Name: 初级量子神经元轴突运输的实时成像点标记的BDNF (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学习利用量子点标记和微流控技术对大鼠海马神经元中的BDNF进行实时成像，追踪其轴突逆向运输过程。该方法为研究神经营养因子动态及神经退行性疾病机制提供了重要工具。

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我们感谢Yue (Pauline) Hu和Rachel Sinit提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院基金（PN2 EY016525）以及唐氏综合征研究与治疗基金会和Larry L. Hillblom基金会的资助支持。

外科手术和动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。所有涉及动物使用的实验均经加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理和使用委员会批准。
1. 单生物素化BDNF（mBtBDNF）质粒克隆、表达与纯化
注意：将 pre-proBDNFavi 和 BirA cDNA 构建到 pcDNA3.1 载体中，并在 HEK293FT 细胞中共同表达10。参照先前发表的成熟且具有生物活性的单生物素化神经生长因子（mBtNGF）的制备方法10，使用 Ni-NTA 琼脂糖珠纯化 mBtBDNF。
2. 微流控腔室的制备
微流控神经元培养装置可实现轴突与神经元胞体的流体隔离。每次解剖前，使用新包被的盖玻片组装培养室。本实验方案中使用的微流控培养室为商业购买产品（见材料与设备表）。经手洗后，商业购买的培养室可重复使用5至6次。
<ol>
	<li>用 1% Alconox 手工清洗微流控腔室。每次用 Milli-Q 水冲洗 30 分钟，共冲洗三次。再用 70% 乙醇手工清洗腔室一次。</li>
	<li>将腔室平铺在超净台内的 Parafilm 上晾干。在紫外线下双面照射并灭菌 20 分钟。将灭菌后的腔室存放于用 Parafilm 密封的无菌 15 cm 培养皿中，室温保存。</li>
	<li>将 24 × 40 mm 的 1 号玻璃盖玻片放入玻璃容器中。在旋转器上用 35% 盐酸浸泡过夜。次日，用去离子水冲洗盖玻片三次，每次 30 分钟。</li>
	<li>逐片将盖玻片浸入 100% 乙醇中，再在本生灯火焰上灼烧，以实现灭菌。将干燥的盖玻片存放在无菌培养皿中，室温保存至包被前使用。</li>
	<li>将盖玻片平铺于 15 cm 培养皿中。每片盖玻片上加入 0.7 ml 0.01% 多聚-L-赖氨酸（PLL），在超净台中室温孵育。</li>
	<li>1 小时后，用无菌水冲洗盖玻片三次，每次 30 分钟。用真空抽干盖玻片，并将每片盖玻片转移至 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>组装微流控腔室时，将带有微沟槽的一面朝下，小心地放置在已包被 PLL 的盖玻片上，注意避免触碰微沟槽。用移液器吸头轻轻下压腔室，确保腔室密封紧密。</li>
</ol>
3. 神经元培养物的分离及在培养腔室中的接种
<ol>
	<li>将两个 E17-E18 大鼠海马组织（一个脑）在含有 2 ml 分离缓冲液（HBSS，无钙、无镁，含 1% 青霉素/链霉素和 10 mM HEPES）的 15 ml 圆锥形离心管中进行解剖。每次用 5 ml 分离缓冲液冲洗组织 3 次&#160;。尽可能去除分离缓冲液，并加入 900 μl 新鲜的分离缓冲液。</li>
	<li>为消化组织，向分离缓冲液中加入 100 μl 10 倍浓度的胰蛋白酶（2.5%），使其工作浓度为 1 倍。将离心管置于 37 °C 水浴中。消化 10 分钟后，加入 100 μl 10 mg/ml 的 DNase I，终浓度约为 1 mg/ml。</li>
