Name: 传播 Homalodisca coagulata病毒01通过 Homalodisca vitripennis细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 了解在玻璃翅叶蝉细胞培养中繁殖Homalodisca coagulata病毒01的实验方法。本研究通过qRT-PCR定量分析病毒RNA，评估细胞存活率，为研究病毒复制机制和病毒-宿主相互作用提供可靠的体外模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢德克萨斯州皮尔斯病研究与教育计划项目以及美国农业部动植物卫生检验局（USDA-APHIS）为本项目提供的资金支持。我们还要感谢位于泰勒市的德克萨斯大学健康科学中心的Hema Kothari在共聚焦显微镜技术方面提供的协助。

1. 细胞培养
注意：实验所用的玻璃木虱（Homalodisca vitripennis）细胞系由美国农业部农业研究局（美国佛罗里达州皮尔斯堡）Wayne Hunter 博士实验室建立，用于启动一个包含多种细胞阶段（包括初始成纤维细胞和单层细胞）的实验室细胞库。
<ol>
	<li>在温度为20–24 °C、保持无菌的实验室环境中进行以下操作，操作空间高度为25 cm2 培养瓶</li>
	<li>在25 cm²培养瓶中培养并维持细胞培养物2 使用H2G+叶蝉培养基（一种改良的WH2蜜蜂培养基）的组织培养瓶10 (表1).</li>
	<li>在24 °C、相对湿度约53%的条件下培养细胞培养瓶。</li>
	<li>使用倒置显微镜在100倍总放大倍数（TM）下监测培养物生长情况， 例如， 检查是否存在异常的细胞生长，监测潜在污染物，并观察培养表面的生长进展情况。</li>
	<li>每7至10天进行一次完全换液（每瓶约4 ml培养基），操作时避免扰动培养表面。</li>
	<li>当培养表面细胞生长（融合度）达到约80%时，使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化细胞进行传代。每个培养瓶中加入约2–3 ml胰蛋白酶，酶作用时间宜短（5–10分钟），以实现细胞完全解离。</li>
	<li>向培养瓶中加入等量的新鲜培养基（约 2 - 3 ml），以终止酶活性，然后将全部溶液转移至锥形离心管中进行离心。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 6 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，向每根试管中加入约 8 ml 新鲜培养基。用移液器轻轻重悬细胞。</li>
	<li>以1:2的比例分种培养物至25 cm培养瓶中2 培养瓶（每瓶约4 ml细胞悬液），并将新传代的培养物静置48小时，以使悬浮细胞牢固贴附于培养瓶表面。 
	注意：在具有1 cm²生长表面积的48孔无菌组织培养板中培养细胞2 也可以采用这种方式，并以与培养瓶相同的方式进行维持，仅需将培养基体积减少至约250 μl。</li>
</ol>
2. 全病毒提取
<ol>
	<li>匀浆化病毒阳性个体的整个身体 H. vitripennis 在 pH 约为 7.2 的磷酸盐缓冲液中，加入 0.02% 三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠（DETCA），通过涡旋振荡，每次约 10 秒，直至组织中不再有明显的大块团状物。通过超速离心提取病毒，条件为 4 °C 下 124,500 × g 离心 4 小时，或 4 °C 下 22,000 × g 离心 16 小时。若顶部出现沉淀物，用无菌棉签将其去除。11.</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>收集沉淀，并用5 ml含0.4%脱氧胆酸钠和4%聚乙二醇十六醚（Brij 52）的10 mM磷酸盐缓冲液（不含DETCA），pH约7.2，溶解。
	<ol>
		<li>为了充分混匀沉淀，将沉淀从管壁上取下，必要时研磨至完全溶解于溶液中。</li>
		<li>根据需要，以约 5 ml 为增量加入更多 10 mM 磷酸盐缓冲液，以帮助沉淀溶解，并将溶液合并至 2 支离心管中11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>300 × g 离心 15 分钟11.</li>
	<li>移除上清液，并将溶液通过 0.45 μm 滤膜，收集滤液至大收集管中11.</li>
	<li>将滤液转移至截留分子量（MWCO）为3.5 kD的透析膜中，必要时使用少量含10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）且不含DETCA的溶液11.</li>
	<li>将透析膜放入盛有去离子水的大烧杯中2O，4 °C 下孵育。更换 ddH2每小时震荡一次，持续5至6小时，直至膜上形成白色沉淀11.</li>
	<li>从膜内收集纯化的病毒，并将100%病毒溶液进行10倍梯度稀释：取10 μl溶液加入90 μl ddH₂O中2随后，将10 μl该稀释液加入另一份90 μl的ddH₂O中。2O，直至达到1:100,000的稀释度。</li>
	<li>将病毒溶液于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 病毒复制
<ol>
	<li>在48孔培养板中接种细胞，所有孔继续培养至细胞生长达到80%融合度（若细胞以平均速度生长，约在传代后72小时）。</li>
	<li>待细胞生长至汇合时，用梯度稀释的病毒接种每行细胞。 即， 一排1:10稀释液，一排1:100稀释液 等等。，除最上一排外。将最上一排作为对照，并加入 10 μl ddH₂O2O 作为体积对照加入每个孔中。
	<ol>
		<li>为建立用于与实验细胞计数进行比较的起始细胞浓度基线，在对培养物中任何孔进行初次病毒接种之前，先对每行的第一个孔进行消化并计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒接种后每24小时观察一次培养板，注意培养基颜色变化（提示pH改变）以及细胞形态的任何变化。</li>
	<li>在每个时间点，使用倒置显微镜以100倍透射光模式拍摄检测板的一列图像。</li>
	<li>在每个24小时时间点成像后，从柱中移除全部培养基，短期储存于-20 °C用于RNA提取和病毒定量，或长期储存于-80 °C。</li>
	<li>按照之前步骤中所述去除培养基后，从孔板中分离细胞 1.6 – 1.9，仅使用约 250 μl 的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 及约 250 μl 新鲜培养基终止酶活性，并用约 250 μl 新鲜培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>向每管含有细胞的溶液中加入10 μl 0.4%台盼蓝染液，用于在为期一周的实验期间每个24小时时间点细胞解离后的细胞计数。染色后静置10分钟，再进行细胞计数。
	<ol>
		<li>染色后1小时内进行细胞计数，否则活细胞也会开始摄取染料，与死细胞一样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器缓慢向标准血细胞计数板的两侧各加入10 μl染色后的细胞悬液。让溶液通过毛细作用自然吸入，以避免产生气泡。</li>
	<li>在血细胞计数板两侧计数活细胞（未染色细胞）的数量（相当于血细胞计数板中16个方格中的4个方格的计数）。对已移除的列中每个孔的细胞进行计数。</li>
	<li>取每列细胞计数的平均值，使用以下公式计算总细胞数：（平均细胞数 / 4）× 稀释倍数 = 细胞数量 × 104 毫升。这是培养物中的细胞密度或活细胞数量。</li>
</ol>
4. 从细胞培养物中提取病毒
<ol>
