Name: 在器官型海马脑片搭配全细胞记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习在器官型海马脑片培养物中使用全细胞膜片钳技术进行配对记录，以分离两个神经元之间的最小突触回路活动。该方法适用于研究神经环路的基本特性。

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我们感谢蒙哥马利实验室和麦迪逊实验室成员提供的有益讨论。本研究得到了以下机构的资助：NFNZ、AMRF、马斯登基金、HRC 和 NIH。

动物伦理声明：
本手稿中描述的实验方案遵循奥克兰大学和斯坦福大学制定的动物护理指南。对出生7天的大鼠幼崽实施快速断头处死，随后立即按照下述方法进行海马体解剖。
1. 海马组织切片培养
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>配制解剖用培养基（仅用于脑组织解剖）。将200 ml最低必需培养基、2 ml青霉素-链霉素溶液（每种10,000单位，溶于0.85% NaCl）、5 ml HEPES缓冲液、2 ml 1 M Tris储备液（pH 7.2）混合，用0.22 μm滤膜过滤除菌。在冰冻的解剖培养基中进行海马组织解剖。</li>
		<li>冷却解剖液。在开始解剖前约1小时，将解剖液放入冷冻室，直至液体变得很冷。注意不要形成大的冰晶。使用前置于冰上保存。</li>
		<li>配制培养基（用于除海马体解剖以外的所有操作）。将100 ml含Hank's盐、含L-谷氨酰胺的最低必需培养基（1x浓度，液体）、2 ml青霉素-链霉素溶液（液体，每种10,000单位，溶于0.85% NaCl）、2.5 ml HEPES 1 M缓冲液、50 ml Hank's平衡盐溶液、50 ml马血清（定义型，热灭活）混合，用0.22 μm滤膜过滤除菌。</li>
		<li>准备培养皿。每个35 mm培养皿中加入1 ml培养基，并向每个培养皿中放入一个膜插件。将最多七个上述培养皿放入一个150 mm的培养皿（以下简称“板”）中。将该板置于CO₂培养箱中2 在开始解剖前，将培养皿置于培养箱中至少一小时，使培养基达到适当的温度和pH值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>出生后第7天（P7）大鼠幼崽海马组织的分离
	<ol>
		<li>在操作前，将所有解剖工具置于紫外光下进行预灭菌。</li>
		<li>快速断头后，取出脑组织并放入一个培养皿中的预冷培养基内，随后将其转移至湿润的滤纸上进行解剖。使用钝头光滑的塑料包被微型解剖铲，将大脑皮层从中脑分离，暴露海马体。切断穹窿，然后将解剖铲轻轻插入海马体下方，将其翻出（图1A). 
		注意：使用出生后10天（P10）以内的动物可成功制备脑片培养。</li>
		<li>将分离的海马体从脑的其他部分修剪下来。使用湿润的软毛画笔将海马体转移至含有冰冷解剖液的新培养皿中（例如，白鼬尾毛 #4）</li>
		<li>清洁底部（即 在解剖过程中，应将脉络丛的海马体较扁平一侧朝下放置，因为这些海绵状、类似脑膜的组织会增加后续分离海马切片的难度。 
		注意：如果这些组织无法轻柔地分离，应保持其原位不动。</li>
		<li>尽可能快速地完成整个解剖过程，同时避免损伤海马体。 
		注意：只要实验条件保持低温，细致的解剖比快速解剖更为重要。同时切取三只大鼠的海马组织。只要从开始操作至铺板的切片放入培养箱的总时间少于30分钟，切片的活性不会受到影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>使用手动组织切片器将海马沿横断面切成400 μm厚的切片。切片方法本身并不关键，只要不对组织造成过度损伤，并能产生厚度均匀、层状结构清晰可见的切片即可。即 海马角在组织中清晰可见。</li>
		<li>将海马体置于组织切片机的载物台上，台面铺有三层厚度的#2滤纸。海马体进行整体切片，期间不单独移除任何切片。即 整个海马体保留在切片机的载物台上，直至完成所有切片；此时的切片外观类似于多片切片面包。 图1B).</li>
		<li>用软毛画笔（白色獾毛 #2）轻轻置于每个海马旁，将海马转移至解剖液中。轻柔地将每个海马向一侧推动，以分离其与下方滤纸的黏连。将画笔在每个海马下方滚动，将其从载台上拾起。将所有海马放入同一盛有预冷解剖液的 35 mm 培养皿中。通过手动交替顺时针和逆时针摇晃培养皿，使海马彼此分离成单个切片。</li>
		<li>在解剖显微镜下检查切片，弃去任何受损、过小或细胞体层不清晰可见的切片。 
