使用不连续蔗糖梯度制备突触浆膜和突触后密度蛋白

本实验的总体目标是通过使用不连续蔗糖梯度对脑组织进行亚细胞分级，以富集来自突触膜和突后密度的蛋白质。首先使用电动匀浆器对脑组织进行匀浆，随后通过一系列离心步骤制备粗膜蛋白提取物。

然后将膜提取物铺在不连续蔗糖梯度上进行超速离心。最后一步是从梯度中收集蛋白质。最终，可通过Western印迹分析显示突触蛋白水平的变化。

这是一种神经科学家已使用超过40年的成熟技术。在我们的实验室中，该技术用于研究当我们干扰不同的神经递质系统时，突触的蛋白质组成如何发生变化。与其他方法（如逐级梯度或连续蔗糖梯度）相比，该技术的主要优势在于不连续蔗糖梯度更易于手工构建。

本方案使用由电机驱动的玻璃-聚四氟乙烯匀浆器，每次处理不同样品之间必须更换研杵，并对匀浆器进行冲洗和干燥。首先，将解剖得到的组织放入含有4毫升0.32摩尔HEPES缓冲蔗糖溶液的13毫升离心管中，随后将组织转移至洁净的玻璃匀浆器中。

将电机转速设为900 RPM，使用少于4克的组织，在30秒内进行12次匀浆，以确保良好的组分分离；将样品转移回离心管中，并取100微升等分试样于负80摄氏度保存，用于蛋白质分析。接下来，在4摄氏度下，以900 ×g离心10分钟，分离核成分，然后将上清液转移至新的15毫升离心管中。

上清液含有粗膜组分。现在为了富集粗突触体，将上清液在4°C、10,000 G条件下离心15分钟，弃去上清液。沉淀物中含有粗突触体组分Resus。

将样品悬浮于1毫升0.32摩尔的蔗糖溶液中。然后向该悬浮液中加入另外3毫升溶液，将粗提组分在4摄氏度、10,000 ×g 条件下离心15分钟，弃去上清液。立即快速收集沉淀，将沉淀重悬于1毫升纯水中。

然后迅速加入另外三毫升水。将溶液转移至匀浆器中。手动匀浆三次，再转移回13毫升离心管中。

加入16微升1摩尔HEAs，通过倒置混匀，迅速将样品调整回4毫摩尔HEAs。现在将样品置于4摄氏度的旋转仪上旋转半小时。为确保样品充分裂解，通过离心收集裂解后的P2'组分完成分级分离。

在 4°C 条件下以 25,000 G 离心 20 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 毫升蔗糖溶液中。此组分含有富集的突触体膜。首先，预先配制缓冲液以制备不连续蔗糖梯度。

按下述方法准备三支试管：一支加入恰好 3.5 毫升的 1.2 摩尔海普斯缓冲蔗糖溶液，另一支加入恰好 3 毫升的 1.0 摩尔溶液，第三支加入 3 毫升的 0.8 摩尔溶液。接着，用玻璃研磨棒移液器将 1.2 摩尔蔗糖溶液转移至一支 12 毫升的聚合物超速离心管中。

使用新的移液管，小心地将 1.0 摩尔溶液铺加在 1.2 摩尔溶液上。注意不要扰动 1.2 摩尔溶液，也不要引入气泡。采用相同的技术将 0.8 摩尔溶液铺加在上层。

需谨慎操作。实验台涡旋振荡器或微型离心机产生的微小振动均可能破坏梯度的完整性。因此，必须小心且高效地制备梯度。

如果时间过长或梯度受到振动，后续步骤中将无法回收突触膜。现在，用另一支巴斯德移液管将富集的突触上清膜组分小心铺加到已制备好的梯度上层。将梯度在超速离心机中用摆动转子精确平衡。

然后在 4°C 条件下以 150,000 G 离心两小时。离心结束后从转子中取出梯度管时需格外小心，应可见清晰的蔗糖溶液条带，每个界面处含有蛋白质组分，并有沉淀形成，各组分不应弥散。

使用18号针头和1毫升注射器，刺入1.2 mol/L界面的最低部分，吸取含有突触浆膜的白色蛋白条带。记录该层的体积，并将该层转移至3.5毫升厚壁超速离心管中。

准确加入2.5倍体积的4毫摩尔HEAs。然后在固定角转子中用0.32摩尔HEAs缓冲蔗糖溶液制备平衡管，于4摄氏度下以200,000 G超速离心30分钟。随后弃去上清液，重悬突触浆膜沉淀。

在300微升含50毫摩尔HEPES和2毫摩尔EDTA的溶液中。现在可通过使用相同技术进一步收集突触后密度组分（PSD组分）。这些步骤在文本方案中已明确说明。

使用总蛋白、突触质膜以及第一级突触后密度蛋白组分进行了一次蛋白质印迹实验。PSD组分仅经过一次去污剂处理，组织来源于小鼠纹状体。诸如多巴胺转运蛋白之类的突触前蛋白在SPM组分中富集，但在后续用于PSD富集的去污剂步骤中被消除。

在进行该实验操作时，重要的是要始终将所有样品置于冰上，并在操作过程中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。此外，还可进行其他方法，如蛋白质印迹分析或二维凝胶电泳。随后，您便可以回答诸如药物处理如何影响突触处受体水平等问题。