Name: 栓塞性脑梗塞（缺血）的大鼠缺血性中风与血同源凝块 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解使用同源血凝块在大鼠中建立栓塞性大脑中动脉闭塞模型的方法。该模型有效模拟人类缺血性中风，为溶栓治疗的临床前研究提供可靠平台，有助于深入理解中风病理机制并评估新治疗策略。

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本工作得到美国国立卫生研究院基金项目 HL087990（G.L.）的支持。

伦理声明：本方案使用雄性成年Sprague-Dawley大鼠（体重330-380 g）。本方案已获得路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（第八版，美国国家科学院，2011年）的规定。
1. 改良型PE-50导管的制备
<ol>
	<li>用手将一根30 cm长的PE-50管置于燃气火焰上方，逐渐软化管子，然后轻轻拉伸。</li>
	<li>使用数字卡尺在拉伸后的管子上选择一点（图1），做好标记，并将改造后的PE-50管切割成一段25 cm长的部分，末端保留1 cm长的尖端（外径：0.30–0.34 mm）。</li>
</ol>
2. 同源血栓的制备
<ol>
	<li>在采血前，通过面罩使用异氟烷（诱导浓度5%，维持浓度2-3%）与70% N2O 和30% O2混合气体对大鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认麻醉效果。</li>
	<li>采用已发表的方法4 对供体大鼠实施股动脉插管，将股动脉血液直接注入一段20 cm长的PE-50导管中。将导管置于室温下2小时以使血液凝固，随后在4 °C条件下保存22小时。注意：插管操作需按照3.1步骤所述的无菌技术进行。供体大鼠在操作后恢复，可用于后续取样。</li>
	<li>将PE-50导管切成50 mm长的片段，并用生理盐水冲洗，将血凝块冲出至含有生理盐水的无菌培养皿中。</li>
	<li>将50 mm长的血凝块转移至一段60 mm长的PE-10导管中，并将PE-10导管两端分别连接一段20 cm长的PE-50导管，后者连接装有生理盐水的1 ml注射器，并配有23 G针头（图2）。</li>
	<li>通过在两个注射器之间持续交替推动，使血凝块来回移动5分钟，以去除血凝块中的血细胞，并最大限度减少血管外凝血块的脆性，同时不破坏纤维蛋白核心结构。</li>
	<li>将血凝块切成40 mm长的片段，并在无菌条件下将其转移至经改造的PE-50导管中，操作方法如步骤1.2所述。注意：所有PE导管均经环氧乙烷灭菌。</li>
</ol>
3. 栓塞性大脑中动脉闭塞（图3A,B）
<ol>
	<li>将所有手术器械通过高压灭菌（至少121 °C、15 PSI，持续15分钟）进行灭菌。使用70%乙醇对手术台及相关手术设备进行消毒。</li>
	<li>按照步骤2.1所述方法用异氟烷麻醉大鼠。通过捏压双侧后肢脚趾测试麻醉深度，若观察到任何运动反应（如肢体回缩），表明动物尚未达到足够的麻醉深度，不可进行手术。在双眼上涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。使用电动剃毛器剃除颈部腹侧和头部区域的毛发，暴露皮肤。</li>
	<li>将大鼠仰卧位放置于加热垫上。插入直肠探头，并使用恒温控制仪将体温维持在36.5–37.5 °C之间。</li>
	<li>先用10%聚维酮碘对剃毛后的皮肤及周围毛发进行消毒，再用70%乙醇脱碘。</li>
	<li>在解剖显微镜下于颈部做一条长约2 cm的正中切口。使用牵开器暴露手术视野，仔细分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和蝶腭动脉（PPA），使其脱离周围神经和筋膜（图3A）。注意：若无助手协助准备动物，术前应更换无菌手套。</li>
	<li>将颈总动脉（CCA）从周围神经中游离（避免损伤迷走神经），并在动脉下方穿入一根无菌5-0丝线。打一个滑结（#1），用小止血钳夹住丝线并向躯干方向拉紧。</li>
	<li>游离颈外动脉（ECA）及其两个分支：枕动脉（OA）和甲状腺上动脉（STA）。使用兽用高频电刀凝闭这两个分支。在ECA下方穿入两根无菌6-0丝线。</li>
	<li>将置于动脉下方的两根丝线分开，一根朝向头部（远端），另一根朝向躯干。在靠近头部的一侧打一个紧结（#2），用小止血钳夹住丝线并向头部方向拉紧。另一根丝线打一个松结（#3），留待后续使用。</li>
	<li>将颈内动脉（ICA）和蝶腭动脉（PPA）从周围神经中分离（避免损伤迷走神经）。用6-0丝线结扎PPA（#4）。在ICA周围用6-0丝线打一个滑结（#5）。也可选择使用微血管夹夹闭ICA。</li>
	<li>使用Vannas型弹簧剪在ECA上两个结扎线（紧结#2与松结#3）之间剪出一个小孔（半切口）。将含有血栓的改良PE-50导管插入切口，并推进至颈总动脉分叉处。适度收紧松结（#3），使其刚好固定导管并保持其在血管内的可移动性。</li>
	<li>在小孔处切断ECA，游离远端残端，并将其置于ECA与ICA分叉下方，以便改良导管顺利进入ICA。打开ICA，轻柔地将导管从ECA管腔推进至ICA，直至导管尖端到达大脑中动脉起始部（距分叉约17 mm）。注意：在将导管插入ECA前，需先用70%乙醇擦拭导管外表面，再用无菌生理盐水冲洗。</li>
	<li>使用100 μl Hamilton注射器，在10秒内通过改良PE-50导管注入血栓及10 μl生理盐水（图3B）。</li>
	<li>5分钟后将导管从ECA撤出。结扎ECA，恢复CCA血流。缝合颈部切口。</li>
</ol>
4. 监测局部脑血流量（rCBF）
<ol>
	<li>在大脑中动脉（MCA）阻塞前，于头皮正中做一条长1.2 cm的切口，暴露颅骨。使用牙科刮匙和无菌棉签清除颅骨表面的组织。注意：手术前，暴露的头皮区域及周围毛发需先用10%聚维酮碘消毒，再用70%乙醇处理。</li>
	<li>使用直径0.7 mm的球形不锈钢钻头，在冠状缝后方2 mm、外侧5 mm处钻一个直径1.5 mm的骨孔（图4）。 
	注意：保持硬脑膜完整。</li>
	<li>将探头置于硬脑膜表面上方0.5 mm处。在栓塞后0（基线）、5、15、30、60、90和120分钟监测相对脑血流量（rCBF），并在静脉注射tPA后继续于5、15、30、45和60分钟进行监测。完成最后一次rCBF测量后，缝合头皮切口。注意：在颈部切口前，我们测量MCA阻塞前的rCBF作为基线；MCA阻塞后，在缝合关闭颈部切口后测量rCBF。因此，颈部切口始终保持无菌状态。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>皮下注射 2.5 ml 生理盐水以防止脱水，并在手术后立即皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），根据需要每 6–12 小时重复一次以缓解疼痛。</li>
	<li>停止异氟烷麻醉。将大鼠置于 37 °C 的兽用复苏舱内（保持动物温暖）并持续观察。大鼠通常在 10 分钟内恢复意识。随后将动物放入灭菌笼中，在笼内培养皿中放置一些湿润的食物，并将笼子送回动物灭菌室。</li>
	<li>脑卒中后 24 小时，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）处死大鼠。</li>
</ol>
6. 神经功能缺损评分
<ol>
	<li>在栓塞前及栓塞后2小时进行Bederson评分。采用先前描述的0-3级评分标准5：0分，提起大鼠尾部时，动物双侧前肢均伸向地面，无其他神经功能缺损（运动正常）；1分，提起大鼠尾部时，对侧前肢屈曲；2分，对侧向推力的抵抗能力下降（伴前肢屈曲），但无环行运动；3分，具有2分表现并出现环行运动。 
	注意：栓塞后2小时Bederson评分为0分（无神经功能缺损）的大鼠应排除在进一步研究之外。</li>
</ol>