	<li>按照之前步骤 1.6 – 1.8 所述方法，从培养瓶中收集经处理的 H. vitripennis 细胞，仅使用约 250 μl 的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 及新鲜培养基以终止酶活性。</li>
	<li>弃去上清液。</li>
	<li>按照之前步骤 2.3 – 2.8 所述方案，从培养细胞中提取病毒。</li>
</ol>
5. RNA 提取
<ol>
	<li>根据制造商提供的针对液体样本的硫氰酸胍-酚-氯仿提取法操作说明，从每次为期一周的病毒试验中采集的培养基样本中提取RNA。</li>
	<li>将提取的样本储存在-80 °C条件下。</li>
</ol>
6. 逆转录 PCR
<ol>
	<li>使用来自全虫H. vitripennis的病毒分离物，采用引物对HoCV RT-PCR引物1（正向5′-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3′，反向5′-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3′）进行常规PCR，建立用于RT-PCR的病毒标准品。</li>
	<li>将PCR产物在含有0.1%溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，以120 V电压电泳60分钟。</li>
	<li>从凝胶中切下目标条带，并按照试剂盒制造商的说明使用凝胶回收试剂盒进行纯化。</li>
	<li>合并所有切下并经凝胶纯化的产物，进一步通过基础乙醇沉淀法进行纯化。用约30 μl Tris EDTA（TE）溶液洗脱沉淀产物，以提高样品总体浓度。</li>
	<li>使用分光光度计在260/230 nm波长下测定混合样品中cDNA的含量。</li>
	<li>对纯化后的样品进行10倍系列稀释，浓度范围从57 ng/μl至57 ag/μl（10-18）。系列稀释操作参照2.8步骤所述方法，根据浓度需求进行相应调整。</li>
	<li>使用具有可靠低丰度转录本定量能力的qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR，以确定该系列稀释样品的检测限。 
	注意：病毒浓度低于5 × 10-3 拷贝时无法检测到。</li>
	<li>按照先前步骤5.1所述方法提取实验样品的RNA，并使用分光光度计进行定量。</li>
	<li>使用无核酸酶水将所有提取的样品归一化至5 ng/μl。</li>
	<li>对所有样品进行qRT-PCR检测，每个样品设两个重复，反应体系为25 μl，使用一步法qRT-PCR试剂盒，具备检测低拷贝数的能力，反应程序如下：50 °C孵育10分钟；95 °C预变性5分钟；进行30个循环（95 °C变性10秒，60 °C退火延伸30秒）；熔解曲线分析从50 °C升至99 °C，每步5秒。
	<ol>
		<li>配制主混合液，使每个反应体系包含12.5 μl的1×主混合液、1.0 μl（0.3 μM）正向引物、1.0 μl（0.3 μM）反向引物、0.25 μl逆转录酶，以及根据标准化结果确定的可变量的模板。</li>
		<li>用无RNase水补足总反应体积至25 μl。</li>
		<li>每次PCR运行中均需包含五个标准品浓度，其拷贝数分别为：5 × 10-10、5 × 10-8、5 × 10-6、5 × 10-4 和 5 × 10-2。将每次运行的阈值设定在略低于10×-2.5荧光强度处，以减少每次运行初期数据采集时的背景噪声。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>在十二孔板的每个孔中放入直径为 18 mm 的玻璃盖玻片，培养Homalodisca vitripennis细胞。</li>
	<li>当细胞形成单层后，每隔 24 小时接种一列，持续四天。确保每列包含一个对照孔、一个低病毒稀释度（1:10）孔和一个高病毒稀释度（1:100,000）孔。使用步骤2.8中获得的病毒溶液。</li>
	<li>第五天时移除所有培养基，并用 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。</li>
	<li>用预冷的 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定细胞 30 分钟。</li>
	<li>向细胞中加入 500 μl 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以低速在摇床上洗涤 10 分钟。重复此洗涤步骤共三次。</li>
	<li>向细胞中加入 500 μl 的 0.1% Triton X-100 以通透细胞膜。室温下静置 10 分钟。</li>
	<li>再次按照步骤 7.5 中所述方法洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入 500 μl 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的溶液，在室温下封闭细胞。静置 2 小时后移除。</li>
	<li>将储备的罗丹明红标记鬼笔环肽（RCP）用含 5% BSA 的 1× PBS 按 1:250 稀释，每孔加入 250 μl 稀释液以染色 F-肌动蛋白。</li>
	<li>用铝箔包裹培养板，防止染料褪色，并在 4 °C 下避光孵育过夜。</li>
	<li>孵育 12 小时后移除 RCP，替换为 250 μl 用含 5% BSA 的 1× PBS 稀释的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（250 μg/ml），用于细胞核染色。</li>
	<li>将含 DAPI 的细胞在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>按照步骤 7.5 中所述方法用 1× PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>小心地从孔中取出盖玻片，并使用含抗荧光淬灭剂的封片剂将其封固于显微镜载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于避光盒中干燥，直至在共聚焦显微镜下观察。应尽快观察制备好的载玻片，因为染料可能迅速褪色。</li>
	<li>使用配备有 63X（油镜）平场复消色差物镜的共聚焦系统对染色细胞进行成像。
	<ol>
		<li>设置激光波长：罗丹明红标记鬼笔环肽的激发波长为 543 ± 10 nm，发射波长为 575 ± 10 nm；DAPI 的激发波长为 369 ± 10 nm，发射波长为 450 ± 30 nm。</li>
		<li>所有图像均使用相同的探测器增益和偏移设置获取。</li>
		<li>使用适当的图像处理与分类软件处理图像，并将目标图像导入图像管理软件中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着外来农业有害物种入侵问题日益引起关注，人们对于开发新型防控方法以应对新兴害虫和病原体的需求不断增长。疾病预防与管理的重点之一是病原体传播媒介的控制，这也是本研究的主要目标。在农业生产中，利用生物农药控制病原体传播媒介时，经济因素在决策过程中起着至关重要的作用，因为该类农药的实际应用需要在大面积范围内使用大量制剂，同时必须保持低成本12。利用细胞培养技术进行研发的实践已越来越普遍，因此本研究的影响具有重要意义。确定经济可行的综合害虫管理（IPM）策略，是保障全球农业持续成功生产的关键，本研究的发现有助于推进IPM策略的改进，并减少葡萄藤皮尔当病（PD）的发生。
初级 H. vitripennis 细胞培养物传代并维持超过一年，未见明显的形态学退化。传代次数可能对实验结果产生显著影响。 体外 通过改变细胞代谢和生长特性在哺乳动物细胞中进行的研究13. 随着细胞复制 体内 和 体外 每经过一轮细胞复制，端粒就会缩短，最终达到一个临界限度，此时端粒过短，将引发细胞衰老<s...

玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis Germar 1821）已被确认为北美葡萄皮尔斯病（Pierce’s disease of grapevine, PD）病原体Xylella fastidiosa （X. fastidiosa）的主要传播媒介1。昆虫种群管理已迅速成为加州及美国南部地区葡萄栽培业应对这一毁灭性问题的研究重点。一种属于Dicistroviridae科的正义单链RNA病毒——Homalodisca coagulata virus-01 （HoCV-01），已在野外H. vitripennis种群中被发现，并被证实可提高该昆虫种群的死亡率2-4，同时降低其对杀虫剂的抗性。
在实验室条件下，有效饲养感染的H. vitripennis至成虫阶段的方法开发一直较为困难，因为H. vitripennis在不同发育阶段具有特定的营养需求，需依赖多种寄主植物5-8。在美国，饲养活体H. vitripennis需要特定的设施；因此，细胞培养是一种更经济且可行的替代方案，对于HoCV-01的检测与复制也日益重要2,9。尽管已有建立H. vitripennis细胞培养体系的基本方法描述，但这些方法尚未被用于病毒等生物防治制剂的商业化生产2。
以下操作步骤的总体目标是制备高浓度的HoCV-01，以适合作为生物防治剂使用。病毒的复制需要活细胞，因此成功培养并优化H. vitripennis细胞系对于实现病毒的高效生产至关重要。

