在器官型海马脑片搭配全细胞记录
2014年9月28日
Pair 记录是来自两个突触连接神经元的同时全细胞膜片钳记录，能够对单个神经元之间的突触进行精确的电生理学和药理学表征。在这里，我们描述了在任何配备电生理学的实验室中在器官型海马切片培养物中建立该技术的详细方法和要求。
以下实验的总体目标是能够记录来自大脑中最小突触回路的电生理学。这是在塑料培养插入物中生长的大鼠海马体的器官型切片培养物制成的记录中实现的。这些切片形成复杂但适当的突触连接，在培养一段时间后可以很容易地记录下来。
在这些切片中进行记录可以分离仅在两个神经元之间形成的最小突触回路的突触活动，从而可以研究神经元回路的最基本特性。这种方法可用于探测海马体中突触微电路的功能，但它可用于大脑中相邻神经元突触连接的任何区域。记录和解剖方法的视觉演示都至关重要，因为许多步骤都取决于大脑标志和神经元的准确识别，在制作切片之前准备所有溶液和培养板。
每个用于收集切片的较大板包含七个较小的培养皿，每个培养皿在组装过程中都装有培养基和培养插入物。将插件以一定角度放入介质中，以避免滞留空气。将这些板存放在培养箱中，通过使用结构地标导航大脑，小心地从 P 七啮齿动物大脑的每一半中取出海马体，而不会造成损伤。
首先，沿中线划分大脑。然后用细刮刀将皮层与中脑分开。剥开大脑，露出海马体。
接下来，用刮刀的尖端切开穹子，然后将刮刀放在 FIA 和海马体下方。现在将海马体从大脑中滚出，并将其从附着的组织上切开。轻轻舀起海马体，放入冰冷的解剖培养基中。
继续收集第二个海马体。继续将两个河马 campi 切片。将它们放在切碎器块的舞台上，内衬两种厚度的湿润剂。
第二，滤纸。然后连续制作 400 微米的横向切片，不要抬起任何切片。结果就像一条切成薄片的面包。
一致的厚度和轻柔的处理是关键。现在使用柔软的白色紫貂，四号艺术家的画笔，在每个切片的海马体下轻轻滚动画笔，然后将其从舞台上提起。一旦两个河马都转移了，盖上盘子并用力旋转。
经常改变方向。目标是分离切片。现在在解剖显微镜下，检查切片，丢弃任何损坏或小于预期的切片。
此外，丢弃任何没有清晰可见的细胞层的切片，因为这也是损坏的迹象。任何没有分离的切片都可以在其边缘翻转并用 dumont 镊子刺激以迫使它们分开。首先，用培养基填充移液器。
然后轻轻吸起切片，使其靠近开口。使用轻压。在尖端形成一个液滴，等待切片沉淀到液滴中。
然后将液滴接触组织培养物的表面。插入。一旦切片清楚地在插件上，就取出移液器。如果液滴不是太大，三个切片将适合一个膜。插入。
转移所有切片后，使用牧场移液器轻轻吸出每个切片周围的培养基。对电镀的嵌件进行液体去除。首先，留出足够的时间让切片沉淀。
现在盖上每个小盘子，然后盖上大盘子，然后孵化组件。切完后第二天喂切片。然后在切割后的第三天再次喂食它们。
第二次喂食后，将它们移至 34 摄氏度、5% CO2 的培养箱中，然后每周喂食两次培养物。器官型切片在切割后一到两周内就可以记录了。在记录装置上，用手术刀完全切开培养插入物的底部并围绕切片，取出单个切片。
用 dumont 镊子取下切开的塑料圈，并将其放入电生理装置的记录室中。使用镊子将切片移动到记录室。现在，在保持载物台的同时，仍然聚焦并在 10 倍和 40 倍放大倍率下扫描切片表面，以定位 CA 三个细胞体层。
一旦确定了目标细胞，就尽可能地升高物镜，而不会破坏物镜和记录室中 A CSF 之间的液体弯月面。然后将整个细胞记录电极放在物镜下方并向下聚焦以找到电极的尖端，直到电极与目标神经元接触。请务必对电极内部溶液保持正压，以保持电极无碎屑。
现在同时降低电极和物镜，直到电极靠近切片表面。然后进一步将电极放入组织中，轻轻地将其推入目标神经元的一侧。现在，去除正压并轻轻吸力内部溶液，以在神经元膜上形成千兆欧姆密封。
密封完成后，用吸力脉冲破坏电极下的膜，或者通过进行一次整个细胞记录来过度补偿放大器的电容。再次升高物镜并设置第二个电极，以尽量减少会干扰第一次记录的移动。保持第二个电极上的正压量较低。
合理的低流量将在 2 到 3 个神经元的距离处诱导运动。一旦建立了第二次全细胞记录，突触传递应该稳定一到四个小时。通过刺激突触前神经元激发动作电位，然后在 5 毫秒内看到突触后神经元中的单突触 EPC，突触连接是显而易见的。
在测试的 ca three 细胞中，约有 1/3 是通过主动连接与另一个 CA three 细胞突触耦合的单细胞。AMPA 受体介导的电流的振幅在一个配对记录内的试验之间变化，并且在不同的主动连接中不同。EPC 可以小于 10 皮安或大于 800 皮安。
使用标准归纳方法的失败率差异很大。LTP 和 LTD 都可以在 ca 3 到 CA 3 突触处可靠地诱导，并且两种形式的可塑性都可以维持两个小时以上。在 CA 三个旁金属神经元对之间经常观察到记录 polys 突触抑制事件的完整持续时间。
然而，它们没有被药理学阻断，因为由于这些事件之间的潜伏期很长，它们不会显着干扰神经突触电流。观看此视频后，您应该对如何制作器官型海马切片以及如何使用它们从突触连接的神经元对进行双全细胞记录有很好的了解。
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概述
本文描述了一种使用全细胞膜缀夹技术从突触连接的神经元中进行配对记录的方法。重点是器官型海马切片培养，它允许对突触相互作用进行详细的电生理学表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 突触连接性
背景
- 配对记录使得研究单个神经元之间的突触电路成为可能。
- 器官型切片培养保持适当的突触连接以供分析。
- 该技术可以应用于具有连接神经元的各种脑区域。
- 准确识别脑部标志物对于成功记录至关重要。
研究目的
- 记录来自最小突触电路的电生理活动。
- 分离两个神经元之间的突触活动。
- 研究神经元电路的基本特性。
使用的方法
- 器官型海马切片培养的制备。
- 来自连接神经元的全细胞膜缀夹记录。
- 记录和解剖方法的视觉演示。
- 实验前溶液和培养板的准备。
主要结果
- 成功分离了最小电路中的突触活动。
- 展示了培养的海马切片中的突触连接。
- 方法适用于各种脑区域。
- 视觉辅助增强了对实验过程的理解。
结论
- 配对记录为突触功能提供了洞见。
- 器官型培养对研究神经元电路有效。
- 该方法可以适应大脑的不同区域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices enable precise characterization of synaptic transmission and plasticity at the level of individual neuron pairs, providing mechanistic insights critical for target validation in neuroscience drug discovery. This approach supports de-risking of therapeutic hypotheses by delivering quantitative, reproducible data on synaptic function that informs lead identification and predictive confidence in early discovery stages. The method’s adaptability to various brain regions enhances its utility across diverse therapeutic areas involving neuronal circuitry dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of synaptic connectivity and plasticity in identified neuronal pairs.
