的vibratome切片小鼠视网膜准备感光文化
December 22nd, 2014
对8岁天小鼠神经视网膜是在4％阿胶块的顶部。感光体层（200微米）通过的vibratome分离后，将感光体后的机械和酶解为培养接种。可用于分子，生化分析或移植的感光层。
该程序的总体目标是隔离小鼠感光层。对于培养，第一步是获得完整的平坦视网膜并将其密封在明胶块上。接下来，成功切割视网膜层以隔离感光层。
最后一步是在培养物中接种纯化的感光细胞。最终，通过显微镜和免疫荧光确认感光层的纯度，然后进行杆状视锥细胞活力因子测试。与激光显微解剖等现有方法相比，该技术的主要优点是可以自信地隔离感光层。
这项技术的影响延伸到遗传性视网膜变性的治疗。由于研究光感受器生物学非常方便，我们最初开发了这种方法来研究视杆细胞和冷光感受器之间的细胞相互作用。将层感光器移植到早期 1 mar 的眼睛中导致所有衍生的生存因子的鉴定。
这些方法的视觉演示至关重要，因为平山视网膜的机会很难执行，因为它很棘手。在隔离视网膜之前，准备颤音。从储存的 20% 明胶溶液的培养皿开始，在 4 摄氏度下
。用手术刀切明胶，然后翻转明胶片，用一滴强力胶将其粘在振动器的黑色支撑盘上。接下来，将剃须刀片分成两半，然后将一半插入振动器。然后将黑色支撑盘插入振动器装置上，并将黑色旋钮向右转动。
现在，将固定容器固定到颤音的头部，并用 CO 2 非依赖介质覆盖明胶块。打开 vibrato 以测试设置。切三个 100 微米的切片，直到切片光滑并产生平坦的切片。
从小鼠和其他制剂中收获眼睛后，分离视网膜。首先，使用 18 号针头在眼肢水平打一个孔。然后去除睫状体，将直剪刀穿过孔插入眼球，小心地剪开虹膜下方的巩膜，然后沿着眼球的周边。
接下来，保持眼睛后部，视网膜与巩膜相邻，并去除角膜和晶状体。用两个细握把取出玻璃体，玻璃体附着在视网膜上而不会损坏视网膜，这样视网膜就可以平放了。在其中进行四个径向切割。
现在将眼球向上翻转，像橙子一样剥皮。接下来，非常小心地使用细直剪刀。将视网膜从巩膜和视网膜色素上皮上分离。
它应该使用精细的握把保持在视神经水平，从外围开始分离剩余的玻璃体，并向视网膜中心移动。完全去除所有玻璃体后，视网膜会变平。现在将视网膜转移到直径为 35 毫米的培养皿中。
在明胶块中密封平坦视网膜的过程很微妙，从根本上说是组织切片最具挑战性的方面。首先，从 vibram 水箱中取出 20 至 30 毫升培养基。其次，使用塑料宽口径移液器将视网膜转移到载玻片上，并在载玻片上滴一滴 CO 2 独立培养基。
第三，将视网膜转移到明胶切片上，感光器朝下。第四，将视网膜连接到明胶块上。在视网膜和明胶块之间的块的一侧轻轻注射温热的 4% 明胶，然后将明胶排出到另一侧。
最后，用玻璃移液管吸出明胶，等待 7 到 10 分钟，让视网膜被密封在块中。现在将不依赖 CO2 的培养基加入到水箱中，并从明胶块的顶部开始浸入块和刀片以进行切片。切割 100 微米的连续切片，直到刀片到达视网膜。
然后使用非常慢的速度，比如一两个切割视网膜内层的 100 到 120 微米部分。根据应用的不同，该层可能会被丢弃或储存在液氮中，从而在内层和外层之间的界面处保持缓慢的速度。取 15 微米的切片。
在显微镜下检查这些切片是否存在血管。当没有视网膜时，外层视网膜已通过外层到达。慢慢切开 200 微米的切片。
将这些切片转移到一个 35 毫米的培养皿中，其中装有 3 毫升冷的、不依赖 CO2 的培养基，保存在冰上。继续从所有视网膜中收集所有感光层切片，以切片到该培养皿。首先将切片的光感受器转移到 37 摄氏度的培养箱中 10 分钟。
然后用镊子轻轻地将每个感光层与明胶分离，并将它们转移到室温下装满 3 毫升林格溶液的新培养皿中。从明胶中分离出所有感光细胞后，将两个单位的木瓜蛋白酶与 25 微升活化剂溶液混合在无菌的 5 毫升聚丙烯管中，并孵育 30 分钟。为了在此孵育过程中激活木瓜蛋白酶，请将感光层切片切成两毫米见方的块，不要小多少。
将这些碎片转移到装有 1.5 毫升林格溶液的 5 毫升试管中。然后吸出铃声并更换它进行第二次洗涤。等待所有切片在重力、沉淀作用下沉降，然后从试管中取出所有剩余的 ringer 溶液。
接下来，将 475 微升林格溶液加入含有活性木瓜蛋白酶的试管中并混合。将此混合物转移到装有切片的试管中，并孵育 20 分钟。20 分钟后，在 DMEM 中加入 1 毫升 10% FCS 以终止木瓜蛋白酶消化。
然后加入 25 单位的 D Ns.One 以消化已死亡的感光细胞的 DNA，小心地将悬浮液匀浆，用移液对感光细胞进行上颚。在室温下以 115 G 离心试管 6 分钟，弃去上清液，并使用 1 mL 移液器将细胞重悬于补充的 DMEM 中。重复此作，旋转和复苏悬架。一次。
现在，从收获的眼睛中，应该有 1 到 150 万个细胞可以接种。以每平方厘米 100， 000 个细胞的速度接种它们，并在下游应用前培养 5 天使用所描述的方法，在出生后第 8 天从野生型小鼠制备感光细胞培养物。在没有 FCS 的情况下，细胞被固定并染色以获得抗排或早期标志物抗下垂。
由于 SAG 先于 ROE 表达，因此抗排阳性的细胞较少。还从 35 日龄小鼠中制备了光感受器，以检查 mRNA、RO 下垂和锥体转导 GA 2 的表达。与整个大脑相比，这些基因在光感受器中表达最为突出。
G NAT 2 由视锥细胞特异性表达。通过比较感光层细胞与视网膜内层细胞来检查光感受器中 RO 和 g. NAT two 的蛋白表达。
这是用野生型和 RD 突变小鼠完成的。突变小鼠在第 35 天时未显示任何一种蛋白的表达。看完这个视频，你应该对如何获得合适的纯化感光层有一个很好的了解。
如果按照此程序正确执行，这项技术可以在大约 5 到 6 小时内完成 4 到 8 个视网膜。此外，可以执行像西血这样的方法来回答其他问题，例如光感受器退化过程中的蛋白质表达 发育后。这项技术为视网膜生物学领域的研究人员研究相关动物模型的转录本、蛋白质组和代谢铺平了道路。
概述
本文详细介绍了一种从小鼠视网膜中分离光感受器层以进行培养的方法。该技术涉及小心的解剖和光感受器的接种，以便进一步分析和潜在的治疗应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 视网膜研究
背景
- 光感受器的分离对于研究视网膜疾病至关重要。
- 该方法允许对光感受器生物学进行详细分析。
- 光感受器的移植可能有助于治疗视网膜退行性疾病。
- 显微镜和免疫荧光确认了分离细胞的纯度。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离光感受器层。
- 促进视网膜细胞相互作用的研究。
- 探索遗传性视网膜退行性疾病的潜在治疗方法。
使用的方法
- 准备明胶块以分离视网膜。
- 视网膜层的机械和酶解离。
- 在培养中接种纯化的光感受器细胞。
- 显微镜检查以确认细胞纯度。
主要结果
- 成功从小鼠视网膜中分离光感受器层。
- 通过显微镜确认了光感受器的高纯度。
- 该方法比传统技术具有优势。