		注意：通常情况下，并非所有切片都能通过此方法成功地与其相邻切片完全分离。若出现此情况，可将切片边缘朝上，用精细镊子的尖端轻轻拨动进行分离。随后，使用剪断并经火焰抛光的巴斯德移液管，将“良好”的切片转移至另一洁净的、含有冰冷解剖液的培养皿中图1C-E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>储存
	<ol>
		<li>将单个脑片置于膜滤器插件上。使用剪切并火焰抛光以增大孔径的巴斯德吸管，将脑片逐个转移至培养插件中。 
		注意：切割并火焰抛光移液管时所形成的孔径大小至关重要。若孔径过小，脑片将难以顺利从移液管转移至膜表面；若孔径过大，则会在放置脑片的同时向膜表面带入过多液体。最佳孔径直径通常约为移液管管体直径的一半。在切割时，可通过在移液管锥形部位的适当位置进行切割，以获得所需的孔径直径。</li>
		<li>切片转移
		<ol>
			<li>先用移液器吸入培养基，然后用较小的吸力吸取单个脑片。这样可使脑片保持在移液器开口附近，避免将过多培养基排入插入式培养装置中，便于脑片的放置。</li>
			<li>在胶头上施加轻微压力，形成一小滴悬垂液滴，将切片放入该液滴中，然后将液滴接触膜表面，使切片“落下”并贴附于膜上。通常每个膜插件上放置三个切片。 
			注意：如果液滴过大，三个切片的液滴容易在膜表面合并，导致切片全部聚集到膜的中央，从而增加后续电生理记录时分离切片的难度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>液体清除
		<ol>
			<li>吸除该培养板内所有切片插件顶部多余的培养基（每个插件3个切片，每板共21个切片），确保切片不浸没或浸泡在解剖液中。</li>
			<li>使用未切割但经火焰抛光的巴斯德移液管进行此操作。让脑片沉降并黏附于膜上约一分钟后再进行移液。注意避免将脑片吸入移液管内。对最先接种的插入式培养插件进行液体移除，以确保脑片有足够时间沉降。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>切片保存
		<ol>
			<li>将脑片培养物置于5.0% CO₂条件下保存2 37 °C 培养箱中孵育。观察培养物的最终排列状态 图1E各个脑片置于一种底部带有孔隙膜的培养板插件上，该插件置于盛有少量培养基的培养皿内；通过这种方式，脑片不直接浸没于培养基中，而仅能通过培养板插件底部的膜获取营养。</li>
			<li>可选择通过移除培养板插件或切割含有脑片的插件膜部分来取出脑片进行研究。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维护
	<ol>
		<li>在培养后的第二天更换培养皿中的培养基。将培养板插件转移至新的培养皿中，新培养皿内含1 ml已在培养箱中平衡至少1小时的新鲜培养基。</li>
		<li>在培养后的第3天以相同方式更换培养基。第3天时，将培养物转移至设定为34 °C的培养箱中。此后每周更换两次培养基（每3-4天一次）。</li>
		<li>鉴定健康培养物。为配对全细胞记录选择健康的培养物。 
		注意：健康的培养物具有清晰的边缘和明确的锥体细胞层。若培养物出现暗区（可能为坏死区域）或空泡化现象，且边界扁平，则应弃用。采用这些标准，通常三分之二的脑片培养物足够健康，可用于记录。</li>
		<li>在较短的时间窗口内使用这些培养物。培养超过两周的组织请勿使用，因为神经元会开始表现出轻微的癫痫样活动，且这种现象会随时间推移逐渐加重。神经元存活的确切上限时间尚不明确，但已有记录显示，最晚可在培养至第16天时仍能从有功能的锥体细胞中获得有效记录。&#160;培养数周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 配对全细胞记录
<ol>
	<li>人工脑脊液（ACSF）和细胞内溶液
	<ol>
		<li>通过混合以下成分（单位：mM）配制突触前电极溶液：120 葡萄糖酸钾、40 HEPES、5 MgCl2、2 NaATP 和 0.3 NaGTP（用 KOH 调节 pH 至 7.2；渗透压：290 mOsm）。尽管突触后神经元使用相同的电极溶液，但通常以 120 mM 葡萄糖酸铯作为突触后电极溶液的主要盐成分，并额外加入 5 mM QX314。 
		注：这有助于在正电位下实现稳定的电压钳制，以记录突触后NMDAR介导的电流8-10,13。同时，在形成吉欧姆封接之前，可防止突触后记录电极内的溶液外流导致突触前神经元因钾离子而产生过度兴奋。</li>