<ol><li>Overgaard, K., Sereghy, T., Boysen, G., Pedersen, H., Høyer, S., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+reproducible+cerebral+infarction+using+thrombotic+blood+clot+emboli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 12 (3), 484-490 (1992).</li>
<li>Zhang, R. L., Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+focal+embolic+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of focal embolic cerebral ischemia.</a> Brain Res. 766 (1-2), 83-92 (1997).</li>
<li>Dinapoli, V. A., Rosen, C. L., Nagamine, T., Crocco, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+MCA+occlusion%3A+a+precise+embolic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective MCA occlusion: a precise embolic stroke model.</a> J. Neurosci. Methods. 154 (1-2), 233-238 (2006).</li>
<li>Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+arterial+and+venous+catheterization+for+blood+sampling%2C+drug+administration+and+conscious+blood+pressure+and+heart+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements.</a> J Vis Exp. 59 (3496), (2012).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Tsuji, M., Nishimura, M. C., Davis, R. L., Bartkowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion%3A+evaluation+of+the+model+and+development+of+a+neurologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination.</a> Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).</li>
<li>Henninger, N., Bouley, J., Bråtane, B. T., Bastan, B., Shea, M., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Doppler+flowmetry+predicts+occlusion+but+not+tPA-mediated+reperfusion+success+after+rat+embolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Laser Doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke.</a> Exp Neurol. 215 (2), 290-297 (2009).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A2+combined+with+low-dose+tPA+improves+thrombolytic+therapy+in+a+rat+model+of+focal+embolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Annexin A2 combined with low-dose tPA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (6), 1137-1146 (2010).</li>
<li>Cheng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+inhibits+tissue+plasminogen+activator-induced+brain+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage.</a> Nat Med. 2 (11), 1278-1285 (2006).</li>
<li>Taniguchi, H., Andreasson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic-ischemic+encephalopathy+model+of+perinatal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia.</a> J Vis Exp. 21 (955), (2008).</li>
<li>Sicard, K. M., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+focal+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Transl+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of focal brain ischemia.</a> Exp Transl Stroke Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Florian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+hypothermia+reduces+infarct+volume+in+aged+rats+after+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia.</a> Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).</li>
<li>Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hyperthermia+on+infarct+volume+in+focal+embolic+model+of+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats.</a> Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).</li>
<li>Westendorp, W. F., Nederkoorn, P. J., Vermeij, J. D., Dijkgraaf, M. G., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-stroke+infection%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">Post-stroke infection: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Neurol. 11 (110), (2011).</li>
</ol>

