Name: 人THP-1巨噬细胞通过核转高效转染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习使用核转染技术高效转染人THP-1巨噬细胞的方法，该方法在保持高细胞活力的同时实现超过90%的转染效率，适用于基因敲低或过表达研究。

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我们感谢龙沙集团有限公司（Lonza Group Ltd.）通过承担出版费用赞助本出版物。感谢德国心肌梗死研究基金会（Deutsche Infarktforschungshilfe）、威廉·瓦扬基金会（Wilhelm-Vaillant-Stiftung）、欧内斯特·索尔维基金会（Ernest-Solvay-Stiftung）以及图林根州教育、科学与文化部（Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur）为SL提供的经费支持。

1. THP-1 巨噬细胞的预分化
<ol>
	<li>在含10% (v/v) 胎牛血清（FCS）和1% (v/v) 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）的RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养THP-1细胞。</li>
	<li>转染前，将细胞传代并转移至新鲜RPMI培养基中，同前培养24小时。</li>
	<li>将1.0–1.5 × 107个细胞接种至75 cm²组织培养瓶，或2.5 × 107个细胞接种至150 cm²组织培养瓶，使用RPMI-1640培养基，并添加10% (v/v) FCS、1% (v/v) PSG、1% (v/v) 丙酮酸钠、1% (v/v) 非必需氨基酸、10&#160;ng/ml PMA和50 µM β-巯基乙醇，培养48小时。</li>
</ol>
2. 核转染的准备
<ol>
	<li>将Accutase I及所有培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>吸除培养瓶中的培养基，加入6 ml（75 cm²培养瓶）或12 ml（150 cm²培养瓶）的Accutase I，于37 °C孵育30分钟，以实现细胞完全解离。使用Accutase I处理后观察细胞形态，确保细胞呈圆形。若仍有部分细胞附着，可小心用移液器冲洗培养瓶或轻轻敲击以完成解离。切勿使用细胞刮刀，以免影响细胞活力。将细胞悬液转移至15 ml离心管中。</li>
	<li>在Accutase I处理期间，准备以下培养基：
	<ol>
		<li>制备转染培养基：在细胞培养基中添加1%（v/v）PSG、1%（v/v）非必需氨基酸、1%（v/v）丙酮酸钠，以及5%（v/v）人血清（用于siRNA）或20%（v/v）人血清（用于质粒DNA）；最终体积可按每份3 ml（用于一个6孔板）或每份4 ml（用于两个12孔板）进行配制。</li>
		<li>制备培养培养基：在培养基中添加1%（v/v）PSG、1%（v/v）非必需氨基酸、1%（v/v）丙酮酸钠，以及5%（v/v）人血清（用于siRNA）或20%（v/v）人血清（用于质粒）、2.5 ng/ml PMA和50 µM β-巯基乙醇；最终体积可按每份3 ml（用于一个6孔板）或每份4 ml（用于两个12孔板）进行配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以300 x&#160;g离心5分钟。</li>
	<li>吸除Accutase I，用预热至37 °C的1 ml RPMI培养基重悬细胞，并进行细胞计数以确定细胞数量。 
	注意：若采用快速自动细胞计数方法，可省略步骤2.4和2.5，细胞解离后立即计数即可，但应避免细胞长时间暴露于Accutase I中。</li>
	<li>为每份转染样品在离心管中分装含有2.0–2.5 × 106个细胞的细胞悬液。</li>
</ol>
3. THP-1 巨噬细胞的核转染
<ol>
	<li>将所有等份试样在室温下以 250 ×&#160;g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将质粒 DNA 或 siRNA 溶解于无核酸酶的水或适当的缓冲液中。尽量减少所需质粒 DNA 或 siRNA 的体积。</li>
