荧光共振能量转移研究构象变化的膜蛋白在哺乳动物细胞中表达

以下实验的总体目标是测量膜蛋白在其生理状态下的确认变化。这是通过膜蛋白的位点特异性标记来实现的，以测量它们的 LRE 寿命，从而测量两个位点之间的距离。作为第二步，添加配体，诱导可测量的确认变化。

接下来，添加适当的蛋白酶以切割 floor fours 中的一个并获得背景信号。最终，可以测量由此产生的驻留能量转移引起的荧光寿命变化，以测量蛋白质结构中发生的确认变化。与现有方法（如 X 额外晶体学）相比，该技术的主要优点是，使用这种方法我们可以测量蛋白质在其生理状态下的动态变化。

虽然这种方法可以提供对正性肌力内酯受体或 asay 感应离子通道的见解，但它也可以应用于其他类型的蛋白质，如 NICO 受体。我们将展示发光、应力和能量转移的技术，特别是在研究哺乳动物细胞中膜蛋白的确认变化的背景下。我的学生 Dino 和 Swara Swami 将在开始实验之前演示该程序。

选择能够反映蛋白质内可能的构象变化的标记位点非常重要。如果可能，使用蛋白质或同源蛋白质的晶体结构来帮助进行此测定。选择残基，使所选残基的侧链暴露在表面，并且可供 Fluor 四联接触，以便标记蛋白质。

包括一个蛋白酶切割位点，如果蛋白质序列允许，该位点可以特异性地从蛋白质中切割出一个胱氨酸。通过保守突变蛋白质来引入一个位点，使其具有凝血酶或因子 10，凝血酶或因子 10 是靠近引入的胱氨酸的序列，可进行蛋白酶切割。选择一个位点，使引入的胱氨酸之一在切割时与蛋白质的其余部分解离。

在某些情况下，这可能需要突变胱氨酸两侧的两个切割位点。根据正在测量的预期距离范围选择下限 4，使范围介于 0.5 到 1 倍之间，是下限 4 对的 R 零的 1 倍。这允许更轻松地减去背景，背景通常具有更长的寿命，范围约为 35 埃，适当的第四层对是 tur 螯合物作为供体，Alexa 5 94 作为受体，R 零为 53 埃。

选择目标蛋白质后，只需将缓冲液移液到培养皿底部即可分离 HEK 细胞。然后旋转细胞并将沉淀重悬于 3 mL 细胞外缓冲液中。接下来，在供体中孵育细胞并接受它们的地板。

等摩尔量的 fours 在室温下在旋转器上放置 1 小时，最终浓度为 100 至 300 纳摩尔。标记后，用细胞外缓冲液洗涤细胞 3 到 4 次，以去除任何未结合的荧光，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜的细胞外缓冲液中。为了测量细胞的 lre，将细胞悬液转移到最小体积为 1 毫升的石英 vete 中，并将光致发光光谱仪的激发波长设置为供体氟 4 的吸光度范围。

适当设置发射波长。然后将发射检测的长度设置为预期 LRE 寿命的至少三倍，以确保不会错过长寿命组件，并执行至少 3 次扫描，每次扫描 99 次，以确保结果一致。将结果保存为文本文件，然后测量蛋白质响应添加配体的确认变化。

在此新条件下，添加配体并对同一样品进行至少 3 次扫描，每次扫描 99 次。然后添加最多 5 个单位的适当蛋白酶。连续扫描直到切割完成，并且在连续三次扫描的生命周期内没有看到进一步的变化，大约需要两到三个小时来分析 LRE 数据。

首先将平均值设置为折线图，Y 轴上是荧光强度，X 轴上是以微秒为单位的寿命，以创建代表受体敏化发射寿命的曲线。将图的 Y 轴更改为对数刻度。然后在绘图菜单下，打开图层控制对话框，并将包含背景平均值的数据传输到图层内容列表中。

接下来，在数学菜单下，使用简单的数学函数根据需要对背景数据进行乘以或除以，直到背景的尾端与原始数据的尾端重叠，留下蛋白质切割前后的背景信号。然后再次使用简单的数学函数，从初始原始 LRE 信号中减去对齐的背景信号，并将数据拟合为指数衰减。将拟合的起始边界设置为在激光脉冲结束之后开始。

然后在 select fitting function 对话框中，选择指数衰减，以便将生命周期拟合到单个指数衰减的方程。其中 Y 表示荧光强度，Y 零表示由系统噪声引起的背景强度。A 1 是信号强度，T 是荧光寿命，X 是时间，X 0 是时间偏移。

最后，将 X 从 0 固定到 0。启动 fitting 函数，并使用从数据中获得的生命周期来拟合数据。使用 forestry 方程式计算 floor fours 之间的距离。

使用 lahane 供体成功进行 LRE 测量时，其仅供体生存期应在毫秒级时间内。在测量确认变化时，特定的 LRE 信号应显示测量误差之外的寿命变化，然后可以通过与寿命拟合相关的误差的传播来计算。用供体和受体标记的蛋白质的敏化 LRE 发射的寿命将显着缩短，寿命在毫秒范围内。

背景、减法后，蛋白酶切割导致寿命增加，随着时间的推移应该变得稳定，表明蛋白酶切割已完成。如果 LRE 信号仅来自一组站点，则减去背景后产生的发射寿命应为单个指数寿命。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到五个小时内完成。

在尝试此过程时，重要的是要监测参数、波长和类固醇速度 开发后。这项技术为研究膜蛋白在其神经生理状态下的构象变化铺平了道路。