我们没有需要披露的潜在利益冲突。

本研究中，我们展示了一种在大鼠中实施栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中模型的标准方法，该方法通过富含纤维蛋白的血栓阻塞大脑中动脉（MCA）的起始段。该模型的主要优势在于：使用富含纤维蛋白的血栓阻塞MCA主干，与人类的血栓栓塞性卒中相似；栓塞性卒中模型适用于开展溶栓治疗的临床前研究；此外，该模型可在MCA供血区域内形成可重复且可预测的梗死体积。
在进行栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型操作时，血栓的引入、稳定性和定位较难控制，这会导致梗死体积和受累脑区出现变异2,3。既往研究表明，只有当阻塞血栓位于大脑中动脉主干时，才能在MCA供血区域获得可重复的缺血性病灶2,3。为了精确地将血栓定位并建立可重复的栓塞性卒中模型，本研究展示了如何制备改良的PE-50导管，如何将该导管尖端送入大脑中动脉起始部，以及如何将富含纤维蛋白的血栓注入大脑中动脉。与既往报道一致2，在所有接受生理盐水治疗的大鼠中（n = 9），注射的血栓在栓塞后24小时均可清晰观察到位于大脑中动脉起始部；而在所有接受tPA治疗的大鼠中（n = 12），血栓则基...

A correction was made to <a href="/video/51956">Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats</a>. The institution information was updated.
The institution "Louisiana State University Health Science Center" was changed to "Louisiana State University Health Science Center, Shreveport".

A correction was made to <a href="/video/51956">Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats</a>. The institution information was updated.

Erratum: Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

脑卒中是美国第三大死因，但针对急性脑卒中的治疗选择仍然有限。目前，静脉输注重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）以溶解血栓是治疗急性缺血性脑卒中最有效的疗法。然而，tPA的应用受限于其较窄的治疗时间窗以及增加的脑出血风险。因此，迫切需要建立一种适用于溶栓研究的脑卒中模型。
大脑中动脉（MCA）是人类脑卒中最常发生闭塞的动脉。针对该动脉，研究人员已建立了多种缺血性脑卒中的动物模型。目前，通过闭塞MCA已发展出两种主要的啮齿类动物局灶性脑缺血模型：线栓MCAO模型和栓塞MCAO模型。尽管通过血管内线栓技术建立的MCAO模型已广泛应用于机制驱动型脑卒中研究，但这些线栓模型并不能很好地模拟人类脑卒中，因为高达80%的人类脑卒中是由血栓形成或栓塞引起的。相比之下，使用血凝块建立的栓塞性脑卒中模型更接近人类脑卒中的实际情况，被认为适用于溶栓治疗的研究。该栓塞性模型最早由&#160;Overgaard et al.1于1992年在大鼠中建立，并由Zhang et al.于1997年2及Dinapoli et al.于2006年3进一步完善。尽管栓塞性MCAO模型日益受到关注，但许多实验室在技术操作上仍面临挑战。
本文介绍了一种在成年大鼠中使用同源血凝块制备栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）的标准方法，该方法可在大脑中动脉供血区域形成可预测的梗死灶。本文所展示的技术将有助于研究人员克服建立该脑卒中研究模型时遇到的技术难题。