		<li>配制突触后电极溶液，其成分为（单位：mM）：120 葡萄糖酸铯、40 HEPES、5 MgCl2、5 QX314、2 NaATP 和 0.3 NaGTP（用 CsOH 调节 pH 至 7.2；渗透压：290 mOsm）。将玻璃微电极拉制至 5–10 MΩ 的电阻，并用过滤后的细胞内液填充。</li>
		<li>配制人工脑脊液（ACSF），其成分为（单位：mM）：119 NaCl、2.4 KCl、1.3 MgSO4、2.4 CaCl2、1 Na2HPO4、26.2 NaHCO3、11 葡萄糖，pH 7.4，用 95% O2 和 5% CO2 饱和。注：若需阻断AMPAR介导的反应以检测NMDAR介导的兴奋性突触电流（EPSCs），可在ACSF中加入10 μM CNQX或NBQX。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取成对全细胞记录
	<ol>
		<li>为研究两个单个神经元之间的突触传递，将其中一个神经元指定为突触前神经元，并保持在电流钳模式下，以诱发动作电位并启动突触传递。</li>
		<li>将第二个神经元指定为突触后神经元，根据研究人员所需信息，将其保持在电流钳或电压钳模式下。通过将突触后神经元保持在电压钳模式，可在 -65 mV 检测AMPAR介导的EPSCs，在 +30 mV 检测NMDAR介导的EPSCs，从而对谷氨酸能电流进行详细分析6-16。</li>
		<li>建立成对记录。为建立成对记录，应首先获得突触前全细胞记录，以便依次尝试多个突触后神经元，直至找到具有突触连接的配对。若进行突触可塑性实验，则尤其需要先获取突触前神经元，因为必须在获得全细胞记录后的10分钟内启动突触后神经元中长时程增强（LTP）的诱导，以防止支持LTP所需的胞质因子流失8,19。</li>
		<li>避免因移动导致细胞丢失。在进行成对全细胞记录时，主要挑战之一是在获取第二个记录的同时，避免振动或移动破坏第一个全细胞记录。
		<ol>
			<li>先获得第一个全细胞记录，然后将显微镜物镜沿x轴移动10–200 μm，使已建立的记录位于显示器可视区域的边缘（图2A）。</li>
			<li>将显微镜物镜向上提升约5–10 mm，同时确保ACSF仍与物镜保持接触。安装第二个电极并引导其进入液面弯月面（图2B）。</li>
			<li>在x-y平面上移动电极，使其正好位于物镜光路正下方，但仍显著高于已建立的记录电极。当在显微镜下可见电极时，确保其尖端位于显示器远离第一个电极的远端边缘。</li>
			<li>逐步降低第二个电极，同时调节显微镜焦距，直至两个电极处于同一焦平面。正压的强度应足够强以防止尖端堵塞，但又不能过强以免破坏第一个全细胞记录。通常表现为电极初次进入脑片时，可引起2–3个邻近神经元的轻微移动。</li>
			<li>在与第一个突触前记录相近的焦平面内寻找一个突触后配对神经元（图2C）。通常在距第一个记录神经元0–200 μm范围内获取CA3锥体神经元之间的成对记录（图2C,D）。 
			注：采用这些标准全细胞记录技术时，神经元对之间的突触传递可在长达3–4小时的时间内保持稳定。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>突触可塑性：成功获得具有突触连接的锥体细胞对后（图3A,B），研究其突触传递特性及可塑性。
	<ol>
		<li>LTP诱导。
		<ol>
			<li>通过将突触前动作电位（1 Hz）与突触后去极化至 -10 至 0 mV 持续1分钟来诱导LTP（图3C）7-9,12-14。在突破至突触后神经元后的10分钟内启动配对刺激。 
			注：也可将两个神经元均保持在电流钳模式下，通过以1 Hz频率同步诱发突触前和突触后动作电位持续1分钟来诱导LTP，其中突触后动作电位在向突触前神经元注入电流后10毫秒诱发8。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过低频刺激（LFS）1 Hz并结合突触后神经元轻微去极化至 -55 mV 持续5–10分钟，进一步诱导长时程抑制（LTD）（图3C）9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations%2C+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li>
<li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn%2C+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
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作者无任何利益冲突可披露

