焦时间推移成像为牙科复合材料的细胞相容性评价的有效方法
November 9th, 2014
牙科用复合材料的生物相容性研究最多的方面是其细胞毒性三维CLSM时间推移成像结合的荧光信号的量化允许细胞命运的敏感性评价随时间。利用这种方法可能是一种有效的工具，以评估牙科复合材料的相容性。
该程序的总体目标是使用 3D 共聚焦激光扫描显微镜进行延时成像，以定性和定量地评估牙科复合材料的体外生物相容性。这是通过在第二步中首先采集未固化牙科复合材料的球形样品来实现的。在存在或不存在这些复合提取物的情况下培养人牙龈成纤维细胞，然后用活死染色标记细胞。
然后生成细胞培养物的图谱图像，并为感兴趣的区域创建叠加图像。最终，可以根据图像中观察到的绿色或红色荧光信号的变化来监测在存在或不存在测试复合材料的情况下发生的细胞行为的实时差异。与现有方法相比，该技术的主要优点是它允许实时监测活细胞而不会诱导细胞结构的变化。
细胞染色后或延时观察前不需要固定或干燥步骤。为了制备复合提取物，首先使用半径为 2 毫米的定制支架形成未固化牙科复合材料的球形样品。将样品转移到含有 1 毫升培养基的六孔板的各个孔中，注意留下一些带有培养基的孔用于对照细胞培养，然后在样品的 0.5 毫米范围内布置一个强度为 1070 毫瓦平方厘米的 LED 灯。
将样品固化 40 秒，以模拟牙齿与未护理的牙科复合材料之间的临时接触，然后将复合样品在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 24 小时。每三天更换一次培养基，每五天传代一次细胞。然后在培养物达到共流度后，收获细胞并在 90 倍 G 和 37 摄氏度下旋转 5 分钟。
将沉淀重悬于培养基中，然后在细胞计数后，将细胞悬液以 2.5 倍 10 至第四个细胞/毫升的细胞密度接种在腔室载玻片系统中，在 37 摄氏度下，在 5% 二氧化碳气氛中过夜。第二天早上，用 1 毫升测试的复合提取物替换腔室载玻片两个孔中的培养基，然后将载玻片放回培养箱中，通过共聚焦对细胞进行成像。延时成像。
首先根据制造商的说明，用真核细胞的活死细胞毒性染色剂标记复合共培养和对照细胞。染色后 15 分钟，在细胞培养条件下，将腔室载玻片置于共聚焦集成室的黑暗中，并预热 473 纳米和 559 纳米激光器。接下来，使用具有新开发光谱的探测器自动设置 473 纳米激光器的成像条件。
使用取景和缩放功能选择感兴趣的区域，然后选择观察模式。根据需要选择多达五种类型的观察模式，包括延时 Zack 和多区域，然后在获取所需图像后，在 10 倍物镜下使用 473 纳米激光快速捕获测试样品和对照细胞的 5 张地图图像。切换到 559 纳米激光器并在第二次荧光时捕获细胞的图像，如刚才所示。
或者，使用 X 60 实时屏幕上的选定点叠加荧光和光对比图像，以观察实时图像存储。用于信号分析的 Olympus 图像格式的映射图像和最大投影图像为每像素 24 位。然后，TIFF 文件使用不同的分析工具来测量信号的强度分布和两个荧光通道之间的强度比。
最后，使用适当的软件分析两组之间荧光细胞信号传导的差异。在这些单独在培养基中或暴露于复合提取物中的活 TED 染色细胞的图谱图像中，在延时 15 分钟后未观察到细胞活力的差异。在这里，对照细胞的最大投影图像显示了细胞在前 15 分钟内的放大命运，5 小时后，在延时期结束时观察到，对照细胞内的荧光在孵育期内没有显着变化。
ELS 超低收缩暴露细胞具有与对照细胞相似的纺锤体形态，但在延时周期结束时，绿色荧光信号略有降低，红色荧光略有增加。这些图表说明了染色细胞的强度分布，其中以 1 小时的间隔在对照和复合暴露细胞上测量钙内皮同源二聚体 1 荧光发射强度，持续长达 5 小时。在两种培养物之间未观察到信号传导的显著差异。
对照细胞和暴露的复合细胞的活力比如表所示。在测试复合材料存在下，发现接触 1 小时后，活细胞的百分比从 100% 略微下降到 93.9%，再接触 5 小时。尽管复合材料无细胞毒性，但在测试的复合 ELS、超低收缩率和阴性对照细胞培养物之间观察到细胞活力的显着差异。
目前的数据强调了共聚焦延时成像作为一种准确且灵敏的方法来评估牙科复合材料开发后接触的成纤维细胞行为。该方法为毒理学领域的研究人员探索牙科材料、药物、化学物质和其他医疗器械的细胞毒性和风险评估提供了私人方式。
概述
本研究采用3D共聚焦激光扫描显微镜进行时间序列成像，以评估牙科复合材料的生物相容性。该方法允许实时监测细胞在复合材料提取物存在下的行为，提供细胞毒性的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物相容性
- 细胞毒性评估
- 牙科材料
背景
- 细胞毒性是评估牙科复合材料的关键因素。
- 3D CLSM成像提供了一种监测细胞命运的敏感方法。
- 活死细胞染色允许评估细胞活力。
- 现有方法可能会改变细胞结构，限制其有效性。
研究目的
- 评估牙科复合材料的体外生物相容性。
- 监测细胞对复合材料提取物反应的实时行为。
- 比较暴露于复合材料的细胞与对照组的活力。
使用的方法
- 制备未固化牙科复合材料的球形样品。
- 用复合材料提取物培养人牙龈成纤维细胞。
- 活死细胞染色以评估细胞活力。
- 3D CLSM用于捕获细胞培养的时间序列图像。
主要结果
- 最初观察到对照组和暴露于复合材料的细胞之间没有显著的活力差异。
- 暴露于复合材料后，活细胞百分比略有下降。
- 实时成像显示各组之间细胞形态相似。
- 共聚焦成像证明有效用于评估成纤维细胞与牙科材料接触的行为。
结论
- 3D CLSM是评估牙科复合材料细胞毒性的有价值工具。
- 该方法允许详细观察活细胞动态。
- 研究结果有助于牙科材料的风险评估。
常见问题
Executive Industry Relevance
