高效转染人THP-1巨噬细胞的核转染方法

本实验的总体目标是实现对人源 THP-1 巨噬细胞的稳定转染，同时保持高细胞存活率且不引起细胞活化。该目标首先通过将 THP-1 单核细胞预诱导分化 48 小时来实现。实验的第二步是收集未成熟的 THP-1 巨噬细胞。

第三步是使用龙沙公司的核转染技术，将细胞转染小干扰RNA或质粒DNA。最后的步骤是重新接种细胞并进一步诱导其分化。最终，可通过定量实时PCR、Western blot等方法验证基因敲低或过表达是否成功。

与脂质体转染等其他转染方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够同时实现高转染效率和高细胞存活率，并且不会改变巨噬细胞的功能和行为。然而，该技术不适用于高通量应用，因为在本实验方案中，每次只能进行一次转染操作。在转染前24小时，将THP-1细胞培养于含10% FCS以及1%青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，随后对细胞进行传代并更换新鲜培养基。

第二天。将1000万至1500万个细胞接种于一个75平方厘米的组织培养瓶中，进行细胞预分化。在补充型RPMI培养基中加入以下成分：1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、10纳克/毫升PMA和50微摩尔β-巯基乙醇。48小时后，吸去培养基，加入6毫升已预热至37摄氏度的阿曲波胺（Accutane），以使细胞脱落。

孵育30分钟。准备足够的转染培养基和常规培养基，用于细胞核转染后的培养。30分钟后，检查细胞是否已脱落并呈圆形。

如果仍有部分细胞附着，可使用微量移液器轻轻吹打培养瓶或进行轻柔振荡以使细胞脱落。切勿使用细胞刮。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟，用抽吸法去除上清液，并重新悬浮细胞沉淀。

在 1 毫升预热至 37 摄氏度的 RPMI 培养基中，计数细胞，并立即分装成含有 200 万至 250 万个细胞的微量离心管 aliquot，用于瞬时转染。本实验方案的快速执行至关重要。为避免细胞活力下降，务必提前准备好所有材料。首先，在室温下以 250 × g 离心所有转染 aliquot 10 分钟；在离心过程中，将每管核酸转染试剂加入 0.5 微克质粒 DNA 或 1 微克 siRNA。使用高浓度稀释液，使其占据最小的试剂体积。

现在仅从一份细胞等分试样中吸走上清液。将细胞重悬于100 µL核转染溶液中。切勿让细胞在溶液中暴露超过15分钟。

将细胞转移至Q vet中，并通过轻柔敲击混匀。然后使用型号为Two B Nucleo Factor的仪器，选择程序Y 0 0 1对细胞进行转染。用一次性移液管将电穿孔后的细胞转移至反应管中，并立即向细胞中加入0.5 mL预热的转染培养基。

现在依次对每一份细胞样品重复此过程，直到所有样品均完成转染。核转染完成后，将每份转染后的细胞转移至六孔板中的一个孔，每孔加入2.5毫升预热的转染培养基。使用微量移液器充分混匀每个孔中的液体。

在将所有接种好的培养板孵育四小时后，在显微镜下检查细胞状态。四小时后，大多数细胞应已贴附于培养板上（如有需要，最多如此）。

再孵育一小时将提供足够的 sahe，一次操作一个孔。吸去贴壁细胞中的转染培养基，并加入等体积的温热培养基。此步骤中需小心，避免细胞脱落。

现在，根据需要孵育细胞。必要时，每 48 小时更换一次培养基，并规划处理时间，使处理在转染的 DNA 或 RNA 达到最大效应时结束。用效应物处理细胞时，使用不含 PMA 和β-巯基乙醇的无血清培养基。

注意不要让细胞在无血清条件下孵育超过24小时。本实验采用该方案对THP-1巨噬细胞进行RNA转染，并根据流式细胞术测量结果评估细胞形态学变化。

在转染组和对照组培养物中，细胞的凋亡和坏死率均较低。然而，仔细计数后发现，转染样本中的凋亡和坏死程度略高。这可能是因为转染的THP-1巨噬细胞比未转染（UNT）细胞更难从培养板上脱离所致。

总体而言，通过流式细胞术分析，转染效率超过90%。通过荧光显微镜观察荧光标记的S-I-R-N-A，也证实了转染效率。通过IL10RB表达的基因敲低实验验证了转染的功能性。

使用短干扰RNA，一旦掌握该技术，若操作得当，转染可在一至一个半小时内完成。在进行该操作时，需注意培养基对实验效果具有显著影响，这一点在文本方案中有详细说明。