	<li>每个转染样品准备一个电转杯，其中加入 1 µg siRNA 或 0.5 µg 质粒 DNA。</li>
	<li>每次进行一个转染实验。吸除细胞等份试样中的上清液。</li>
	<li>用 Nucleofector 溶液重悬沉淀细胞，使 DNA/siRNA 与 Nucleofector 溶液的总体积为 100 µl。尽量减少细胞在纯 Nucleofector 溶液中的暴露时间，并确保暴露时间不超过 15 分钟。</li>
	<li>轻轻敲击电转杯，混匀重悬的细胞与 DNA/siRNA。</li>
	<li>在 Nucleofector 2b 仪器上运行程序 Y-001 以完成细胞转染。</li>
	<li>使用一次性塑料巴斯德吸管将转染后的细胞转移至反应管中。</li>
	<li>立即加入 500 µl 预先准备好的转染培养基。</li>
	<li>对每个转染样品重复步骤 3.4 至 3.9。</li>
</ol>
4. 核转染后的护理
<ol>
	<li>为转染细胞准备6孔或12孔板。向6孔板的每孔中加入2.5 ml转染培养基（每转染使用1孔），或向12孔板的每孔中加入1.75 ml转染培养基（每转染使用2孔）。</li>
	<li>用移液器充分混匀细胞悬液。</li>
	<li>将转染后的细胞转移至已准备好的孔中（6孔板中为1孔，或12孔板中为2孔）。</li>
	<li>将培养板置于加湿培养箱中孵育4小时（5% CO2，37 °C）。</li>
	<li>在显微镜下检查细胞重新贴壁情况。 
	注意：大多数细胞应已重新贴附。若贴壁不足，偶尔可将孵育时间延长1小时，以增加贴壁细胞数量。</li>
	<li>用移液器小心吸除转染培养基，并替换为等量的培养培养基。每次仅吸除一个孔的培养基。</li>
	<li>孵育细胞所需时间以达到质粒或siRNA的最大效应（24–72小时）。若孵育时间超过48小时，应在48小时后更换培养基。</li>
	<li>如需进一步使用效应分子（例如，细胞因子、激动剂、拮抗剂和抑制剂）处理，请使用不含PMA和β-巯基乙醇的无血清培养基。应将效应分子的孵育结束时间与质粒或siRNA的最大效应时间同步，并据此规划换液和添加效应分子的时间。细胞在无血清条件下培养时间不得超过24小时。</li>
</ol>

<ol><li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li>
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<li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li>
<li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP47%2C+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li>
<li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy%3A+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li>
<li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li>
<li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates%3A+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li>
<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li>
</ol>

本视频文章的出版费用由&#160;Lonza Group Ltd.&#160;赞助。

本文所述方案提供了一种可靠且高效的转染THP-1巨噬细胞的方法，而这类细胞通常较难转染。使用该方法进行siRNA转染时，转染效率可超过90%，且细胞活力无明显下降。由于质粒体积较大，其转染效率可能较低，但通常仍可达到约70%。siRNA介导的基因敲低效率可达80%至90%，具体取决于所使用的siRNA。该方案的一个主要优势在于其不影响细胞的分化能力。转染后的细胞对分化诱导剂PMA仍能正常响应（图1A至1B以及图4）12。此外，细胞在细胞因子刺激下的极化过程（如IL10或LPS/IFNγ刺激）也不受影响12，尽管这一点在很大程度上还取决于转染后培养所选用的培养基，如图4所示。