	<li>使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，通过上下吹打 5–10 次轻柔地 triturate（机械分散）组织。trituration 完成后立即加入 2 ml 铺板培养基（Neurobasal 加 10% FBS、2 mM GlutaMax、2% B27）以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>将样品置于超净台中静置 5 分钟，使组织碎片充分沉降到管底。小心吸取 2 ml 上清液转移至一个新的无菌 15 ml 圆锥形离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。将沉淀重悬于 50 μl 铺板培养基中。</li>
	<li>用血细胞计数板计数细胞。取 15–20 μl 细胞悬液（约 40,000 个细胞）加入微流控芯片的一个腔室中。将芯片放入培养箱中孵育 10 分钟，使细胞贴附在盖玻片上。10 分钟后，加入更多铺板培养基，使芯片的两个腔室均充满培养基。</li>
	<li>在解剖后的第二天，将细胞体室和轴突室中的铺板培养基完全更换为维持培养基（Neurobasal 加 2 mM GlutaMax、2% B27）。海马神经元的轴突通常在第 3 天开始穿过微沟道，并在第 5 至第 7 天到达轴突室。在此期间，每 24～48 小时更换一半的培养基，补充新鲜的维持培养基。</li>
</ol>
4. QD-BDNF 的轴突运输
<ol>
	<li>在进行QD-BDNF轴突运输的活体成像之前，每隔30分钟用不含BDNF和血清的Neurobasal培养基彻底冲洗微流控装置的胞体室和轴突室，持续2小时，以耗尽细胞体和轴突区室中的BDNF。</li>
	<li>在BDNF耗尽期间，制备QD-BDNF偶联物。将50 nM单生物素化BDNF二聚体与50 nM QD655-链霉亲和素偶联物在Neurobasal培养基中混合，并在冰上孵育60分钟。</li>
	<li>移除轴突室中的培养基，加入300 μl终浓度为0.25 nM的QD-BDNF，在37 °C下孵育4小时。为尽量减少QD-BDNF向细胞体室的扩散，必须始终保持细胞体室的液面高于轴突室。孵育结束后，在进行活体成像前洗去未结合的QD-BDNF。</li>
	<li>使用配备100倍油镜的倒置显微镜进行QD-BDNF运输的活体成像。将显微镜及其附带的环境培养箱预热至恒定温度（37 °C）和CO2浓度（5%）。使用Texas red激发/发射滤光片组观察QD655信号。</li>
	<li>使用CCD相机在中间轴突区域以每秒1帧的速度采集并记录共计2分钟的时间序列图像。以无轴突且无QD信号的微沟道作为对照，用于评估非特异性渗入。</li>
	<li>使用任意图像分析软件或NIH ImageJ分析BDNF的运输情况。</li>
</ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本研究中，我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化脑源性神经营养因子（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将该蛋白与量子点链霉亲和素偶联，并结合微流控小室，该方法能够以单分子灵敏度、实时且具备空间和时间分辨率的方式，在原代神经元中检测BDNF的轴突运输。本文所使用的工具为研究健康与疾病状态下神经元中介导BDNF/TrkB信号内体轴突运输的分子机器提供了有效手段。
BDNF-GFP 或 BDNF-mCherry 已被用于追踪多种神经元培养中 BDNF 的轴突运输 体外这些试剂为研究顺向运输以及可能研究TrkB的自分泌激活提供了一种选择。然而，在研究逆向运输时存在主要缺陷，其中最突出的问题是GFP或mCherry的荧光强度不足以支持单分子水平的研究。先前的研究表明，在生理浓度的NGF条件下，单个NGF二聚体可被内化11 并逆向运输8重要的是，使用量子点标记的BDNF（QD BDNF）还可确定BDNF与其TrkB受体结合的亚细胞定位。当使用GFP或mCherry标记的蛋白时，胞体表达会导致...