<table><tbody><tr><td>Corning 细胞培养瓶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>表面积 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，斜颈，带塞盖</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>倒置显微镜及相机</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25%，无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养，每升 Hanks&amp;prime; 平衡盐溶液含 2.5 g 猪胰蛋白酶和 0.2 g EDTA &amp;bull; 4Na，含酚红</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 多孔培养板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 孔（带盖，TC 处理）</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠</td></tr><tr><td>Corning 瓶顶真空过滤系统</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>醋酸纤维素膜，孔径 0.45 &amp;mu;m，膜面积 54.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，过滤容量 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>聚乙二醇十六醚</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>以 100 mM 接收，用无菌水稀释至 10 mM</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>用于电泳</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent，用于分子生物学，粉末</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>试剂级，结晶状</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>磷酸盐缓冲盐水</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明红标记鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>罗丹明鬼笔环肽是一种高亲和力 F-肌动蛋白探针，与红色-橙色荧光染料四甲基罗丹明偶联</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta 共聚焦系统</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 软件</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫培养基（添加型，1x）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>L-组氨酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>Medium 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>Medium 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>MEM 氨基酸混合液 (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>1 M MgCl 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（含谷氨酰胺）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ 叶蝉培养基组分</td></tr></tbody></table>

通过homalodisca vitripennis细胞培养传播homalodisca coagulata virus-01

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis是一种在美国西南部广泛分布的高迁移性、多食性昆虫。这些昆虫是主要的传播媒介 Xylella fastidiosa （X. fastidiosa）， 一种局限于木质部的细菌，是葡萄皮尔氏病（Pierce's disease, PD）的致病因子。皮尔氏病具有显著的经济危害性；因此， H. vitripennis 已成为病原体管理策略的靶点。一种被鉴定为 dicistrovirus 的病毒 Homalodisca coagulata 病毒-01 (HoCV-01) 已被发现与死亡率升高相关 H. vitripennis 种群。由于HoCV-01的复制需要宿主细胞，细胞培养为靶向复制提供了均一的环境，这在生物杀虫剂生产中具有重要的物流和经济价值。在本研究中，建立了一种用于大规模扩增HoCV-01的系统 H. vitripennis 通过组织培养技术建立了细胞培养方法，提供了病毒复制机制。HoCV-01从全虫体中提取，并用于接种培养细胞 H. vitripennis 在不同时间点收集细胞。每24小时更换一次培养基，持续168小时，提取RNA并进行qRT-PCR分析。使用台盼蓝染色细胞，并通过光学显微镜计数，以定量细胞存活率。在感染后96小时内提取完整病毒颗粒，该时间点确定为细胞培养完全崩解之前。此外，对细胞进行荧光染色，并利用共聚焦显微镜观察，以研究病毒对F-肌动蛋白附着及细胞核完整性的活动影响。本研究的结论是 H. vitripennis 细胞能够被培养并用于大规模生产HoCV-01，达到适宜水平以实现生物杀虫剂的制备。