Confocal time-lapse imaging enables high-resolution, real-time assessment of cytocompatibility for dental composites, supporting early de-risking of material candidates. This approach provides quantitative viability data critical for portfolio triage and predictive confidence in preclinical material selection. Integrating sensitive live/dead cell analysis at the discovery stage reduces late-stage biological risk and informs go/no-go decisions for dental biomaterial development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of material-cell interactions for functional biocompatibility assessment.
- Supports biological de-risking by quantifying cytotoxicity in primary human cell models.
- Provides predictive confidence for advancing dental composites with favorable cytocompatibility profiles.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated cell-based assays for downstream material screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative viability outputs using live/dead staining and confocal imaging.
- Enables reliable evaluation of candidate materials for cytotoxicity prior to broader screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cytocompatibility data with translational risk assessment for dental biomaterials.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing sensitive, quantitative endpoints.
- Reduces mechanistic ambiguity in material selection for further development.
Pipeline & Workflow Integration
This confocal imaging workflow positions cytocompatibility evaluation at the interface of early discovery and preclinical material selection, enabling risk-adjusted advancement of dental composites.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for material-cell compatibility.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative viability measurements for candidate triage.
- Analytics: Generates high-content, time-resolved viability and morphology data for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical risk assessment for dental biomaterials.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cytocompatibility evaluation across diverse material candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in material selection.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible cytocompatibility assessments.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dental biomaterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and compatible analysis software.
- Demands cross-team standardization of cell culture and staining protocols.
- May require adaptation for different cell types or material systems.
- Limited to in vitro cytocompatibility; does not address in vivo or long-term effects.
