体外合成修饰mRNA以诱导人细胞中蛋白质表达

本实验的总体目标是体外合成修饰的mRNA，以诱导细胞中蛋白质的表达。首先通过聚合酶链式反应扩增质粒插入片段或编码DNA序列，并添加由120个胸苷组成的poly T尾。第二步是将获得的DNA在体外转录为带有poly A尾的mRNA。

接下来，通过 D'S 处理体外转录反应混合物以去除模板 DNA。最后一步是使用南极磷酸酶处理所生成的 mRNA，以去除 5' 磷酸基团。最终，将生成的 mRNA 脂质复合物转染至细胞中。

荧光显微镜和流式细胞术分析可用于显示细胞中增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的合成。与现有的病毒转染等方法相比，该技术的主要优势在于不会整合到宿主细胞基因组中，从而避免了致癌风险。该方法可用于在细胞中产生缺失或有缺陷的蛋白质，并可用于遗传性疾病的疫苗治疗。

在再生医学领域，将由我实验室的研究生 steinle 演示该实验操作。在开始本操作之前，已按照方案文本中所述方法，在大肠杆菌中扩增并分离了包含所需编码 DNA 序列（CDS）的质粒。在本示例中，目标 CDS 为增强型绿色荧光蛋白（EGFP），以同时扩增 EGFP 的 CDS 并在其上添加 poly A 尾。

按照方案文本中所述配制PCR反应体系。将PCR管放入热循环仪中，并运行方案文本中描述的PCR扩增程序。PCR反应完成后，使用 commercially available 的PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并用20 µL无核酸酶的水稀释DNA。

为了检测PCR产物的质量，进行DNA凝胶电泳，并在成像系统上观察DNA条带。在体外转录（IVT）过程中，应检测到一条长度约为1,100个碱基对的清晰DNA条带。此前生成的DNA将被转录为mRNA。

按此处所示配制NTP帽类似物混合液。通过涡旋充分混匀NTP帽类似物混合液。然后短暂离心。按照本表所述，初步配制体外转录（IVT）反应混合液。

轻轻吹打混合体外转录反应体系。然后短暂离心PCR管，使混合液聚集于管底。将体外转录反应体系于37°C恒温混匀仪中孵育三小时。

三小时后，向体外转录（IVT）反应体系中加入一微升 DNase，以去除模板 DNA。充分混匀后，在 37°C 下孵育 15 分钟。使用 RNA 纯化试剂盒纯化反应产物，并用 40 微升无核酸酶水将从离心柱膜上洗脱的修饰 mRNA 溶液稀释两倍。通过 IVT 生成的修饰 mRNA 必须经过磷酸酶处理，以去除 5′ 三磷酸基团，避免引发免疫反应。

开始此操作时，向79 µL纯化的mRNA溶液中加入9 µL的10 x Antarctic磷酸酶反应缓冲液。随后，加入2 µL Antarctic磷酸酶，并轻轻混匀样品。将混合物在37°C下孵育30分钟。

30分钟后，使用RNA纯化试剂盒纯化反应混合物，并用50微升无核酸酶水将旋转柱膜上的修饰mRNA洗脱两次。测定修饰mRNA浓度后，加入无核酸酶水将其浓度调整至100纳克/微升。通过RNA凝胶电泳检测合成的修饰mRNA的质量，并在紫外透射仪上观察marker和mRNA条带。

应检测到一条大小约为 1,100 个碱基对的清晰 mRNA 条带。通过两次传代培养，将 HEC 2 9 3 细胞接种于 12 孔板中，每孔接种五细胞，于 37 摄氏度细胞培养箱中过夜培养。次日，细胞应达到 80% 至 90% 的融合度。

制备用于转染的脂质复合物。为所有待转染的孔准备足量的转染混合液，每孔12孔板需要2.5微克修饰mRNA、2微升脂质转染试剂和473微升OptiOne。使用减血清培养基。

轻轻吹打混合各组分作为阴性对照。制备不含 Mr.NA 的转染混合物，在室温下孵育转染混合物 20 分钟以形成脂质复合物。用于转染。

每孔加入 500 微升 DPBS 洗涤细胞。向 12 孔板的每孔中加入 500 微升转染混合物，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育细胞 4 小时。孵育 4 小时后，吸除转染混合物，并向每孔细胞中加入 1 毫升完全细胞培养基。

将细胞置于细胞培养箱中孵育24小时。随后使用荧光显微镜对细胞进行荧光显微分析，以准备进行流式细胞术。从孔中移除细胞培养基，并用不含钙和镁的DPBS洗涤每个孔。

每孔加入 500 微升 TRIPSIN EDTA，使细胞从细胞培养板表面脱落。随后，每孔加入 500 微升胰蛋白酶中和液以终止胰蛋白酶活性，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟，使脱落的细胞沉淀。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于 150 微升细胞固定液中，并将细胞悬液转移至流式细胞术检测管中。

使用荧光强度的几何平均值分析表达EGFP的细胞百分比及荧光强度。根据方案文本所述，在转染后第1、2、3天通过流式细胞术分析EGFP表达细胞，以评估蛋白表达随时间的变化。通过将生成的EGFP mRNA转染至HEK 293细胞来检测其功能。转染24小时后，采用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达。

此处展示了细胞的明场对比图像及其对应的荧光图像。转染后24小时，通过流式细胞术检测了细胞中EGFP的表达。粉线代表未加mRNA和未转染的细胞，蓝线代表EGFP阳性细胞。

EGFP mRNA 转染后，所有检测细胞中阳性细胞占93.91%，荧光强度的几何平均值为720.16。通过在mRNA转染后1天、2天和3天检测EGFP表达水平，评估HC 2 93细胞中蛋白表达的持续时间。转染后24小时，细胞中的蛋白表达水平最高。

此后每天减少1.6倍，但即使经过三天，细胞中仍含有EGFP。一旦掌握，该技术可在两天内完成。观看本视频后，您应充分理解如何制备稳定的修饰mRNA，以诱导细胞中目标蛋白的表达。