该实验步骤中包含若干可选方案，可根据具体需求对方案进行调整。如图4所示，转染后选择不同的培养基，细胞对相同IL10刺激的反应存在差异，这表明培养基成分对细胞行为具有显著影响。由于不同实验刺激下培养基所产生的效应可能不同，因此最适培养基可能随之变化，需针对不同实验独立验证培养基的适用性。然而，THP-1细胞常规培养所用的RPMI-1640培养基在转染后的培养中表现不佳，因观察到细胞活力显著下降。此外，本方案也可应用于未经PMA诱导分化的THP-1单核细胞，这显然可省去细胞解离步骤，其余操作流程则无需调整。若需要，可在后续实验中对THP-1单核细胞进行分化处理。
该实验方案中最关键的两个环节首先是细胞的解离，其次是转染所需的时间。解离过程必须尽可能轻柔，以保持较高的细胞活力。因此，我们推荐使用相对温和的酶解法——Accutase I，而不是胰蛋白酶消化等较为剧烈的方法。其他解离方法，如利多卡因处理或刮取，已被发现对细胞损伤较大，不应使用。如果使用 Accutase I 处理 30 分钟仍未能充分解离所有细胞，通常表明 Accutase I 溶液储存不当、已过期或经历了过多的冻融循环。我们通过将 Accutase I 分装成小份并保存于 -20 °C，有效减少了冻融次数，并取得了良好的效果。然而，若解离不充分，可更换为新鲜的 Accutase I，或将孵育时间延长至 1 小时。此外，轻轻敲击或冲洗培养瓶或培养板也有助于细胞解离。关于转染所需时间，细胞暴露于纯核转染溶液中的时间对细胞存活率影响较大，因此应尽可能缩短。实现这一点的最佳方式是依次进行每次转染（步骤 2.10 至 2.15），而不是同时平行进行多个转染操作。
如果基因敲低效率较低，通常并非由转染效率低下引起，但可通过流式细胞术或荧光显微镜结合荧光标记的siRNA或编码GFP的质粒进行简单验证。大多数情况下，原因在于siRNA或质粒DNA本身效率不高。在此情形下，应考虑增加siRNA用量（最高至2-3 µg）或质粒DNA用量（最高至1-2 µg），或更换不同的siRNA或表达载体（如有）。此外，也可尝试使用针对同一靶点的多种不同siRNA混合物，以获得满意的结果。同时，可能需要进行时间进程实验，以准确确定最佳作用时间段，该时间段通常在转染后24至72小时达到峰值。
除了电穿孔转染外，还有其他一些成熟的哺乳动物细胞转染技术。常用的方法是化学转染试剂，这类试剂可与目的核酸形成复合物，进而促进其进入细胞。最常用的试剂主要包括基于不同脂质种类的转染试剂，或多种阳离子聚合物3。针对这两种方法，市面上均有多种选择。这些转染试剂的优点在于通常操作简便、耗时较短，并且适用于贴壁细胞，因此无需进行细胞消化脱落。然而，巨噬细胞通过这些方法转染较为困难，因为它们在体外（in vitro）增殖能力较弱，并具有针对外源胞质DNA的防御机制13-15。因此，化学转染方法常常导致细胞活力显著下降。但如图2所示，某些化学转染试剂仍可成功将siRNA导入巨噬细胞；然而，流式细胞术（图2A）和荧光显微镜（图2B）分析表明，其在细胞内siRNA分布的均一性方面无法达到核转染（Nucleofection）的效果。事实上，流式细胞术数据显示，化学转染后存在两种不同的细胞群体：第一类细胞的荧光强度与核转染后的细胞相似；第二类细胞则表现出更强的荧光信号。尽管尚需确切验证，但我们推测，在荧光显微镜下，第一类细胞对应于胞质内荧光siRNA呈均一分布的细胞，而第二类细胞则可能对应于含有强烈荧光聚集物的细胞。如图2A所示，流式细胞术结果提示，核转染每细胞摄入的siRNA量少于脂质体转染（lipofection）方法。然而，图3的数据表明，即使核转染所摄入的siRNA量相对较少，也已足以实现靶基因80%至90%的沉默效果。因此，化学转染第二类细胞中额外摄入的siRNA很可能是过量的，更可能引发非预期的副作用，而非进一步提高基因沉默效率。此外，细胞内形成聚集物本身即为不利现象，因为这些siRNA分子可能无功能，或至少比游离的siRNA分子效率更低，并可能引起脱靶效应。目前这些聚集物的确切性质尚不明确。这些明亮的斑点可能代表内体，提示siRNA已被细胞内化，但未能从内体中有效释放，导致siRNA被困于其中而失去活性；或者，这些斑点也可能是细胞内形成的siRNA聚集物。化学转染的功能性评估仍在进行中，因此目前尚无法对其基因沉默效率做出明确结论。但仅就存在两个明显不同细胞群体而言，该方法已处于劣势，因为所有实验结果均反映的是两类细胞的平均值，无法真实代表其中任一群体的特性。基于上述原因，核转染是更为优越的方法。
