原代神经元中量子点标记的BDNF轴突运输的实时成像

本实验的总体目标是通过活体成像技术追踪脑源性神经营养因子（BDNF）的逆行轴突运输过程。首先，将微流控装置组装在多聚赖氨酸包被的盖玻片上；第二步，分离 E18 大鼠海马神经元，并将其接种于微流控装置的胞体区室中。

接下来，培养神经元，使其轴突穿过微沟延伸至培养室的轴突区。最后一步，将量子点标记的BDNF加入轴突区。最终，可通过荧光显微镜观察BDNF在海马神经元轴突内的运输情况。

与现有的 B-D-F-E-G-I-P 或 BDFM 樱桃标记等方法相比，该技术的主要优势在于，使用量子点标记 BDF 可实现对轴突内单个 BDF 二聚体的光学成像，从而证明该操作步骤将要、应当进行。从我的左侧第三个点开始绘制一个后置点，首先用 1% aox 手动清洗微流控室，随后用 Milli-Q 水冲洗三次，每次 30 分钟。接着用 70% 乙醇手动清洗微流控室，将其置于洁净的层流罩内的 Parafilm 上晾干，再在紫外线下对微流控室的两侧进行 20 分钟的灭菌处理，最后将灭菌后的微流控室置于室温下、用 Parafilm 密封的无菌 15 厘米培养皿中保存。

接下来，将 24 × 40 毫米的 1 号盖玻片置于 10% 盐酸中，在旋转摇床上过夜浸泡，随后用清水洗涤三次，每次 30 分钟。最后一次洗涤后，将每片盖玻片浸入 100% 乙醇中进行消毒，再在本生灯火焰上灼烧，然后于室温下干燥保存在无菌培养皿中。

为了包被盖玻片，将其放入一个15厘米的培养皿中，然后每片上均匀覆盖0.7毫升0.01%的多聚赖氨酸（poly-L-lysine）。在组织培养超净台中孵育1小时后，用无菌水冲洗盖玻片三次，随后用真空泵干燥，并将其转移至一个6厘米的培养皿中。然后将一个已灭菌的微沟槽面朝下的培养腔室轻轻放置在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上。

注意不要触碰微沟槽，使用微量移液器吸头轻轻按压腔室，使组装好的微流控腔室紧密密封。现在将两个 E17 至 E18 大鼠海马组织放入含有 2 毫升解剖缓冲液的 15 毫升锥形管中，并每次用 5 毫升解剖缓冲液冲洗组织三次。然后尽可能吸除洗涤液，加入 900 微升新鲜解剖缓冲液以消化组织。

接着，向组织中加入 100 微升 2.5% 胰蛋白酶，并将试管置于 37 摄氏度水浴中。消化 10 分钟后，加入 100 微升 DNA 酶 I，立即使用火焰抛光的聚乙烯玻璃移液管轻柔吹打组织 5 到 10 次。加入 2 毫升铺板培养基以终止胰蛋白酶消化反应，并在组织培养罩中静置 5 分钟，使组织碎片沉降至试管底部。

接下来，小心地将两毫升上清液转移至一个洁净的无菌15毫升锥形管中，并离心沉淀细胞。将沉淀物重悬于50微升铺板培养基中，计数后，取15至20微升细胞悬液加入微流控芯片的一个腔室中。将芯片孵育10分钟，使细胞贴附于盖玻片上，然后加入更多铺板培养基，填满芯片的两个腔室。

孵育一天后，在胞体室和轴突室中均将铺板培养基更换为维持培养基。第三天时，海马神经元的轴突开始穿过微通道，通常在第五至第七天之间到达轴突室。在此期间，每次进行活体成像观察量子点标记的BDNF轴突运输前，每24至48小时更换一半的培养基为新鲜的维持培养基。

在BDNF耗竭期间，每30分钟用不含BDNF和血清的Neurobasal培养基彻底冲洗微流控室的两个腔室，持续2小时；随后在冰上将50纳摩尔单生物素化BDNF二聚体与50纳摩尔量子点655标记的链霉亲和素缀合物在Neurobasal培养基中孵育60分钟。然后将轴突腔室中的培养基更换为300微升量子点标记的BDNF，在37摄氏度下孵育4小时，以最大限度减少量子点标记的BDNF向胞体腔室的扩散。

在孵育结束、预热以及使用倒置显微镜时，必须始终保持胞体区室中的培养基液面高于轴突区室。显微镜需配备100倍油镜和环境培养室，以维持37摄氏度和5%二氧化碳的恒定温度，同时在设备预热过程中保持该条件。用缓冲液洗去微流控腔室中未结合的量子点标记的BDNF，然后使用一套Texas red激发和发射滤光片组来观察量子点655信号。最后，使用CCD相机以每秒一帧的速度对中间轴突区域进行延时成像，总时长为两分钟。

使用无轴突且未标记量子点的微沟槽作为对照，以分析浸润情况，并利用适当的时间序列成像分析软件对量子点标记的BDNF信号运输进行分析。在大多数含有轴突的微沟槽中可观察到量子点信号，而在无轴突的微沟槽中则未检测到量子点信号，表明量子点信号从轴突区室向胞体区室的扩散极轻微或几乎不存在。一段长度为80微米的海马神经元轴突被荧光记录了100秒。共计六次。

在成像过程中，清晰地观察到三个向细胞体单向移动的量子BDNF信号。其中一个信号被观察到在约70秒内平稳地向细胞体移动，穿过整个视野。另一个信号在前20秒内向逆向移动，随后在10至20秒内转为顺向移动，最后20秒再次改变方向，朝向细胞体移动。

第三次事件也被观察到以逆行方向移动，但在运动过程中期暂停了约20秒。在此第一幅具有代表性的量子点标记BDNF运输的钟形图中，量子点标记的BDNF快速而平稳地向细胞体移动，在大约60秒内穿越了80微米的视野。在此第二幅时间记录图中，量子标记的BDNF以逆行方向移动，在120秒内行进了约50微米，并至少出现三次较长时间的停顿。

最后，散点图测量了每个单个量子点标记的BDNF的运动速度、平均速度和暂停时间。量子点标记的BDNF运动速度相对较快，范围为0.47至1.97微米/秒，平均值为1.06 ± 0.05微米/秒。由于BDNF在运输过程中存在暂停现象，其平均速度显著低于运动速度，平均值为0.48 ± 0.03微米/秒，平均暂停持续时间为15.88 ± 1.30秒（发育完成后）。

该技术可使神经科学领域的研究人员探索健康与疾病状态神经元中神经营养因子及其受体的转运过程。