本文介绍了在海马脑片器官型培养中建立成功的成对全细胞记录所需的技术要求。成对记录也可在多种其他制备样本中进行，包括急性脑片和离体细胞培养系统26,27。尽管本文重点在于诱导较长时间的突触可塑性（即长时程增强LTP和长时程抑制LTD），但需要强调的是，在器官型培养、急性脑片以及离体细胞制备中进行的成对全细胞记录，已为研究量子化大小、短时程可塑性、突触前功能以及LTP和LTD提供了重要的科学见解2,4,8,26,27。
器官型脑片系统的主要优势在于神经元之间具有更高的连接性。在急性脑片制备过程中，由于轴突连接被切断，导致突触连接性较低。根据我们的经验，在急性脑片中，仅有约5%的成对记录能够获得突触连接的CA3神经元，即95%的成对记录未发现连接。另一种替代方法是使用原代离体海马神经元培养，其突触连接性显著更高26然而，离体培养的分离制备物存在神经元身份鉴定困难，以及其特性是否与天然组织中成熟突触相似的问题。使用海马区脑片器官型培养可在一定程度上缓解这些担忧，因为神经元亚型易于识别，且细胞能够维持与天然脑组织相似的形态和连...

谷氨酸受体介导中枢神经系统突触处大部分的兴奋性突触传递。定位于突触后膜树突棘头部的两种主要离子型谷氨酸受体为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体。在静息膜电位下，AMPA受体在突触传递过程中承载大部分突触后电流。在海马中，NMDA受体在触发突触后膜AMPA受体数量变化方面起关键作用：它作为“共激活检测器”1，启动突触强度的改变1，参与被认为在亚细胞水平上支撑学习与记忆的突触机制。当突触后神经元去极化与突触前递质释放同时发生时，钙离子通过NMDA受体进入细胞，从而启动AMPA受体的插入或移除2。这些受体动态变化构成了突触可塑性的基础：突触强度的增强称为长时程增强2,3（LTP），而突触强度的减弱称为长时程抑制4（LTD）。因此，AMPA受体的移动被认为负责突触可塑性的表达，而NMDA受体则被认为控制其诱导过程。
确定突触传递和可塑性背后的精确机制需要研究少量突触，理想情况下是单个突触。尽管某些突触非常适合在此水平上进行研究，例如，&#160;耳蜗核的卡尔西突触（Calyx of Held）5，但对于大多数突触群体而言，由于突触连接体积微小且分布弥散，实现单突触水平的研究极为困难。目前已发展出两种主要的电生理学技术用于检测单个突触连接：第一种是最小刺激法，即假定通过细胞外刺激仅激活一条突触前纤维；第二种是成对记录法，即对存在突触连接的两个神经元同时进行全细胞记录。最小刺激法的一个主要优点是操作快速且相对简便，只需将细胞外刺激电极放置于轴突束中，同时记录突触后神经元的反应即可。然而，使用该技术的主要问题是难以在每一次实验中可靠地保证仅刺激到单个细胞。
在过去十五年中，我们常规采用对两个突触连接的锥体神经元进行配对全细胞记录的方法6-17该技术的主要优势在于能够持续且可靠地刺激单个突触前神经元。此外，该方法不仅允许对突触前神经元进行电生理学表征，还可对其进行药理学操控。6,18然而，神经元之间形成突触连接的概率较低，导致获取有连接的细胞对十分困难19使用脑组织切片培养可克服这一障碍，因为突触连接可在体外重新建立，且所形成的连接特性与天然脑组织中的相似20此外，器官型培养物可表达长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）7-10,12-15,21 以及其它形式的短期突触可塑性，包括成对脉冲易化（PPF）和成对脉冲抑制（PPD）6,22,23，从而能够在成对的神经元中研究可塑性机制。本文详细描述了在此成功获得成对记录所涉及的方法学细节 体外 该信息可轻松适用于其他实验系统，包括急性脑片及其他脑区。

