共聚焦时间序列成像作为牙科复合材料细胞相容性评价的高效方法

本实验的总体目标是利用三维共聚焦激光扫描显微镜进行延时成像，从而对牙科复合材料的体外生物相容性进行定性和定量评估。首先在第二步中制备未固化牙科复合材料的球形样品。将人牙龈成纤维细胞在有或无这些复合材料浸提液的条件下进行培养，随后使用活死染色法对细胞进行标记。

随后生成细胞培养物的图谱图像，并针对感兴趣区域创建叠加图像。最终，可根据图像中观察到的绿色或红色荧光信号的变化，实时监测在存在或不存在待测复合材料条件下细胞行为的真实差异。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可在不引起细胞结构改变的情况下实现对活细胞的实时监测。

细胞染色后或进行延时观察前，无需进行固定或干燥步骤。制备复合树脂提取物时，首先使用半径为2毫米的定制夹具制备未固化牙科复合树脂的球形样品。将样品转移至六孔板的各个孔中，每孔含有1毫升培养基，并注意留出若干孔仅加入培养基作为对照细胞培养。然后将LED灯置于距离样品0.5毫米范围内，光照强度为1070毫瓦/平方厘米。

将样品固化40秒，以模拟牙齿与未处理的牙科复合材料之间的短暂接触，然后将复合材料试样置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育24小时。每三天更换一次培养基，每五天传代一次细胞。当培养细胞达到汇合状态后，收集细胞并在37摄氏度下以90 × g离心5分钟。

将沉淀重悬于培养基中，计数细胞后，以每毫升2.5×10⁴个细胞的密度将细胞悬液接种至腔室载玻片系统中，在37°C、5% CO₂气氛条件下培养过夜。次日早晨，将腔室载玻片中两个孔的培养基更换为1 mL待测复合材料提取物，并将载玻片放回培养箱中，通过共聚焦显微镜进行细胞成像。进行延时成像。

首先，根据试剂生产商的说明，使用活死细胞毒性染色剂对共培养的复合细胞及对照细胞进行染色。染色后15分钟，将培养腔载玻片置于共聚焦整合腔内，在细胞培养条件下避光放置，并预热473纳米和559纳米激光器。接着，使用配备新开发光谱检测器的探测器，自动设定473纳米激光的成像条件。

使用构图和缩放功能选择感兴趣的区域，然后选择观察模式。根据需要选择最多五种观察模式，包括延时Zack和多区域模式，接着在10倍物镜下用473纳米激光快速获取测试样本和对照细胞的五张图像。当获得所需图像后，切换至559纳米激光，按照前述方法捕获细胞在第二荧光通道下的图像。

或者，使用 X 60 实时屏幕上的选定位置，将荧光图像与明场对比图像叠加，以观察实时图像存储。用于信号分析的奥林巴斯图像格式地图图像以及最大投影图像均为每像素 24 位。随后将 TIFF 文件利用不同的分析工具，测量信号的强度分布以及两个荧光通道之间的强度比。

最后，使用适当的软件分析两组之间荧光细胞信号的差异。在这些仅含培养基或暴露于复合材料提取物的活体TED染色细胞的图像中，在延时成像开始15分钟后未观察到细胞活力存在差异。此处，对照组细胞的最大投影图像显示了细胞在延时成像开始后前15分钟内的放大状态，以及五小时后即延时成像结束时的状态；结果显示，在整个孵育期间，对照组细胞内的荧光未发生显著变化。

ELS超低收缩性暴露细胞呈现出与对照细胞相似的纺锤形形态，但在延时成像结束时，绿色荧光信号略有减弱，红色荧光则略微增强。这些图表展示了染色细胞的强度分布，其中在长达五小时的时间内，每隔一小时测量一次对照组和复合材料暴露组细胞的钙调内皮同源二聚体1荧光发射强度。两组培养细胞之间的信号传导未观察到显著差异。

对照组和暴露组复合材料细胞的存活率比例如表所示。在接触测试用复合材料后，活细胞百分比在接触一小时后从100%略微下降至93.9%，五小时后进一步变化。尽管该复合材料无细胞毒性，但在测试用复合材料ELS（超低收缩性）与阴性对照细胞培养物之间，细胞活力仍存在显著差异。

现有数据强调了共聚焦时间序列成像作为一种精确且灵敏的方法，可用于评估牙科复合材料制备后与牙龈成纤维细胞接触时的细胞行为。该方法为毒理学领域的研究人员探索牙科材料、药物、化学物质及其他医疗器械的细胞毒性与风险评估提供了有效途径。