在原代培养物及后续传代中，无论小规格还是大规格的培养瓶，均在传代后48小时内观察到细胞贴壁和生长。在此期间也观察到了成纤维细胞的生长和发育。若新接种的培养瓶在48小时之前受到扰动，则细胞贴壁情况明显减少，导致细胞生长缓慢，有时甚至完全不贴壁或不生长。传代后约一周，细胞融合度达到约80%，并在10至14天内形成单层细胞（图1）。本研究开始时建立的原代培养细胞，已连续传代30次以上，未出现任何形态学退化或整体细胞活力下降的现象。
从培养瓶传代至培养板后48小时内可观察到细胞贴壁和生长。由于培养板的生长表面积较小，单层细胞形成所需时间更短，约为5-6天。在光学显微镜下以100倍放大拍摄的感染培养物显示细胞形态完整性下降。感染后48小时，细胞表面出现看似较大空洞的区域。在不同培养瓶中，细胞在接种未稀释的HoCV-01后约72-96小时发生收缩并从培养表面脱落（图2）。
对照组和实验组样本的平均活细胞数经计算后绘制成图，以显示不同病毒载量下随时间变化的活细胞数量差异（<...

在此，我们介绍一种用于扩增的实验方案 Homalodisca vitripennis 细胞和HoCV-1 体外每隔24小时从HoCV-1阳性培养物中移除培养基并提取RNA，持续168小时。细胞存活率通过台盼蓝染色法进行定量。感染后提取完整病毒颗粒。采用qRT-PCR对提取的RNA进行定量。

