小鼠胎肝文化系统解剖靶基因功能的终端红细胞生成的早期和晚期
September 9th, 2014
我们提出了一个在体外小鼠胎肝红细胞培养系统剖析终端红细胞生成的早期和晚期阶段。这个系统有利于在不同的发育阶段特异性基因的功能分析。
以下实验的总体目标是使用体外小鼠胎儿肝脏培养系统解剖终末红细胞生成不同阶段的基因功能。这是通过首先从胚胎第 13.5 天怀孕小鼠中纯化 TER 19 阴性小鼠胎肝成红细胞来实现的 作为第二步，用编码目标基因的 CD NA 或 S-H-R-N-A 的病毒转导纯化的成红细胞，以分别研究基因的功能增益或丧失。最后，在两种不同条件之一下培养转导的 TER one 19 个阴性细胞，以解剖该基因在终末红细胞生成早期和晚期的功能。
最终，可以通过流式细胞术分析来评估转导细胞的分化和去核的不同动力学。因此，这种方法可以提供对小鼠心房病的见解。它也可以应用于其他 HESI 的 hepo 系统，例如淋巴、osis和肌化。
为了净化胎儿肝脏成红细胞，首先用 70% 乙醇对安乐死的 E 13 至 E 15 定时怀孕小鼠的腹部进行消毒。然后用解剖剪刀打开腹部，取出子宫并将子宫放入 PBS 中。接下来，在组织培养罩中，使用无菌工具解剖胎儿并将其放入 PBS 中。
然后用一把镊子一次握住一个胎儿的身体。用另一把镊子轻轻地将每个粉红色的胎儿肝脏从身体中拉出。使用镊子从每个肝脏中清洁相关的纤维化组织，然后将肝脏放入含有 10% FBS 的新鲜 PBS 中，通过上下吹打组织几次来机械破坏肝脏，然后通过 40 微米细胞过滤器过滤所得细胞悬液。
在4 摄氏度下以 800 G 离心细胞 5 分钟后，将沉淀重悬于 1 mL PBS 和 FBS 中。为了纯化 TER one 19 阴性成红细胞，在冰上用大鼠 IgG 封闭细胞。15 分钟后，将生物素化抗 TER one 19 抗体添加到细胞悬液中，再添加 15 分钟。
然后在 PBS 和 FBS Reese 中洗涤细胞后，将细胞悬浮在 1 毫升新鲜 PBS 加 FBS 中，并将细胞在 75 微升与磁性颗粒偶联的链霉亲和素中在冰上孵育。10 分钟后，用 PBS 加 FBS 使总体积达到 2.5 mL，然后将细胞悬液转移到 5 mL 聚丙烯圆底管中。将试管插入磁性细胞分选仪中，再孵育 10 分钟后，在再次孵育后，将未附着的 TER 19 个阴性成红细胞倒入新的 5 毫升试管中。
要去除残留的 TER one 19 阳性细胞，请旋转 TER one 19 阳性成红细胞。将细胞重悬于一毫升含有 FBS 的 PBS 中，并用 trian blue 计数活细胞以转导纯化的 TER，一个 19 阴性胎肝细胞首先将它们以每孔 3 至 500， 000 个接种在纤维蛋白肌动蛋白包被的 12 孔板中，然后加入多脑至终浓度为每毫升 10 克，以促进病毒转导并用感兴趣的病毒旋转感染细胞在 1 GS 和 800 摄氏度下放置 1 至 1.5 小时。为了评估终末红细胞生成早期的基因功能，将转导的细胞在不含 EPO 的干细胞因子培养基中培养 12 小时。
然后，在离心细胞后，Reese 将每个孔中的细胞放入 1 毫升含 EPO 的培养基中，并培养 24 至 48 小时。然后可以收获细胞进行进一步分析，以测试终末红细胞生成培养后期的基因功能。转导的细胞立即在含有 EPO 的培养基中，并在培养 24 至 48 小时后收获细胞以进行进一步测定在这些密度图中，显示了磁珠分选前后胎肝红细胞的纯度，用于终末红细胞生成的早期阶段。
病毒转导后，将细胞在不含 EPO 的干细胞因子培养基中培养 12 小时。在此期间，细胞保持其祖细胞状态。转导的基因在 12 小时后表达。
在 SCF 培养基中，在两种方法中，在含 EPO 的培养基中培养两天期间，GFP 转导的细胞均未观察到明显的细胞凋亡。大多数 CD 71 低 TER one 19 低红系祖细胞表现出转铁蛋白受体和 TER one 19 的诱导。到第 2 天，剜除发生在第 2 天，如在宿主高 TER 1 19 高成红细胞和宿主低 TER 1 19 高网状细胞上观察到的那样。
值得注意的是，在遵循此程序后，立即在 EPO 中培养的细胞比首先在干细胞因子培养基中培养的细胞分化和成核更快。可以进行其他方法，如细胞增殖、检测或蛋白质血液分析，以确定口服表达或目标基因调节后的细胞或分子反应。
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概述
本研究介绍了一种体外小鼠胚胎肝脏红芽球培养系统，旨在剖析末期红细胞生成的早期和晚期阶段。该系统允许在不同发育阶段对特定基因进行功能分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 末期红细胞生成是血细胞发育的关键过程。
- 了解这一过程中的基因功能可以提供对造血的洞察。
- 体外模型对于研究发育过程中特定基因的作用至关重要。
- 本研究以小鼠胚胎肝脏红芽球为模型系统。
研究目的
- 剖析末期红细胞生成不同阶段的基因功能。
- 评估特定基因对红芽球分化的影响。
- 提供对分化和脱核动力学的洞察。
所用方法
- 从胚胎第13.5天的小鼠中纯化TER119阴性胚胎肝脏红芽球。
- 用编码感兴趣基因的病毒载体转导纯化的红芽球。
- 在不同条件下培养转导的细胞以评估基因功能。
- 通过流式细胞术分析来评估分化和脱核动力学。
主要结果
- 该培养系统有效地剖析了红细胞生成的早期和晚期阶段。
- 可以通过功能获得或丧失实验来评估基因功能。
- 流式细胞术提供了对细胞分化的定量洞察。
- 该方法可以用于研究其他造血系统。
结论
- 该体外系统是研究红细胞生成的有价值工具。
- 获得的洞察可以增强对造血基因功能的理解。
- 该方法可能适用于其他血细胞谱系。
常见问题
Executive Industry Relevance
This in vitro mouse fetal liver culture system enables stage-specific interrogation of gene function during terminal erythropoiesis, addressing a key gap in hematopoietic target validation. By decoupling early progenitor maintenance from late-stage differentiation, the method supports mechanistic de-risking of erythroid pathway targets in discovery biology. It provides a reproducible platform for assessing genetic perturbations prior to preclinical investment in anemia or erythropoiesis-modulating therapies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables gain- and loss-of-function analysis of candidate genes in defined erythroid differentiation windows.