<table><tbody><tr><td>重组组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA）</td><td>化学试剂</td><td>基因泰克</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>化学试剂</td><td>西格玛</td><td>T8877</td></tr><tr><td>麻醉蒸发器</td><td>设备</td><td>索玛科技</td><td>Drager Vapor 19.1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>可充电高速微型钻机</td><td>设备</td><td>精细科学工具公司</td><td>18000-17</td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>设备</td><td>精细科学工具公司</td><td>14117-14</td></tr><tr><td>杜蒙特镊子（医用 #7）</td><td>设备</td><td>精细科学工具公司</td><td>11270-20</td></tr><tr><td>杜蒙特镊子（医用 #5）</td><td>设备</td><td>精细科学工具公司</td><td>11251-35</td></tr><tr><td>万纳斯式弹簧剪刀</td><td>设备</td><td>精细科学工具公司</td><td>15000-03</td></tr><tr><td>兽用复苏舱&amp;nbsp;</td><td>设备&amp;nbsp;</td><td>佩科服务公司&amp;nbsp;</td><td>V1200&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Genie Plus 注射泵</td><td>设备</td><td>肯特科学公司</td><td></td></tr><tr><td>大鼠脑切片模具</td><td>设备</td><td>肯特科学公司</td><td>RBMA-310C</td></tr><tr><td>数字卡尺&amp;nbsp;</td><td>设备</td><td>世界精密仪器公司</td><td>501601</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>设备</td><td>世界精密仪器公司</td><td>PZMTIII-BS-LWD</td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器</td><td>设备</td><td>哈密尔顿</td><td>型号 710</td></tr><tr><td>恒温毯控制单元</td><td>设备</td><td>哈佛仪器公司</td><td></td></tr><tr><td>电动剪毛器</td><td>设备</td><td>布雷恩特里科学公司</td><td>CLP-9931</td></tr><tr><td>兽用高频电刀</td><td>设备</td><td>MACAN 制造公司</td><td>MV-9</td></tr><tr><td>血流仪</td><td>设备</td><td>Adinstruments 公司</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/30</td><td>设备</td><td>Adinstruments 公司</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7.2</td><td>软件</td><td>Adinstruments 公司</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>耗材</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>309659</td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>耗材</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>305143</td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>耗材</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>305106</td></tr><tr><td>PE-50 导管</td><td>耗材</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>427517</td></tr><tr><td>PE-10 导管</td><td>耗材</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>427400</td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>耗材</td><td>哈佛仪器公司</td><td>723287</td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>耗材</td><td>哈佛仪器公司</td><td>517607</td></tr></tbody></table>

自体血栓栓塞性大脑中动脉闭塞（mcao）大鼠缺血性脑卒中模型

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

临床上，使用重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）进行溶栓治疗仍是急性缺血性脑卒中最有效的治疗方法。然而，tPA的应用受限于其较窄的治疗时间窗以及出血性转化风险的增加。迫切需要建立合适的脑卒中模型，以研究新的溶栓药物和缺血性脑卒中的治疗策略。目前，已在大鼠和小鼠中开发出两种主要的缺血性脑卒中模型：线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）模型和栓塞型MCAO模型。尽管线栓法MCAO模型已广泛应用于机制驱动型脑卒中研究，但这些线栓模型无法模拟临床实际情况，不适用于溶栓治疗的研究。在这些模型中，栓塞型MCAO模型更接近人类缺血性脑卒中的病理过程，适用于溶栓治疗的临床前研究。该栓塞模型最早由Overgaard 等1于1992年在大鼠中建立，并由Zhang 等于1997年进一步完善2。尽管栓塞型MCAO模型日益受到关注，但许多实验室在技术上仍面临挑战。为了满足溶栓研究日益增长的需求，本文介绍一种高度可重复的大鼠栓塞型MCAO模型，该模型可在大脑中动脉供血区域内产生可预测的梗死体积。简言之，将改良的PE-50导管从颈外动脉（ECA）轻柔地插入至颈内动脉（ICA）管腔，直至导管尖端到达大脑中动脉（MCA）起始处；通过导管将单个同源血凝块置于MCA起始部位。为确认MCA阻塞是否成功，需监测局部脑血流量，并评估神经功能缺损程度和梗死体积。本文所介绍的技术将有助于研究人员克服建立该模型过程中的技术难题，推动脑卒中研究的发展。