通过Homalodisca vitripennis细胞培养传播Homalodisca coagulata virus-01

玻璃翅叶蝉（Homalodisca vitripennis）是一种活动性强且多食性的昆虫，广泛分布于美国西南部。这些……

以下实验的总体目标是确定一种玻璃拟叶蝉病毒（Homalodisca coagulata virus one，HOCV-one）是否能够在玻璃拟叶蝉（Homalodisca vitripennis）细胞培养物中复制，并进一步提取用于后续实验。该目标通过成功培养玻璃拟叶蝉细胞，将纯化的HOCV-one病毒接种其中以实现病毒复制来达成。第二步，将含有病毒的培养基和细胞从培养体系中移除，随后进行病毒和RNA的提取。随后，对感染后的细胞培养物提取RNA，并进行PCR检测，以确定细胞内是否存在病毒RNA。结果表明，根据感染前后活细胞计数及qRT-PCR分析，HOCV-1可在体内复制。与现有的通过饲养感染性活体昆虫进行研究的方法相比，该技术的主要优势在于其更具经济性，且仅需最少的设施和设备即可轻松管理。该方法的应用有助于回答生物防治领域中的一些关键问题，例如，能否利用某种昆虫病毒或特异性针对某一种昆虫的病毒，在大范围内控制害虫？尽管该方法可为特定昆虫的管理提供见解，但也可应用于其他系统，例如利用与霍奇克罗病毒（HOCV）同科的病毒来防控红火蚁。在开始本实验前，使用添加了叶蝉培养基的H2G培养基（一种改良的WH-2蜜蜂培养基），在25平方厘米的组织培养瓶中培养并维持培养物。将携带病毒的玻璃翅叶蝉（H. vitripennis）整个虫体置于含0.02% DETCA的磷酸盐缓冲液中，通过涡旋振荡，每次约10秒，直至无明显组织团块存在，以实现组织匀浆。随后在4摄氏度条件下，以22,000 g超速离心16小时，提取病毒。弃去上清液后，收集沉淀，并用含有0.4%脱氧胆酸钠和4%聚乙二醇十六醇醚的5毫升10毫摩尔磷酸缓冲液溶解。为充分混匀沉淀，需将沉淀从管壁上移下，必要时进行研碎。在300 ×g条件下离心15分钟后，弃去上清液，将溶液通过0.45微米滤膜过滤，并将滤液收集至较大的收集管中。如有需要，使用少量不含 DETCA 的 10 毫摩尔磷酸缓冲液将滤液转移至截留分子量为 3.5 千道尔顿的透析膜中。将透析膜置于盛有双蒸水的大烧杯中，于 4 摄氏度条件下透析。每小时换水一次，持续 5 至 6 小时，直至膜内出现白色沉淀。此时，将细胞接种于 48 孔培养板中。当细胞生长至80%融合时，用梯度稀释的病毒接种每行细胞。然后向每个孔中加入10微升双蒸水作为体积对照。为了建立与实验组细胞计数相比较的初始细胞浓度基线，在任何孔接种病毒之前，先将每行的第一个孔中的细胞进行消化，随后进行细胞计数。接下来，从每次24小时时间点成像的柱中移除全部培养基，并将其储存在负20摄氏度，用于RNA提取和病毒定量。在按照先前所述方案从培养细胞中提取病毒后，使用专为液体样本设计的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法（按照制造商的方案），从每周病毒试验期间收集的培养基样本中提取RNA。对于RT-PCR，使用HOCV RT-PCR引物1引物对，以及来自全虫H. vitripennis的病毒分离株，进行传统PCR以建立病毒标准品。随后，对纯化后的样本进行十倍系列稀释，稀释浓度范围从每微升57纳克至每微升57阿克。使用具有可靠低丰度转录本定量能力的qRT-PCR试剂盒，通过qRT-PCR测定该稀释系列的检测限。按照先前所述方法从实验样品中提取RNA后，使用分光光度法进行定量。随后，使用一步法qRT-PCR试剂盒对所有样品进行qRT-PCR检测，每个样品设两个重复，反应体系为25 µL，该试剂盒需具备检测低拷贝数的能力，具体操作如下：配制预混液，使每个反应体系包含12.5 µL的1×预混液、1.0 µL的0.3 µM正向引物、1.0 µL的0.3 µM反向引物、0.25 µL的逆转录酶，以及根据标准化结果确定的可变量的模板。然后用无RNase的水将总体积补足至25 µL。每次PCR运行中均需包含五个标准浓度，分别为5 × 10⁻¹、10⁻¹、5 × 10⁻⁸、5 × 10⁻⁶、5 × 10⁻⁴ 和 5 × 10⁻² 拷贝。将每次运行的阈值设定在略低于10⁻²·⁵荧光强度的水平，以降低每次运行初期数据采集阶段的背景噪声。 待玻璃盖玻片上培养的Homalodisca vitripennis细胞长成单层后，在12孔板中每隔24小时接种一列，持续四天，使用提取的病毒进行感染。完成后，用4°C的冷4%多聚甲醛在4°C条件下固定细胞30分钟。随后向细胞中加入500微升1×PBS，在室温下以低速摇床洗涤10分钟。洗涤三次后，加入500微升0.1%Triton X-100，作用10分钟以通透细胞。用 1× PBS 洗涤细胞后，加入 500 微升含 5% 牛血清白蛋白的溶液，在室温下封闭细胞。两小时后，移除溶液。然后每孔加入 250 微升稀释的罗丹明红标记鬼笔环肽溶液，用于染色 F-肌动蛋白。用铝箔包裹培养板以防止染料褪色，并在 4 摄氏度下避光孵育过夜。孵育结束后，移除罗丹明溶液，每孔加入 250 微升用含 5% BSA 的 1× PBS 稀释的 DAPI 溶液，以染色细胞核。室温孵育一小时后，按照前述方法用 1× PBS 洗涤细胞三次。最后，轻轻从孔中取出盖玻片，并使用含抗荧光淬灭剂的封片介质将其封固于显微镜载玻片上。在小规格和大规格培养瓶中传代后48小时内，观察到细胞贴壁及成纤维细胞的生长。当新接种的培养瓶受到扰动时，细胞贴壁率下降，导致培养物生长缓慢，有时甚至出现无贴壁或无生长的情况。细胞在一周内汇合度达到约80%，并在10至14天内形成单层。感染后48小时，感染组培养物显示出细胞形态完整性下降的迹象，细胞表面出现看似较大孔洞的结构。接种未稀释HOCV-one病毒后约72至96小时，细胞发生皱缩并从培养表面脱落。通过绘制平均活细胞数量随时间变化的曲线，以展示不同病毒载量下活细胞丰度的差异。高病毒剂量处理组显示培养物健康状况显著下降，在48至72小时之间活细胞数量急剧减少；而低病毒剂量组则缓慢下降，直至约144小时时出现明显下降。通过Kaplan-Meier曲线检测发现，接种高病毒剂量的细胞存活概率较低，与平均活细胞计数分析结果一致。尽管差异未达到统计学显著性，但数据表明，暴露于病毒的细胞随时间推移其存活率降低的可能性高出88%。暴露于HOCV-one的细胞中细胞核数量减少以及F-肌动蛋白（f-actin）形态异常，表明该病毒对细胞培养造成了显著影响。暴露于较高（10个病毒载量）的健康细胞表现出更明显的应激反应。在进行该操作时，需注意及时完成方案中的每一步骤，因为某些步骤对时间和温度较为敏感。完成该操作后，可采用其他方法（如ELISA）来回答关键问题，例如，在向细胞培养物中接种不同量的病毒后，其中存在多少病毒？观看本视频后，您应能够充分理解如何利用昆虫细胞系扩增RNA病毒、提取病毒，并通过qRT-PCR对其进行定量。