- Operational Value: Uses standardized transduction and cytokine-switch protocols to isolate temporal gene effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative flow cytometric readouts of differentiation and enucleation kinetics.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined progenitor purification and timed EPO stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links stage-specific gene effects to erythroid maturation phenotypes relevant to disease models.
- Operational Value: Provides a scalable primary cell system for target confirmation before in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional gene validation in a disease-relevant erythroid system prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of hematopoietic targets through stage-resolved perturbation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative differentiation metrics for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Employs flow cytometry to measure TER119 and CD71 dynamics as dependable readouts of maturation.
- Translational Research: Connects in vitro gene function to erythropoietic continuity via enucleation and receptor expression tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform adaptable to other hematopoietic lineages via cytokine and marker adjustments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in erythroid target validation through temporal resolution of gene function.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fetal liver purification and magnetic sorting workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stage-specific toxicities or lack of efficacy early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of erythroid modulators based on differential early/late stage activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary hematopoietic cell isolation and viral transduction.
- Dependent on flow cytometry infrastructure for TER119/CD71 quantification.
- Necessitates cross-team standardization of cytokine timing and EPO switch protocols.
- Adaptation to human or alternative models requires validation of equivalent progenitor markers.
- Limited to ex vivo primary cells; not suitable for long-term culture or GMP applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Purification of Fetal Liver Erythroblasts
2:32
Purification of TER119 Negative Erythroblasts
3:50
Transduced TER119 Negative Mouse Fetal Liver Erythroblast Culture
4:57
Results: Representative Flow Cytometric Analyses of Differentiated and Enucleated Transduced Erythroblasts
6:08
Conclusion