然而，此处所述的转染程序也存在一定的局限性。由于细胞在进行核转染（Nucleofection）时必须处于悬浮状态，贴壁细胞需要先被消化脱离，这会对细胞造成额外的应激。此外，整个实验流程较为耗时。由于转染操作无法同时进行，且必须快速完成以避免细胞损伤，因此每次实验处理的样本数量通常限制在8至10个左右。因此，该方案不适用于高通量筛选项目。针对高通量应用，已有其他Nucleofector系统可供选择。首先是4D-Nucleofector系统，其提供16孔条板格式；对于更高通量的需求，则有96孔Shuttle系统和384孔HT Nucleofector系统。然而，这些新型系统采用导电聚合物电极而非铝电极，因此其电转条件有所不同。 即 程序和Nucleofector溶液的组成已相应改变，需要确定我们的方案是否可转移至这些系统。
然而，尽管存在这些局限性，本文所述的方案仍能实现对THP-1细胞可靠且高效的转染，优于所有其他非病毒方法。该方案可研究基因表达改变对THP-1细胞的影响，同时确保细胞在其他所有方面均能正常分化和极化，从而尽可能减少转染带来的副作用。

在人类免疫系统的细胞成分中，巨噬细胞对先天免疫反应具有重要意义。其功能多样，可参与病原体和坏死物质的吞噬作用，在组织稳态中发挥重要作用，并产生和分泌大量细胞因子，以调节和协调免疫反应1因此，巨噬细胞广泛参与多种生理过程及病理生理状态。由于其功能的多样性，巨噬细胞是一种高度异质且具有多种表型的细胞类型。这种多样性通过不同的极化状态实现；根据外界刺激的不同，巨噬细胞可分化为不同的表型。2巨噬细胞的异质性及其对免疫反应的影响使其成为极具吸引力的研究对象。为了阐明其复杂的代谢与调控功能，需要采用合适的巨噬细胞 体外 需要能够正确反映巨噬细胞异质性和可变性的模型。
为了改变细胞基因表达，将质粒DNA载体或小干扰RNA（siRNA）转染入细胞已成为细胞生物学中研究基因调控和基因功能的一种广泛应用且功能强大的工具。目前，可用于真核细胞转染的工具种类繁多，包括病毒载体、机械方法（如基因枪）、化学方法（依赖于可与核酸形成复合物的聚合物或脂质）以及电穿孔技术3。这些方法各有优缺点，针对特定细胞类型和实验需求从众多方法中选择最合适的一种，可能是一个困难且耗时的过程。
巨噬细胞 notoriously 难以转染，因为几乎所有成熟的转染方法都会显著降低巨噬细胞的存活率，或干扰其生物学行为，即 分化，尤其是极化过程。因此，本文介绍一种高效、非病毒的转染人 THP-1 巨噬细胞的方案，采用基于电穿孔的 Nucleofector 技术，该技术是一种优化的电穿孔方法，所需 DNA 用量较少。Nucleofection 特别适用于单核细胞和巨噬细胞等敏感细胞。本方案是在先前已发表版本4,5的基础上进行的优化。
简而言之，佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）用于将人THP-1单核细胞诱导分化48小时，使其成为前体巨噬细胞，随后进行siRNA或质粒DNA转染。转染前，通过Accutase I酶处理将已预分化的巨噬细胞解离。转染过程采用Nucleofector 2b电转染仪对细胞进行电穿孔。转染后，根据需要继续培养24至48小时以完成分化。最后，将成熟的转染巨噬细胞与不同类型的化合物共同孵育，以开展功能研究。
该方法可用于转染人THP-1单核细胞和巨噬细胞等细胞系，并已在过去成功应用6-10。与大多数化学转染方法相比，我们改进的核转染程序在使用前体巨噬细胞时，能够在保持细胞活力不受影响的同时实现高效的转染，且无需使用病毒载体或添加具有未知副作用的辅助化合物。此外，转染后的巨噬细胞仍保持完整的分化和极化潜能，从而可在转染后不受干扰地进行功能学研究11。
此外，核转染后所使用的细胞培养基会显著影响转染后的功能研究，特别是巨噬细胞的极化能力可能因所用培养基的不同而受到影响。本研究在去活化条件下使用白细胞介素（IL）10，测试了四种不同的细胞培养基（IMDM、X-VIVO 20、LGM3 和 Mouse T Cell Nucleofector medium）。利用 THP-1 巨噬细胞，我们观察到，与其他上述培养基相比，使用 Mouse T Cell Nucleofector medium 时，细胞对 IL-10 的反应性最强。这些结果表明，为获得成功的转染及后续功能研究，对所有细胞培养条件进行适当优化至关重要，因为这可能会显著改善实验结果。
