中放置在蛋杯顶部，但避免身体接触。

这将防止样品破损和/或损坏。将 50 毫升试管以 1， 800 倍 g 离心 2 分钟。在蛋杯顶部再吸取 200 微升细胞，然后再次以 1， 800 倍 g 离心 2 分钟。

重复总共 3 次，以优化填充百分比。最后一次离心后，用显微镜检查蛋杯的填充百分比。使用镊子握住 PDMS 手柄，小心地从试管中取出样品，不要打扰蛋杯中的细胞，然后将样品放入装有培养基的培养皿中。

要去除不在蛋杯中的多余细胞，请在微结构阵列的每一侧旁边轻轻上下吹打 3 次来冲洗。最后，用新鲜培养基替换培养基以去除未贴壁的细胞。要观察固定的细胞器，请将装有固定样品的蛋杯放在落射荧光倒置显微镜的载物台上，然后选择 60 倍油物镜。

在这个例子中，样品是 NIH 3T3 成纤维细胞，其中高尔基体、细胞核和肌动蛋白纤维已被染色。使用明场光仔细聚焦，直到蛋杯和细胞位于观察平面内。选择并聚焦感兴趣区域，然后开始图像捕获。

通过将蛋杯放入显微镜支架中并填充 1 毫升 10% FCS L15 细胞培养基来开始此过程。将支架安装在显微镜的载物台上。为避免蒸发，请在支架顶部放置一个玻璃盖。

用配备 60 倍油物镜的落射荧光倒置显微镜观察细胞。本例使用表达荧光标记的肌球蛋白和肌动蛋白的 HeLa 细胞，这两个关键分子参与有丝分裂过程中细胞动力学环闭合。选择感兴趣的区域，并使用 GFP 或 Texas Red 通道寻找细胞动力学环。

准确对焦。在两个通道中运行自动采集，直到环完全闭合。蛋杯的扫描电子显微镜图像显示，它们的形状和大小非常规则。

对于具有刚性壁的细胞，例如裂殖酵母，卵杯可以定位细胞动力学环。对于哺乳动物细胞，3D 蛋杯和 2D 平面上的细胞之间的比较表明，前者形成具有均质球形表型的有序阵列，而后者则表现出无序和异质的形态。蛋杯上的细胞也显示出应力纤维数量的减少，如用 Blebbistatin 治疗而产生的适度效果的数量所表明的那样。

2D 培养物上的高尔基体通常显示扩展的表型，而在蛋杯中，它显示更紧凑的表型。这通过对高尔基体表型的定量得到证实。最后，在 2D 表面上，细胞核是随机定向的，而在蛋杯上，它在野生型和 Blebbistatin 处理的细胞中在 xy 平面上是正交定向的。

核球形度值的测定表明，蛋杯不会影响细胞核的正常球形度。然而，蛋杯上野生型细胞和 Blebbistatin 处理的细胞之间的差异表明，蛋杯揭示了在 2D 中掩盖的药物的真实效果。使用蛋杯进行活细胞研究能够识别新的活性过程，而这些过程在标准培养物中是不可见的。

例如，在 HeLa 细胞中观察到肌球蛋白的周期性积累，这些肌球蛋白在有丝分裂期间随着细胞动力学环的闭合而径向移动。一旦掌握，蛋杯可以在不到 6 小时的时间内从复制品中制备出来，细胞的填充可以在大约 15 分钟内完成。在尝试此过程时，重要的是要了解所研究细胞的蛋杯大小。

该程序可以进一步适用于制药公司的高内涵筛选平台，用于大规模筛选活动，也可用于患者的个性化诊断分析，以评估个体特异性治疗。看完这个视频，你应该对如何制造和使用蛋杯微腔有一个很好的了解。蛋杯对各种类似系统进行标准化和生成顺序，从无壁的单个细胞（如哺乳动物细胞）到有壁的系统（如酵母和胚胎）。