采用激光多普勒血流仪（LDF）监测脑缺血诱导期间的相对脑血流量（rCBF）6,7。包括本实验室在内的许多实验室均使用rCBF来鉴定大脑中动脉（MCA）成功阻塞的动物模型，但不同实验室之间基线阈值存在差异，这与测量部位有关。LDF探头的位置置于前囟后方2 mm、外侧5 mm处，如先前所述6。在血栓注射后0、5、15、30、60、90和120分钟时监测rCBF。根据该数据，仅将rCBF较基线下降&gt;70%的动物视为MCA成功栓塞性阻塞（图5）。在血栓注射后2小时，通过注射泵静脉给予标准剂量的组织型纤溶酶原激活剂（tPA，10 mg/kg）7,8，其中10%作为推注剂量，90%在30分钟内持续输注7,8。我们观察到，在tPA治疗开始后30分钟内，rCBF水平逐渐回升至基线值的&gt;70%（图5）。
栓塞后24小时，处死动物并通过心脏灌注200 ml PBS以清除血管内血液。既往研究2,3,7,8及我们的数据...

本文中，我们展示了一种在成年大鼠中使用同源血凝块（富含纤维蛋白）制备栓塞性大脑中动脉闭塞的标准方法。该模型能高度模拟人类缺血性脑卒中，适用于缺血性脑卒中溶栓治疗的临床前研究。

自体血栓栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血性脑卒中模型

临床上，使用重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的溶栓治疗仍是急性缺血性……最有效的治疗方法

