人THP-1巨噬细胞通过核转高效转染

该程序的总体目标是可靠地转染具有高细胞活力且无细胞活化的人 THP one 巨噬细胞。这是通过首先预分化 THP one 单核细胞 48 小时来实现的。该程序的第二步是分离过早的 TP 1 巨噬细胞。

第三步是使用 lonza 的核因子技术，用 IRNA 或质粒 DNA 转染细胞。最后的步骤是重新播种并进一步分化细胞。最终，可以通过定量实时 PCR、Western blot 回印等结果显示成功的基因敲低或过表达。

与脂肪转染等其他转染方法相比，该技术的主要优点是我们可以实现高转染效率和高细胞活力，并且不会改变微噬细胞的功能和行为。遗憾的是，该技术不适用于高 sput 应用，因为对于此方案，一次无法进行更强烈的转染。转染前 24 小时，在含有 10% FCS 和 1% pen 链球菌 L 谷氨酰胺的 RPMI 1640 中培养 THP one 细胞，分流细胞并向其提供新鲜培养基。

第二天。将 10 至 1500 万个细胞接种在 75 平方厘米的组织培养瓶中，并在补充的 RPMI 培养基中添加以下成分、1% 非必需氨基酸、1% 丙酮酸钠、10 ng/mL、PMA 和 50 μmol β 巯基乙醇，48 小时后，吸出培养基并用 6 mL Accutane 替换。一个加热到 37 摄氏度以分离细胞。

孵育过程中将它们孵育 30 分钟。准备足够的转染培养基和培养培养基，用于细胞的核后感染护理。30 分钟后，检查细胞是否分离并环顾四周。

如果一些细胞仍然附着，请用微量移液器轻轻泵送培养瓶，或使用简单的搅拌将其分离。不要使用刮刀。将悬浮液转移至 15 mL 试管中，在 300 Gs 和室温下离心 5 分钟，抽吸去除上清液，然后重悬细胞沉淀。

在一毫升 RPMI 中，培养基预热至 37 摄氏度，对细胞进行计数，并制成含有 2 至 250 万个细胞的微量垃圾管等分试样，以便立即转染。快速执行此协议至关重要。为避免细胞死亡损失，请务必提前准备好所有材料 首先离心，将所有转染等分试样在 250 GS 和室温下离心 10 分钟，当它们旋转时，向所有核效应子 vet 加载半微克质粒 DNA 或一微克 SI RNA 使用高度浓缩的稀释液，使它们占据最少的 vet 体积。

现在仅从其中一个细胞等分试样中吸出上清液。将细胞悬浮于核因子溶液中至 100 μL。不要让细胞暴露在溶液中超过 15 分钟。

将细胞转移到 Q 兽医中，轻轻敲击混合。然后使用程序 Y 0 0 1 在模型 2 B 核因子上转染细胞。使用一次性移液器将电穿孔细胞移至反应瓶中，并立即向细胞中加入半毫升预先警告的转染培养基。

现在继续对每个等分试样的细胞逐个重复该过程，直到它们全部转染。完成细胞核处理后，将每次细胞转染转移到装有 2.5 mL 温转染培养基的 6 孔板的孔中。用微量移液器将每个充分混合。

让所有加载的板孵育 4 小时后，在显微镜下检查细胞的状态。4 小时后，如果需要，大部分细胞应粘附在板上。至多。

再孵育一小时将提供足够的 sahe 一次很好地工作。从贴壁细胞中吸出转染培养基，并用等体积的温热培养培养基替换。在此步骤中，请小心避免分离细胞。

现在，根据需要孵育细胞。如有必要，每 48 小时更换一次培养基，计划进行处理，以便在转染的 DNA 或 RNA 达到峰值效果时结束处理。当用效应子处理细胞时，使用不含 PMA 和不含 β 巯基乙醇的无血清培养基。

注意不要让细胞在没有血清的情况下孵育超过 24 小时。该方案用于转染，评估具有 IRNA 细胞形态的 THP 1 巨噬细胞。根据流式细胞术测定。

在转染和对照培养物中，细胞凋亡和坏死率均较低。然而，仔细计数显示，转染样品的细胞凋亡和坏死都略高。这可能是因为转染的 THP one 巨噬细胞比 UNT 转染的细胞更难从平板上分离。

总体而言，通过流式细胞术分析，转染率高于 90%。使用荧光 S-I-R-N-A 转染效率也通过荧光显微镜检查得到证实。转染的功能通过 IL 10 RB 表达的基因敲低来显示。

使用短干扰 RNA一旦掌握，如果作得当，可以在 1 到 1 个半小时内完成转染。在尝试此过程时，请务必记住培养基对性能有相当大的影响。这在文本协议中进行了概述。