神经元是高度极化的细胞，其细长且通常高度分支的突起对于建立和维持神经环路的结构与功能至关重要。轴突在向突触运输物质以及从突触反向运输中发挥关键作用。在胞体中合成的蛋白质和细胞器需要通过轴突运输至突触前终末，以维持神经元功能。相应地，远端轴突接收到的信号也必须被转导并传递回胞体。这些过程对神经元的存活、分化和维持至关重要。由于某些神经元的轴突运输距离可超过胞体直径的1000倍以上，因此即使存在轻微的功能缺陷，也可能显著影响神经元及神经环路的功能。
脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中的一种生长因子，广泛存在于多种脑区，包括海马、大脑皮层和基底前脑。BDNF 通过支持参与认知环路的神经元的存活、分化及功能，在认知和记忆形成中发挥关键作用。BDNF 在轴突末梢与其受体酪氨酸激酶 TrkB 结合，激活 TrkB 介导的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）以及磷脂酶 C-γ（PLCγ）。参与这些信号通路的蛋白质被包装到内吞囊泡结构上，形成 BDNF/TrkB 信号内体1-6，随后通过逆行运输至神经元胞体。
微流控培养室是研究正常条件下以及损伤和疾病状态下轴突生物学的非常有用的平台7,8。通过将轴突与胞体分离，该装置使得研究人员能够特异性地研究轴突内的物质运输过程8-10。本研究中使用的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控平台，其微沟槽屏障宽度为450 μm，为商业购买产品（见材料&#160;表）。为了研究脑源性神经营养因子（BDNF）的运输，我们开发了一种新型技术以制备单生物素化BDNF（mBtBDNF）。我们利用了生物素受体肽AP（也称为AviTag），这是一种包含一个赖氨酸残基的15个氨基酸序列，可通过大肠杆菌（Escherichia coli）中的生物素连接酶BirA特异性地与生物素连接。我们通过PCR将AviTag融合至小鼠pre-proBDNF cDNA的C末端（图1A）。随后将该构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 myc-his中。同时，我们将细菌BirA的DNA也克隆至pcDNA3.1 myc-his载体中。将这两个质粒瞬时共转染入HEK293FT细胞，以同时表达两种蛋白。BirA催化生物素特异性地连接至BDNF C末端AviTag中的赖氨酸残基，以1:1的比例生成单生物素化的BDNF单体。从培养基中回收并使用Ni树脂纯化得到分子量约为18 kDa的生物素化成熟BDNF（图1C）。通过免疫印迹检测未发现未修饰的BDNF，表明BDNF的生物素化反应完全（图1D）。使用链霉亲和素偶联的量子点QD 655对mBtBDNF进行标记，从而制备QD-BDNF。AviTag的存在并不影响BDNF的活性，因为mBtBDNF能够像重组人BDNF（rhBDNF）一样有效激活磷酸化的TrkB（图1E），并促进神经突向外生长（图1F）。免疫荧光染色显示QD-BDNF在海马轴突中与TrkB共定位，表明QD-BDNF具有生物活性（图1G）。为研究BDNF的运输过程，将QD-BDNF加入含有大鼠E18海马神经元的微流控培养装置的远端轴突区（图2A）。通过实时活细胞成像观察红色荧光标记，记录了QD-BDNF在轴突内的逆行运输过程（支持视频&#160;S1、S2）。通过对生成的时空图（kymograph）进行分析，观察到QD-BDNF以约1.06 μm/sec的速度进行逆行运输（图3A）。此前已有研究使用GFP或mCherry标记的BDNF来追踪BDNF在轴突中的运动。其主要局限在于荧光强度不足以支持单分子水平的研究。此外，由于BDNF同时存在顺行和逆行运动，难以判断逆行运输的BDNF是否处于神经营养因子/受体复合物状态。
在本视频中，我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中观察QD-BDNF活体运输的技术。量子点具有极高的亮度和优异的光稳定性，使得对BDNF运输进行长期示踪成为可能。这些技术可用于加强阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）及其他神经退行性疾病中轴突功能的研究。