本实验的总体目标是建立一种大鼠栓塞性脑卒中模型。首先，使用滑结暂时结扎颈总动脉，并尽可能紧密地结扎颈外动脉。然后，在颈外动脉分叉上方放置一根松散的缝线。第二步是分离腭降动脉和颈内动脉，并使用滑结进行临时结扎。然后在紧结和松结之间的颈外动脉上切开一个小孔。接着，将含有血凝块的改良P 50导管插入颈外动脉中。然后将导管反转进入颈内动脉（ICA），并轻柔推进导管，直至其尖端到达大脑中动脉（MCA）起始处。最后通过导管注入血凝块并用生理盐水冲入，5分钟后从颈外动脉（ECA）撤出导管。最终在卒中发生24小时后，采用TTC染色法显示脑切片中的梗死区域。该技术的主要优势在于，我们现有的卒中模型（如MC模型）能够紧密模拟人类缺血性卒中，适用于缺血性卒中SLI治疗的临床前研究。本视频将由本实验室的Dr.A port failure演示该操作流程。Dr.Gene在进行脑循环模型实验方面拥有十年以上的经验。该方法的可视化演示对于理解其中关键且难以描述的操作步骤至关重要。准备PE 50导管时，将一段30厘米长的PE 50导管在燃气火焰上方逐渐软化并拉伸。使用数字卡尺在拉伸后的导管上选定位置，然后将其截成一段25厘米长的节段，末端保留1厘米长的尖端，外径控制在0.30至0.34毫米之间。接下来，使用一根20厘米长的PE 50导管从麻醉的大鼠股动脉采集血液。将导管置于室温下2小时，使血液凝固。然后将导管在4°C条件下保存22小时。将PE 50导管剪成50毫米的节段，用生理盐水冲洗出导管内的血栓，收集至无菌培养皿中。将长度为50毫米的血栓转移至长度为60毫米的PE 10导管中。然后将PE 10导管的每一端分别连接一段20厘米长的PE 50导管，PE 50导管末端连接装有生理盐水的1毫升注射器，并安装23号针头，通过在两个注射器之间反复转移血栓，持续5分钟，以去除血细胞同时不破坏纤维蛋白核心。之后，将血栓切割为40毫米长的节段，并将该血栓节段转移至改良的PE 50导管中。在此操作中，通过高压灭菌法对所有手术器械进行灭菌，并使用70%乙醇对手术台及相关手术设备进行消毒。随后，用异氟烷麻醉大鼠，并通过捏压后肢脚趾以确认麻醉深度。在眼睛上涂抹少量眼膏，以防止干燥。然后将大鼠仰卧位放置于加热垫上。接着，使用电动剪刀剃除颈部腹侧区域的毛发，并用70%乙醇对皮肤及周围毛发进行消毒。插入直肠探头，并使用恒温毯控制装置将体温维持在约37摄氏度。然后在解剖显微镜下，于颈部做一条长两厘米的正中切口。使用牵开器暴露手术区域。从周围神经中仔细分离颈总动脉，避免损伤迷走神经，并在动脉下方放置一根无菌的5-0丝线缝线。打一个活结，并将缝线向身体方向牵拉。接着，分离颈外动脉（ECA）及其两个分支——眼动脉（OA）和颞浅动脉（STA），使用兽用高频电刀凝固这两个分支，然后在ECA下方放置两段无菌6-0丝线，将置于动脉下方的两段丝线分开，一段朝向头部，另一段朝向身体方向。在靠近头部的一侧打一个紧密的结扎线。用小止血钳夹住丝线缝合线并向头部方向牵拉。用另一根丝线缝合线预先打一个松结，以备后续使用。随后分离颈内动脉（ICA）和枕下动脉（PPA）周围的神经，注意保护迷走神经不受损伤。用6-0缝线结扎PPA。然后在ICA周围打一个滑结，或使用微血管夹夹闭ICA。接下来，用威尼斯式弹簧剪刀在紧结和松结之间的ECA上剪一个小孔。将含有血凝块的改良PE 50导管插入切口，并推进至颈总动脉分叉处。适度收紧导管周围松弛的结扎线，以牢固固定留置导管的同时确保其可活动性。随后在小孔处切断颈外动脉，以游离其残端。将残端置于ECA与ICA分叉下方。这将使改良后的导管能够轻松滑入ICA。切开ICA，轻柔地将导管从ECA管腔推进至ICA，直至导管尖端到达MCA起始处。现在使用100微升汉密尔顿注射器，在10秒内将血栓连同10微升生理盐水通过改良的P 50导管注入。5分钟后，从ECA撤出导管，结扎ECA，随后重新开放ECA，并缝合颈部切口。在此操作中，对麻醉大鼠的头皮做一条长1.2厘米的正中切口，以暴露颅骨。接下来进行钻孔，使用直径0.7毫米的球形不锈钢钻头，在位于bgma后方2毫米、外侧5毫米处钻一个直径1.5毫米的骨孔。将探头置于硬脑膜表面上方0.5毫米处。在栓塞后0、5、15、30、60、90和120分钟时，使用血流仪测量RCBF，栓塞持续时间为2小时。手术后，用 TPA 处理大鼠，并在 TPA 处理后的 5、15、30、45 和 60 分钟持续监测血流；术后皮下注射 2.5 毫升生理盐水，以防止脱水，并在术后立即皮下注射 0.05 毫克/千克的 Bren，此后每 6 至 12 小时根据需要注射一次以缓解疼痛。停止异氟烷麻醉，将大鼠置于 37°C 的兽医恢复舱中，并持续进行监测。栓塞后约10分钟，将动物放入无菌笼中，并在培养皿中放置一些湿食，然后将笼子送回动物无菌室。栓塞2小时后，采用BESON评分评估神经功能评分。无神经功能缺损的大鼠将被排除在进一步研究之外。该图显示了使用激光多普勒血流仪测量的相对脑血流量（RCBF）。血栓注射导致 RCBF 较基线值下降超过 70%。在血栓形成后 2 小时给予 tPA 治疗，持续 30 分钟，血流得以恢复。脑血流量接近基线水平。此处为代表性图像，显示卒中后24小时大脑中动脉（MCA）起始段和颈动脉（CA）内的血栓情况。这些是TTC染色脑切片的代表性图像。脑卒中后24小时，一旦掌握，该技术应在30分钟内完成。

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一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。...

大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

了解使用同源血凝块在大鼠中建立栓塞性大脑中动脉闭塞模型的方法。该模型有效模拟人类缺血性中风，为溶栓治疗的临床前研究提供可靠平台，有助于深入理解中风病理机制并评估新治疗策略。

自体血栓栓塞性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠缺血性脑卒中模型

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