在体外合成在人体细胞修饰蛋白表达的mRNA的感应

该程序的总体目标是体外合成修饰的 mRNA，以诱导细胞中的蛋白质表达。这是通过首先扩增质粒插入片段或编码 DNA 序列，并使用聚合酶链反应添加 120 个胸苷的 poly T 尾来实现的。第二步是将生成的 DNA 体外转录为带有多聚腺嘌呤尾部的 mRNA。

接下来，通过体外转录反应混合物的 D'S 处理去除模板 DNA。最后一步是对产生的 mRNA 进行南极磷酸酶处理，以去除 5 个引物磷酸盐。最终，细胞被生成的 mRNA、脂质复合物转染。

荧光显微镜和流式细胞术分析用于显示细胞中增强 GFP 的合成。与病毒转染等现有方法相比，该技术的主要优点是无法整合到宿主细胞基因组中，从而防止了肿瘤发生的风险。这种方法可以帮助在细胞中产生缺失或有缺陷的蛋白质，并可用于遗传疾病的疫苗接种治疗。

在再生医学领域，演示该程序的将是我实验室的一名研究生。在该程序开始之前，在大肠杆菌中扩增含有所需编码 DNA 序列或 CDS 的质粒，并按照方案文本中的说明进行分离。在这个例子中，感兴趣的 CDS 是增强的绿色荧光蛋白或 EGFP，以同时扩增并向 EGFP 的 CDS 添加多聚细节。

按照方案文本中的详细说明准备 PCR 混合物。将 PCR 管放入热循环仪中，并运行协议文本中描述的 PCR 循环方案。PCR 反应完成后，使用市售的 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 反应，并使用 20 μL 无核酸酶的水稀释 DNA。

为了检查 PCR 产物的质量，进行 DNA 凝胶电泳并在成像系统上观察 DNA 条带。在体外转录或 IVT 过程中，应检测到长度约为 1， 100 个碱基对的透明 DNA 条带。之前生成的 DNA 将被转录成 mRNA。

如图所示准备 NTP 帽类似物混合物。通过涡旋彻底混合 NTP 帽类似物混合物。然后旋转 按照下表所述简要组装 IVT 反应混合物。

轻轻上下吹打，充分混合 IVT 反应混合物。然后短暂离心 PCR 管以收集管底部的混合物。将 IVT 反应混合物在 37 摄氏度下在热混合器中孵育 3 小时。

3 小时后，向 IVT 反应混合物中加入 1 μL DNA 以去除模板 DNA。充分混合并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。使用 RNA 纯化试剂盒纯化反应混合物，并用 40 微升无核酸酶的水从离心柱膜上稀释修饰的 MR NA 两次，IVT 产生的修饰的 mRNA 必须用磷酸酶处理以去除五个引物三磷酸盐，这可能导致免疫激活。

要开始此程序，请将 9 微升 10 x 南极磷酸酶反应缓冲液添加到 79 微升纯化的 mRNA 溶液中。随后，加入 2 μL 南极磷酸酶并轻轻混合样品。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

30 分钟后，使用 RNA 纯化试剂盒纯化反应混合物，并用 50 μL 无核酸酶的水将离心柱膜上的修饰 mRNA 稀释两次。测量修饰的 mRNA 的浓度后，通过添加不含核酸酶的水将浓度调节至 100 ng/μL。通过 RNA 凝胶电泳检查合成的修饰 mRNA 的质量，并在 UV 反式照明器上可视化分子量标准和 mRNA 禁令。

应检测到长度约为 1， 100 个碱基对的透明 mRNA 条带。通过铺板两次制备 HEC 2 9 3 细胞，以便用合成的修饰 mRNA 转染。将 12 孔板每孔的 5 个细胞居中，将细胞在 37 摄氏度下在细胞培养箱中孵育过夜第二天，细胞应达到 80% 至 90% 汇合。

生成用于转染的 lipo 丛。准备足够的转染混合物，用于所有要转染的孔 12 孔板的每个孔需要 2.5 μg 修饰的 mRNA、2 μL 脂质体转染试剂和 473 μL 选项 1。减少血清培养基。

通过移液作为阴性对照轻轻混合组分。制备不含 Mr.NA 的转染混合物，在室温下孵育转染混合物 20 分钟以生成脂质复合物。用于转染。

用 500 μL DPBS 洗涤细胞。向 12 孔板的每个孔中加入 500 微升转染混合物，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞 4 小时，4 小时后吸出转染混合物并加入 1 毫升完全细胞培养物。培养基到每个孔中的细胞中。

将细胞在细胞培养箱中孵育 24 小时。随后使用荧光显微镜对细胞进行荧光显微镜分析，以制备用于流式细胞术的细胞。从孔中取出细胞培养基，并用不含钙和镁的 DPBS 洗涤每个孔。

每孔添加 500 μL TRIPSIN EDTA，以将细胞从细胞培养板表面分离。随后，每孔加入 500 μL 胰蛋白酶中和溶液灭活，将胰蛋白酶离心 5 分钟，在 300 倍 G 室温下离心分离的细胞。去除旋后 Reese，将细胞上颚悬浮在 150 μL 细胞固定液中，并将细胞悬液转移到流式细胞术管中。

使用荧光强度的几何平均值分析表达 EGFP 的细胞的百分比和荧光强度。如方案文本所述，还通过在转染后 1 天、2 天和 3 天对表达 EGFP 的细胞进行流式细胞术分析来评估蛋白质表达随时间的变化，通过转染 HEC 2 9 3 细胞来测试生成的 EGFP mRNA 的功能。转染后 24 小时使用荧光显微镜检测细胞中 EGFP 的产生。

在这里，细胞的面部对比图像显示在细胞的荧光图像旁边。转染后 24 小时，流式细胞术也检测细胞中 EGFP 的表达。粉色线代表没有 mRNA 的细胞，转染，蓝线代表 EGFP 阳性细胞。

EGFP mRNA 转染后，93.91% 的检测细胞为阳性，荧光强度的几何平均值为 720.16。通过在 mRNA 后 1 天、 2 天和 3 天测量 EGFP 表达来评估 HC 2 93 细胞中蛋白质表达的持续时间。转染后 24 小时，转染蛋白在细胞中的表达最高。

第二天每天减少 1.6 倍，但即使在三天后，细胞中也含有 EGFP 一旦掌握。如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。观看此视频后，您应该对如何产生稳定的修饰 mRNA 以在细胞中诱导所需蛋白质表达有很好的了解。