- 探索了在视网膜治疗中的潜在应用。
结论
- 所描述的方法对于分离光感受器是有效的。
- 它为研究视网膜细胞相互作用提供了平台。
- 未来的研究可能会导致视网膜疾病治疗的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation of mouse photoreceptor layers enables high-purity primary cultures for mechanistic studies and molecular profiling in retinal research. This capability supports early discovery and target validation for inherited retinal degeneration and other vision disorders. The method's reproducibility and specificity facilitate translational continuity from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of photoreceptor-specific pathways and cellular interactions in disease-relevant systems.
- Supports functional validation of candidate targets implicated in retinal degeneration.
- Provides mechanistic de-risking by isolating pure photoreceptor populations for downstream analysis.
Screening & Assay Development
- Generates validated photoreceptor cultures for quantitative viability and purity assays.
- Facilitates standardization of cell-based assays for compound screening and gene/protein expression studies.
- Enables reproducible preparation of biological material for platform reuse and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for inherited retinal degeneration and photoreceptor loss.
- Supports continuity from in vitro discovery to in vivo transplantation and functional validation.
- Provides a foundation for biomarker identification and mechanistic studies in preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This vibratome-based sectioning method positions upstream of lead identification, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification in retinal biology workflows.
- Discovery Biology: Isolates pure photoreceptor layers for hypothesis-driven studies and mechanistic de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity cultures for quantitative viability and marker-based assays.
- Analytics: Supports gene and protein expression profiling to compare disease and control conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical transplantation and functional rescue studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across retinal models and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies of retinal degeneration.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of photoreceptor isolation and culture.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for early-stage retinal therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models for inherited retinal disease pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, vibratome sectioning, and cell culture techniques.
- Demands access to vibratome instrumentation, microscopy, and immunofluorescence capabilities.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible sectioning and culture conditions.
- Adaptable to various mouse models and ages, but protocol optimization may be needed for different systems.
- Limitations include technical complexity and throughput constraints inherent to manual tissue processing.
