对基因差异表达的RNA序列中电穿孔鸡胚脊髓分析

该程序的总体目标是评估电穿孔雏鸡胚胎脊髓的所有基因和样本的表达水平。这是通过首先在卵中，在早期胚胎神经管的右侧钻孔并将胚胎重新孵化到所需的阶段来完成的。该程序的第二步是在无 RNA 的环境中解剖成功转染的神经管半部分，并尽快进行裂解。

第三步是分离 RNA，并将样品进行文库制备和高通量测序。最后一步是处理数据集以去除测序伪影。将品种映射到基因组并为每个基因分配表达水平。

最终，结果可以通过比较对照和实验条件下的表达水平来显示差异表达的基因。这种方法的视觉演示作为神经管解剖至关重要。步骤很难学习，因为我们需要熟悉胚胎作。

为了进行此演示，胚胎已在神经管处使用表达 GFP 的构建体进行转化。准备花两个小时处理最多 10 个胚胎，每个胚胎收集 1 到 2 微克的总 RNA。在无 RNA 的条件下，使用精细解剖剪刀收获胚胎，并使用 SVE 收集勺将每个胚胎转移到冷处。

DEPC 处理。PBS 对所有神经管分离步骤都使用了一种解决方案，方法是使用细镊子去除肢芽之间胚胎的整个侧面区域。将此切片移至新鲜的冷溶液中，组织背面朝上。

用两根细玻璃针在神经管和胎旁中胚层之间的胚胎背侧侧穿孔三个点。现在将两根玻璃针引入中央穿孔，并沿 AP 轴将它们分开。根据需要通过每个穿孔执行此作，以最终分离 Paral Mesoderm，去除并丢弃该组织。

接下来，将胚胎侧向转动，并在神经管和结索之间引入两个镊子的尖端。沿 AP 轴将它们分开以划分结构。用镊子轻轻固定神经管，同时用镊子去除多余的中胚层，完成从神经管中去除较大的 meder 组织。

然后轻轻地将神经管转移到新鲜的冷溶液中。使用带有手动泵的玻璃移液器，收集所有需要的神经管并在继续之前将它们保存在冰上。现在，将每个神经管分成两半。

将锋利的尖镊子插入管腔并撕开屋顶板。然后用镊子切开地板，将纸巾分成两半。使用荧光解剖显微镜，将电穿孔的一半与非电穿孔的一半分选。

将分选后的神经管两半转移到装有新鲜溶液的 1.5 mL 试管中。轻弹这些管子，使所有组织都下降到底部。接下来，将试管以 100 GS 离心几秒钟。

然后在明亮的灯光下非常小心地吸出 snat。如果组织被抽出，请慢慢弹出并重复旋转。清除神经管两半的溶液后，每个神经管加入 70 μL，向管中加入一半的裂解缓冲液。

轻弹试管并在室温下每 5 分钟孵育 15 分钟，剧烈涡旋试管并继续收集 RNA 以纯化 RNA 进行测序，每个样品至少有八个神经管半部。其他储存在零下 80 摄氏度的 lyce 神经管集合可以汇集到集合中。首先将它们在冰上解冻 15 到 30 分钟，然后在室温下完成解冻。

解冻后，用力涡旋所有样品，静置 5 分钟。然后再次涡旋样品，并以 15， 000 GS 离心 1 分钟。为了去除不溶性物质，将上清液转移到新试管中并继续提取。

使用 RNA 分离试剂盒，通过以尽可能高的浓度逃避 RNA 来完成该过程。此协议需要 Galaxy 网站帐户来确保所需的空间配额。首先，FTP 将 FASTQ 文件上传到站点，除非质量分数已经以 Shred 加 33 编码。

首先，使用 NGS QC and Manipulation 菜单下的 FASTQ groomer 工具准备上传的数据集。否则，在 attributes （属性） 下，将文件类型更改为 FASTQ sender （FASTQ 发件人）。接下来，在 NGS QC and Manipulation 菜单下，使用 FAST QC 工具分析数据集的一般质量。

在同一菜单下选择 FASTQ 质量修剪器以丢弃三个低质量的素糖端。应处理 20 分或以上的质量分数。现在转到同一菜单下的剪辑工具。

设置此工具以丢弃碱基对数少于 45 个的读数。输入适配器序列。禁用丢弃未知碱基读取的选项，并选择输出以包括剪切和未剪切序列。

继续使用 trim sequences （修剪序列） 工具。使用它来修剪读数的第一个碱基，以消除 FAST qc 检测到的五个引物序列偏差。下一步是从 Illumina I 基因组站点下载并解压缩最新的鸡基因组组装。

然后将全基因组 faster 格式文件和基因的注释 GTF 格式文件上传到 Galaxy History。现在，通过访问 N-G-S-R-N-A 分析菜单并选择 top hat two 工具，将每个样品的读数映射到基因组。从 Galaxy History 中选择上传的 fasta 文件作为参考基因组。

接下来，选择同一菜单下的袖扣工具以构建预测的转录组。对于每个示例，选择要用作参考注释指南的 GTF 文件。为序列数据选择 Perform bias correction using the FASTA file 并启用 use multi read correction 选项。

然后使用 cuff 合并工具合并所有组装转录组。使用此工具，为参考注释选择 GTF 文件，为序列数据选择 FASTA 文件。现在使用仍在 RNA 分析菜单下的袖带 TIFF 工具比较每个样品的顶帽 2 生成的 BAM 文件。

在 transcripts 字段中，选择由 cuff merge 生成的合并转录组并启用选项。使用多重读取校正，并使用 FASTA 文件对序列数据执行偏差校正。下一步是对差异表进行排序 使用 Q 值列，从筛选和排序菜单中选择排序工具。

实验条件之间具有显著差异的序列在第 13 列的 Q 值最低。现在看一下覆盖率图。首先，使用选项下 bed tools 菜单下的转换工具将 BAM 文件转换为层平面图文件，禁用无覆盖区域的报告，并选择将拼接条目视为不同的间隔。

此外，按标准化实验中所有覆盖率的因子缩放覆盖率。然后使用转换格式菜单中的工具将生成的床图文件转换为 big wig 格式，并将 big wig 文件作为自定义轨道上传到 UCSE 服务器。在 USCS 基因组浏览器页面上，使用 GAL 四个组装和基因搜索，使用所描述的方法获取表达空 PS 载体的神经管来获取其 RNA 的数据集。

此作一式两份，所得 RNA 质量非常高，最佳 RIN 值为 10，符合预期。重复的空载体对照的转录组的全局比较显示没有明显差异，Pearson 相关系数为 99 点。此外，在表达 scratch 两个锌指结构域的实验样品中，映射到 scratch two 基因序列的读数数量明显增加。

因此，这些方法足够敏感，可以检测到预测的富集。观看此视频后，您应该能够分离胚胎神经管，并按照协议第四部分中的硅分析步骤处理和比较 IC 数据集以找到差异表达的基因。