由于巨噬细胞参与多种人类疾病，大量研究致力于阐明巨噬细胞的行为及其调控机制，这些机制可能影响巨噬细胞，或反过来由巨噬细胞所控制。因此，本实验方案在多个不同的研究领域中均具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>Accutase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>PAA</td><td>M11-003</td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 ml）</td><td>TPP</td><td>TPP91015</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS gold）</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>人单核细胞核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td>包含核转染液、比色皿和巴斯德移液管</td></tr><tr><td>人血清（去凝块）</td><td>Lonza</td><td>C11-020</td><td></td></tr><tr><td>改良伊格尔培养基（IMDM），含25 mM HEPES和25 mM L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞生长培养基3（LGM3）</td><td>Lonza</td><td>CC-3211</td><td></td></tr><tr><td>小鼠T细胞核转染培养基</td><td>Lonza</td><td>VZB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（100倍浓度）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所1640培养基（RPMI 1640）</td><td>PAA</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>siRNA / 质粒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>THP-1人白血病单核细胞</td><td>CLS</td><td>300356</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶（75 cm&amp;sup2;；150 cm&amp;sup2;）</td><td>TPP</td><td>TPP90076/TPP90151</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板（6孔；12孔）</td><td>TPP</td><td>TPP92406/TPP92012</td><td></td></tr><tr><td>离心管（1.5 ml）</td><td>StarLab</td><td>S 1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水或适当的siRNA/质粒缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含庆大霉素的X-Vivo 20培养基</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

高效转染人thp-1巨噬细胞的核转染方法

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

巨噬细胞作为先天免疫反应的关键参与者，是研究组织稳态或多种病理过程的关注焦点。利用siRNA和质粒DNA转染是研究其功能的有效工具，但巨噬细胞的转染并非易事。尽管目前已有多种针对真核细胞的转染方法，但仅有少数方法能够实现巨噬细胞的可靠且高效的转染，且常伴随细胞活力下降以及细胞行为严重改变（如分化或极化能力减弱）等问题。因此，亟需一种能够在不引起严重副作用的前提下，将siRNA和质粒DNA导入巨噬细胞的转染方案，从而可在正常细胞行为背景下研究siRNA或质粒的作用。本文所介绍的方案可实现对人源THP-1巨噬细胞和单核细胞的高效、可靠转染，同时保持高细胞活力、高转染效率，并对细胞行为影响最小。该方法基于核转染技术，并经过优化以确保转染后细胞仍具有最大程度的活化能力。该方案适用于消化后贴壁细胞以及悬浮细胞，可用于小到中等规模的样本量。因此，该方法适用于研究巨噬细胞分化与极化过程中基因调控效应。除展示按照本方案转染的巨噬细胞特性结果，并与一种替代性化学转染方法进行比较外，本文还讨论了转染后细胞培养基选择对细胞行为的影响。所展示的数据表明，在不同实验条件下，对培养基等试剂的选择进行验证至关重要。