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

传播<em&gt; Homalodisca coagulata病毒01</em&gt;通过<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt;细胞培养

在本视频中，我们使用携带 Cre 重组酶基因的腺病毒来感染携带 floxed Rac1...

腺病毒介导的培养原代小鼠胚胎成纤维细胞中信号分子的基因剔除

我们介绍了一种通过Vero细胞培养法对野外采集的蚊虫进行多种病毒处理和筛查的方法。利用该技术，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊虫中检测出分属4个分类学科别的9种不同病毒。...

通过Vero细胞培养法检测野外采集蚊虫中的感染性病毒

来源： Jamieson, T. R., et al. 利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的伪病毒感染。 J. Vis. Exp.

利用哺乳动物细胞培养生产与收集假病毒颗粒

来源：Nguyen, H., 等. 溶瘤单纯疱疹病毒的培养、纯化与滴定.J. Vis. Exp.

在哺乳动物细胞中增殖与收获溶瘤单纯疱疹病毒

来源：Huang, D., 等．从野外采集的蚊子中分离蚊媒相关病毒．J. Vis. Exp．(2022)．本视频演示了逐步操作的完整流程 体外...

从蚊虫匀浆物中分离蚊媒相关病毒

痘苗病毒（VV）已广泛应用于生物医学研究及人类健康改善。本文介绍一种利用CRISPR-Cas9系统对VV基因组进行编辑的简单且高效的方法。...

一种构建突变型痘苗病毒载体的简单高效方法

火鸡疱疹病毒（HVT）被广泛用作重组疫苗的载体平台，以预防多种禽类疾病。本文介绍了一种简单且快速的重组HVT载体疫苗制备方法，该方法结合了NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体

本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇...

Drosophila Melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

本方案描述了一种实验流程，用于制备携带两种甲型流感病毒株包膜糖蛋白的高滴度感染性病毒假颗粒（pp），并介绍如何测定其感染能力。该方案具有高度适应性，可广泛用于开发携带不同包膜糖蛋白的其他类型包膜病毒的假颗粒。...

利用高致病性H5N1和禽源H7N9病毒包膜糖蛋白制备高滴度感染性流感假病毒颗粒

本文介绍了一种高效制备高滴度戊型肝炎病毒（HEV）毒种的方法，可用于有效感染肝癌细胞。利用该方法，可收获非包膜型和包膜型病毒颗粒，并用于接种多种细胞系。...

用于制备高滴度戊型肝炎病毒储备液的细胞培养模型

由于测序技术的广泛应用，已在蚊子中发现大量新型类病毒序列。我们提供了一种利用脊椎动物和蚊子细胞系分离与扩增病毒的有效方法，该方法可为未来针对蚊媒病毒及蚊子特异性病毒的研究提供基础。...

从野外采集的蚊虫中分离蚊媒相关病毒

了解在玻璃翅叶蝉细胞培养中繁殖Homalodisca coagulata病毒01的实验方法。本研究通过qRT-PCR定量分析病毒RNA，评估细胞存活率，为研究病毒复制机制和病毒-宿主相互作用提供可靠的体外模型。

通过Homalodisca vitripennis细胞培养传播Homalodisca coagulata virus-01

探索更多视频