- Operational Value: Provides biological de-risking by confirming functional target engagement in a disease-relevant system with native-like synaptic properties.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by delivering precise, quantitative data on AMPA receptor-mediated currents and induction of LTP/LTD for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stable synaptic function for downstream pharmacological manipulation of pre- or postsynaptic neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through stable whole cell recordings lasting one to four hours, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Enhances screening readiness via organotypic slice cultures that maintain morphology and synaptic function similar to native tissue, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system compatibility by maintaining synaptic properties akin to native brain tissue, facilitating translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling long-term plasticity studies (LTP/LTD maintained over two hours).
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by characterizing failure rates and variability in synaptic responses across active connections.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involving synaptic modulation in hippocampal or related circuits.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic activity in minimal circuits of two synaptically connected neurons.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through measurable EPSCs and plasticity induction (LTP/LTD) in stable paired recordings.
- Analytics: Enables comparative analysis of conditions via precise measurements of AMPA receptor-mediated current amplitude (ranging from <10 pA to >800 pA) and plasticity persistence.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining synaptic function in organotypic slices over one to two weeks, mirroring native tissue properties.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiological capability across laboratories equipped for patch clamping, given adherence to hardware and methodological criteria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through precise, direct electrophysiological characterization of synaptic transmission and plasticity not achievable with extracellular stimulation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via stable gigaohm seals and consistent slice preparation in organotypic cultures.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic target validation, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative synaptic data, minimizing late-stage biological risk in CNS drug development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole cell patch clamp electrophysiology and visual identification of hippocampal subregions (CA3, CA1) under microscopy.
- Dependent on instrumentation including micromanipulators, amplifiers, and culture incubators maintained at 34°C with 5% CO2.
- Necessitates cross-team standardization in slice preparation, plating, and feeding schedules (twice weekly after initial feeding) to ensure healthy organotypic slices.
- Involves adaptation considerations for different neuron types (e.g., CA3-CA1 pairs) while maintaining synaptically connected preparations in the same slice.
- Limited by the technical challenge of achieving dual whole cell recordings, though success probability increases with stable micromanipulation and healthy slices.