采用本方案对THP-1巨噬细胞进行siRNA转染，通常可实现超过90%的转染效率，且细胞活力未出现显著下降。图1展示了转染后24小时的代表性数据，比较了使用荧光标记siRNA转染的细胞与未转染对照组的细胞状态。对照组未接受核转染（Nucleofection）试剂、电脉冲或siRNA处理，但培养基更换操作与转染组相同。图1A显示了基于流式细胞术检测的细胞形态学特征，图1B展示了显微镜图像。图1C和1D显示了较低的凋亡率（对照组：1.5%；核转染组：5.4%）和坏死率（对照组：2.0%；核转染组：3.2%），表明细胞活力未受影响。转染组的凋亡和坏死水平略高，原因是转染后的THP-1巨噬细胞比未转染细胞更难解离，因此在解离过程中细胞损伤的概率增加。最后，图1E展示了转染效率。由于整个转染群体相对于对照组发生了明显偏移，表明所有细胞均被成功转染，这一结果也得到了荧光显微图像（图2B）的证实。流式细胞术数据和荧光显微图像均表明，所有细胞均实现了稳定转染，且siRNA在细胞间和细胞内呈均一分布。这与许多化学转染试剂的效果形成对比；作为比较，图2A和图2B分别展示了采用脂质体法的化学转染试剂对应的流式细胞术数据和荧光显微图像。这些图像显示，可检测到两个明显不同的转染细胞群体：第一群细胞与核转染后的细胞相似，其特征为整体荧光信号较弱，且细胞内siRNA分布均一；第二群细胞则表现出更强的荧光信号，来源于细胞内siRNA形成的明亮聚集物。图2C中的微分干涉差显微镜图像显示，两种转染方法均未影响细胞形态。使用质粒DNA进行转染亦可获得基本相似的结果，具体示例请参见Robenek et al. (2009)9 或 Xie et al. (2006)7。
转染后细胞培养基的选择具有重要意义，因此对不同细胞培养基进行了比较测试。所选培养基均适用于THP-1细胞的培养，并根据Lonza公司的建议，选择了适用于核转染后培养的培养基。图3展示了使用靶向IL10RB（白细胞介素10受体β链）mRNA的siRNA所介导的基因敲低效率。在所有测试的培养基中，IL10RB的表达均显著降低至对照组水平的约10%至20%（图3）。然而，转染后的细胞在不同培养基中表现出不同的极化潜能。将转染了非特异性对照siRNA或IL10RB特异性siRNA的THP-1巨噬细胞在转染后分别置于不同培养基中培养，并用IL10处理，随后通过RT-qPCR检测IL10诱导基因SOCS3（细胞因子信号转导抑制因子3）在mRNA水平的表达量。不同培养基在SOCS3 mRNA表达的诱导程度上存在差异（图4），在Mouse T Cell Nucleofector Medium、LGM3、X-VIVO 20和IMDM这四种测试培养基中的诱导倍数分别为19.5 [17.7–21.5]、11.5 [8.5–15.7]、8.0 [4.6–14.2]和7.2 [5.6–9.5]。因此，使用Mouse T Cell Nucleofector Medium至关重要。此外，在IL10处理后，IL10RB基因敲低对SOCS3表达的影响在不同培养基中也存在差异：SOCS3 mRNA的表达水平在Mouse T Cell Nucleofector Medium中降低至9.5 [8.8–10.3]倍，在LGM3中为2.1 [1.1–4.1]倍，在X-VIVO 20中为4.8 [3.2–7.2]倍，在IMDM中为3.3 [2.7–3.9]倍。这些数值对应于SOCS3表达在不同培养基中分别降低至49%、18%、60%和45%。在转染IL10RB siRNA后，IL-10诱导的SOCS3表达降低，证实了转染成功实现了IL10RB的下调。
<img alt="流式细胞术数据；通过Alexa Fluor分析细胞凋亡和坏死；相差显微镜对比。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 转染后THP-1巨噬细胞的表征。 通过光学显微镜和流式细胞术分析显示，按照本方案转染的THP-1巨噬细胞与未转染的对照细胞相比，其典型特征状态未受影响。THP-1巨噬细胞经10 ng/ml PMA诱导分化48小时后，使用荧光标记（Alexa 488）的非特异性对照siRNA进行转染。转染24小时后，拍摄活细胞图像（B），或用Accutase I处理使细胞脱落，并进行流式细胞术分析（A）。