<table><tbody><tr><td>最低必需培养基</td><td></td><td></td><td>稳定型电动显微操作器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>浅层组织浴槽</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td></td><td></td><td>DIC相机</td></tr><tr><td>1 M Tris储备液</td><td></td><td></td><td>放大器</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s平衡盐溶液</td><td></td><td></td><td>计算机</td></tr><tr><td>马血清&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>防振台</td></tr><tr><td>塑料涂层微型刮勺</td><td></td><td></td><td>直立显微镜</td></tr><tr><td>软毛画笔</td><td></td><td></td><td>数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>手动组织切片机</td><td></td><td></td><td>电极拉制仪</td></tr><tr><td>#2滤纸</td><td></td><td></td><td>法拉第笼</td></tr><tr><td>#5镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜插件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

器官型海马切片中的成对全细胞记录

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

成对记录技术涉及对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，不仅能够直接表征单个神经元之间的突触连接电生理特性，还可以对突触前或突触后神经元进行药理学操控。在海马脑片培养体系中进行该操作时，两个神经元之间形成突触连接的概率显著提高。该制备方法易于鉴定细胞类型，且神经元能够保持其形态以及与天然脑组织相似的突触功能特性。成对全细胞记录的一大优势在于，它能提供关于突触传递与突触可塑性特性的高度精确信息，而这些信息是其他采用细胞外轴突刺激的粗略技术所无法获得的。成对全细胞记录常被认为操作难度过高。尽管该技术确实存在挑战性，但任何接受过全细胞膜片钳训练的研究人员，只要遵循特定的硬件和方法学要求，均可成功实施该技术。获得突触连接的成对记录的成功率，与健康的脑片培养状态以及稳定的微操作系统的支持密切相关，后者可实现突触前和突触后全细胞记录的独立获取。虽然在脑片培养的海马组织中，CA3-CA3锥体细胞配对应用最为广泛，但该技术在CA3-CA1细胞对中也已成功实现，并可推广至同一脑片制备中任何存在突触连接的神经元组合。在本文中，我们将详细阐述在具备电生理设备的任何实验室中建立该技术所需的方法与条件。

通过记录电极向突触前神经元施加去极化电流脉冲（通常为20-50 pA，持续20毫秒）使其产生动作电位，从而观察突触连接的存在。随后检查突触后电流轨迹，寻找在突触前动作电位峰值之后较短（&lt;5毫秒）且潜伏期一致的时间点是否出现单突触兴奋性突触后电流（EPSC）（图3A）。在大多数实验中，需要测试多个突触后神经元才能获得具有突触连接的一对细胞。总体而言，约有1/3的突触前CA3细胞通过活性突触连接单突触地与突触后CA3细胞相耦合（图3A），而大约20%的CA3神经元之间通过全沉默突触连接相连6,8。
在配对记录中，基础AMPA受体介导的电流幅度在不同试验之间存在变异性，且在不同的独立配对记录之间也存在差异（图3B）6,8。平均AMPA受体兴奋性突触后电流（EPSC）幅度范围从<10 pA到>800 pA，这种差异可能源于不同配对记录之间功能性突触数量的不同。此外，不同配对记录之间的突触传递失败率也表现出显著差异6,7...