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT 细胞</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-高葡萄糖培养基</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 树脂</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>银染试剂盒&amp;nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>人重组 BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微流控小室</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 × 40 mm No. 1 玻璃盖玻片&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-链霉亲和素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>抗 Avi 标签抗体</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-琼脂糖微珠&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>&amp;nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>抗 pTrkB 抗体</td><td>由纽约大学 M. Chao 博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 TrkB 抗体</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

原代神经元中量子点标记的bdnf轴突运输的实时成像

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元存活、分化和功能的多个方面发挥着重要作用。轴突在结构和功能上的缺陷 increasingly 被认为是神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD））的早期特征。然而，诱导轴突损伤的机制尚不明确。我们报道了一种新型技术的开发，用于制备具有生物活性的单生物素化BDNF（mBtBDNF），可用于追踪BDNF的轴突运输。通过将量子点655与mBtBDNF偶联，制备了量子点标记的BDNF（QD-BDNF）。采用微流控装置将轴突与神经元胞体分离。将QD-BDNF加入轴突区后，可实现对BDNF在轴突中运输的活体成像。我们证实，QD-BDNF几乎完全进行逆向运输，移动过程中极少暂停，速度约为1.06 μm/sec。该系统可用于研究AD或HD以及其他退行性疾病中轴突功能障碍的机制。

生物活性单生物素化BDNF的制备与纯化
根据先前发表的方案10，构建了与AviTag序列（GGGLNDIFEAQKIEWHE）融合的BDNF表达载体。全长融合蛋白的预测分子质量约为32 kDa（<a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a>）。在HEK293FT细胞中表达并从条件培养基中纯化得到单生物素化成熟BDNF，其预测分子质量为18 kDa（图1A）10。
收集不同组分并经15% SDS-PAGE分离。使用兔抗Avi标签抗体进行检测，在第一组分中检测到一条分子量约为18 kDa的条带图1B）。为检测制备样品的纯度，采用SDS-PAGE分离样品，并进行银染染色。如图所示 图1C，18 kDa条带是第一次洗脱中的...

脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。

原代神经元中量子点标记的BDNF轴突运输的实时成像

BDNF 在神经元存活、分化和功能的多个方面发挥着重要作用。轴突在结构和功能上存在缺陷……

本实验的总体目标是通过活体成像技术追踪脑源性神经营养因子（BDNF）的逆行轴突运输过程。首先，将微流控装置组装在多聚赖氨酸包被的盖玻片上；第二步，分离 E18 大鼠海马神经元，并将其接种于微流控装置的胞体区室中。接下来，培养神经元，使其轴突穿过微沟延伸至培养室的轴突区。最后一步，将量子点标记的BDNF加入轴突区。最终，可通过荧光显微镜观察BDNF在海马神经元轴突内的运输情况。与现有的 B-D-F-E-G-I-P 或 BDFM 樱桃标记等方法相比，该技术的主要优势在于，使用量子点标记 BDF 可实现对轴突内单个 BDF 二聚体的光学成像，从而证明该操作步骤将要、应当进行。从我的左侧第三个点开始绘制一个后置点，首先用 1% aox 手动清洗微流控室，随后用 Milli-Q 水冲洗三次，每次 30 分钟。接着用 70% 乙醇手动清洗微流控室，将其置于洁净的层流罩内的 Parafilm 上晾干，再在紫外线下对微流控室的两侧进行 20 分钟的灭菌处理，最后将灭菌后的微流控室置于室温下、用 Parafilm 密封的无菌 15 厘米培养皿中保存。接下来，将 24 × 40 毫米的 1 号盖玻片置于 10% 盐酸中，在旋转摇床上过夜浸泡，随后用清水洗涤三次，每次 30 分钟。最后一次洗涤后，将每片盖玻片浸入 100% 乙醇中进行消毒，再在本生灯火焰上灼烧，然后于室温下干燥保存在无菌培养皿中。为了包被盖玻片，将其放入一个15厘米的培养皿中，然后每片上均匀覆盖0.7毫升0.01%的多聚赖氨酸（poly-L-lysine）。在组织培养超净台中孵育1小时后，用无菌水冲洗盖玻片三次，随后用真空泵干燥，并将其转移至一个6厘米的培养皿中。然后将一个已灭菌的微沟槽面朝下的培养腔室轻轻放置在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上。注意不要触碰微沟槽，使用微量移液器吸头轻轻按压腔室，使组装好的微流控腔室紧密密封。现在将两个 E17 至 E18 大鼠海马组织放入含有 2 毫升解剖缓冲液的 15 毫升锥形管中，并每次用 5 毫升解剖缓冲液冲洗组织三次。然后尽可能吸除洗涤液，加入 900 微升新鲜解剖缓冲液以消化组织。接着，向组织中加入 100 微升 2.5% 胰蛋白酶，并将试管置于 37 摄氏度水浴中。消化 10 分钟后，加入 100 微升 DNA 酶 I，立即使用火焰抛光的聚乙烯玻璃移液管轻柔吹打组织 5 到 10 次。加入 2 毫升铺板培养基以终止胰蛋白酶消化反应，并在组织培养罩中静置 5 分钟，使组织碎片沉降至试管底部。接下来，小心地将两毫升上清液转移至一个洁净的无菌15毫升锥形管中，并离心沉淀细胞。将沉淀物重悬于50微升铺板培养基中，计数后，取15至20微升细胞悬液加入微流控芯片的一个腔室中。将芯片孵育10分钟，使细胞贴附于盖玻片上，然后加入更多铺板培养基，填满芯片的两个腔室。孵育一天后，在胞体室和轴突室中均将铺板培养基更换为维持培养基。第三天时，海马神经元的轴突开始穿过微通道，通常在第五至第七天之间到达轴突室。在此期间，每次进行活体成像观察量子点标记的BDNF轴突运输前，每24至48小时更换一半的培养基为新鲜的维持培养基。在BDNF耗竭期间，每30分钟用不含BDNF和血清的Neurobasal培养基彻底冲洗微流控室的两个腔室，持续2小时；随后在冰上将50纳摩尔单生物素化BDNF二聚体与50纳摩尔量子点655标记的链霉亲和素缀合物在Neurobasal培养基中孵育60分钟。然后将轴突腔室中的培养基更换为300微升量子点标记的BDNF，在37摄氏度下孵育4小时，以最大限度减少量子点标记的BDNF向胞体腔室的扩散。在孵育结束、预热以及使用倒置显微镜时，必须始终保持胞体区室中的培养基液面高于轴突区室。显微镜需配备100倍油镜和环境培养室，以维持37摄氏度和5%二氧化碳的恒定温度，同时在设备预热过程中保持该条件。用缓冲液洗去微流控腔室中未结合的量子点标记的BDNF，然后使用一套Texas red激发和发射滤光片组来观察量子点655信号。最后，使用CCD相机以每秒一帧的速度对中间轴突区域进行延时成像，总时长为两分钟。使用无轴突且未标记量子点的微沟槽作为对照，以分析浸润情况，并利用适当的时间序列成像分析软件对量子点标记的BDNF信号运输进行分析。在大多数含有轴突的微沟槽中可观察到量子点信号，而在无轴突的微沟槽中则未检测到量子点信号，表明量子点信号从轴突区室向胞体区室的扩散极轻微或几乎不存在。一段长度为80微米的海马神经元轴突被荧光记录了100秒。共计六次。在成像过程中，清晰地观察到三个向细胞体单向移动的量子BDNF信号。其中一个信号被观察到在约70秒内平稳地向细胞体移动，穿过整个视野。另一个信号在前20秒内向逆向移动，随后在10至20秒内转为顺向移动，最后20秒再次改变方向，朝向细胞体移动。第三次事件也被观察到以逆行方向移动，但在运动过程中期暂停了约20秒。在此第一幅具有代表性的量子点标记BDNF运输的钟形图中，量子点标记的BDNF快速而平稳地向细胞体移动，在大约60秒内穿越了80微米的视野。在此第二幅时间记录图中，量子标记的BDNF以逆行方向移动，在120秒内行进了约50微米，并至少出现三次较长时间的停顿。最后，散点图测量了每个单个量子点标记的BDNF的运动速度、平均速度和暂停时间。量子点标记的BDNF运动速度相对较快，范围为0.47至1.97微米/秒，平均值为1.06 ± 0.05微米/秒。由于BDNF在运输过程中存在暂停现象，其平均速度显著低于运动速度，平均值为0.48 ± 0.03微米/秒，平均暂停持续时间为15.88 ± 1.30秒（发育完成后）。该技术可使神经科学领域的研究人员探索健康与疾病状态神经元中神经营养因子及其受体的转运过程。

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