配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。

配对记录涉及对两个突触连接的神经元进行同时的全细胞膜片钳记录，不仅能够直接……

以下实验的总体目标是能够记录大脑中最小突触回路的电生理信号。该目标通过记录生长在塑料培养插入物中的大鼠海马区脑片组织培养物来实现。这些脑片在培养生长一段时间后，会形成复杂而恰当的突触连接，便于进行电生理记录。在这些脑片中进行记录，可分离出仅由两个神经元构成的最简单突触环路的突触活动，从而能够研究神经元环路最基本的特性。该方法可用于探究海马中突触微环路的功能，也可用于大脑中任何存在突触连接的邻近神经元区域。记录与解剖方法的可视化演示至关重要，因为许多操作步骤依赖于对脑部解剖标志和神经元的准确识别。在制备脑片之前，需提前准备好所有溶液和培养板。用于收集切片的每个大培养皿包含七个较小的培养皿，在组装过程中每个小培养皿均含有培养基和培养插件。将插件以一定角度放入培养基中，以避免截留空气。将这些培养皿小心地存放于培养箱中，并通过参照脑部结构标志物，在不造成损伤的情况下，从出生7天的啮齿类动物脑组织的每一半中仔细分离出海马体。首先，沿中线将大脑一分为二。然后使用精细的刮勺，将大脑皮层与中脑分离。将大脑剥开，以暴露海马体。接下来，用解剖刀尖切断穹窿，并将解剖刀插入内侧纵束（FIA）和海马下方。然后将海马从脑组织中轻轻卷出，并将其从附着的组织上切断。轻柔地将海马舀起，放入冰上预冷的解剖液中。继续采集第二个海马体。继续对两个海马体进行切片。将它们放置在切片机底座的载物台上，载物台表面铺有两层湿润的滤纸。第二步，使用滤纸。然后连续切出400微米的横切片，且不移除任何切片。结果类似于一片片切开的面包。保持厚度一致并轻柔操作至关重要。现在使用一支4号白色貂毛软画笔，轻轻将画笔在每个切片的海马体下方滚动，将其从切片台上提起。待两个海马体均转移后，盖上培养皿并用力旋转摇晃。频繁更换切割方向。目的是将切片分离。现在在解剖显微镜下检查切片，丢弃任何受损或小于预期的切片。此外，应弃去任何细胞层不清晰可见的切片，因为这同样表明切片已受损。未能分离的切片可将其边缘朝上，用 Dumont 镊子轻戳以强制分开。首先，用培养基填充移液管。然后轻轻吸取切片，使其靠近管口，施加轻微压力，在管尖形成液滴，并等待切片沉入液滴中。然后将液滴接触组织培养插件的表面。一旦切片明显位于插件上，即撤出移液器。如果液滴不过大，一个膜上可容纳三个切片。所有切片转移完毕后，使用巴氏吸管轻轻吸去每个切片周围的培养基。对已接种的插入式培养装置进行液体移除操作，首先需留出足够时间使切片充分沉降。现在盖上每个小培养皿，然后盖上大培养皿，并将整个装置放入培养箱中孵育。切片后第二天给组织切片换液，之后在切片后的第三天再次换液。将它们在第二次换液后转移至34摄氏度、5% CO2的培养箱中，并在此后每周换液两次。组织切片在制备后一至两周即可用于记录。在记录装置上，用手术刀完全切开培养插件底部并沿切片周围将其完整取出。用杜蒙特镊子取出切割好的

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在器官型海马脑片搭配全细胞记录

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

我们采用膜片钳技术来测量GABA激活的单通道电流（GABAA通道，GABAA受体）及其在神经元中产生的突触电流和紧张性电流。通道的激活可降低神经元在健康和疾病状态下的兴奋性1,2,3,4。...

大鼠脑切片中GABA激活的单通道电流和紧张性电流

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

该视频展示了一种研究转染小鼠海马脑片中突触相互作用和神经元反应的实验方案。该方法包括通过光照激活远距离感觉神经元以诱发动作电位，并利用全细胞膜片钳技术记录目标神经元中产生的兴奋性突触后电位。...

小鼠海马脑片中神经元的光刺激与全细胞膜片钳记录

本视频演示了在浸没式记录舱中放置脑切片以记录突触活动的操作流程。该过程包括将切片固定在镜片纸上，持续灌注人工脑脊液（aCSF）以维持神经元的活性，以及将刺激电极和记录电极准确地定位在特定的目标脑区附近。该装置可实现对基础突触活动以及电刺激效应的精确监测。...

记录急性海马脑片中的神经元场兴奋性突触后电位

我们描述了从水生虎纹蝾螈（Ambystoma...

在两栖动物视网膜切片标本中对光感受器与二级神经元进行全细胞同步记录

皮层网络由少量但类型多样的抑制性中间神经元所调控。因此，对中间神经元的功能研究需要靶向记录和严格鉴定。本文描述了一种联合方法，包括对单个神经元或突触耦合的成对神经元进行全细胞记录并结合细胞内标记，以及后续的形态学和免疫细胞化学分析。...

对形态学和神经化学鉴定的海马中间神经元进行全细胞膜片钳记录

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。...

脑片中的全细胞膜片钳记录

本方案描述了从小鼠中制备表现出自发尖波涟漪活动的水平海马-内嗅皮层（HEC）切片的方法。切片在简化的界面式孵育室中孵育，并在浸没条件下用快速流动的人工脑脊液进行记录，以促进组织供氧及网络水平自发活动的出现。...

急性小鼠脑切片以研究海马区自发性网络活动

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

学习在器官型海马脑片培养物中使用全细胞膜片钳技术进行配对记录，以分离两个神经元之间的最小突触回路活动。该方法适用于研究神经环路的基本特性。

器官型海马切片中的成对全细胞记录

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