细胞凋亡和坏死染色使用Annexin V-藻红蛋白（PE）（C）和7-氨基放线菌素（7-AAD）（D）进行。转染效率（E）通过siRNA所带荧光标记的流式细胞术检测确定。图中显示转染细胞的荧光信号（黑色）与对照信号（灰色）的对比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank"> 请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电穿孔与脂质体转染数据；流式细胞术，荧光显微镜；Alexa Fluor 488 分析。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 电穿孔与脂质体转染后 siRNA 细胞内分布的比较。 THP-1 细胞根据本方案分化 48 小时，随后通过电穿孔或脂质体转染进行转染。所示的脂质体转染结果采用 Xtremegene siRNA 试剂盒，按照生产商推荐方案进行，转染试剂与 siRNA 的电荷比为 4:1。转染后 24 小时，细胞使用 Accutase I 脱落用于流式细胞术分析，或直接对活细胞进行显微观察。（A）通过与 siRNA 连接的荧光标记进行流式细胞术分析，测定转染效率及细胞群体中每个细胞的 siRNA 分布情况；未转染 siRNA 的对照组以灰色显示，转染 siRNA 的样本以黑色显示。（B）荧光显微镜图像，显示荧光标记的 siRNA（Alexa Fluor 488）在细胞内的分布；比例尺为 40 µm。（C）与荧光图像对应的微分干涉差显微镜图像；比例尺为 40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank"> 请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IL10RB表达比较；柱状图；小鼠T细胞；核转染培养基；基因表达分析" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 转染的THP-1巨噬细胞中通过siRNA介导的IL10RB基因敲低。 根据所述方案对THP-1巨噬细胞进行转染。转染后，细胞分别培养于四种不同的培养基中，即小鼠T细胞核转染培养基（A）、IMDM（B）、LGM3（C）和X-VIVO 20（D），补充成分如方案部分所述。细胞分别转染非特异性对照siRNA（Ctrl）或IL10RB特异性siRNA（IL10RB）。作为额外对照，设置了以下样本：电穿孔对照（i.e. 转染过程中未添加siRNA的细胞，标记为Pulse），以及培养基对照（i.e. 仅更换培养基但未进行其他处理的细胞）。转染24小时后，细胞在无血清培养基中继续培养24小时，培养基中添加或不添加50 ng/ml IL10。通过RT-qPCR检测IL10RB的表达水平；图中数据为三次独立实验的均值，误差线表示标准误；* p &lt;0.05；** p &lt;0.01；*** p &lt;0.001，与Ctrl组相比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank"> 请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠T细胞中SOCS3/RPL37A的表达水平；不同培养基的柱状图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 在转染的THP-1巨噬细胞中IL10RB敲低后IL10依赖性调控SOCS3的表达。 根据所述方案对THP-1巨噬细胞进行转染。转染后，细胞分别在四种不同的培养基中培养：小鼠T细胞Nucleofector培养基（A）、IMDM（B）、LGM3（C）和X-VIVO 20（D），补充成分如方案部分所述。细胞分别转染非特异性对照siRNA（Ctrl）或IL10RB特异性siRNA（IL10RB）。作为额外对照，还包括以下样本：电穿孔对照（i.e. 在无siRNA条件下进行转染的细胞，标记为Pulse），以及培养基对照（i.e. 仅更换培养基但其他方面未作处理的细胞）。转染24小时后，细胞在无血清培养基中继续培养24小时，培养基中添加或不添加50 ng/ml IL10。通过RT-qPCR检测SOCS3的表达水平；图中数据为三次独立实验的均值，误差线表示标准误；*, # p &lt;0.05；**, ## p &lt;0.01；***, ### p &lt;0.001，分别相对于Ctrl组和Ctrl + IL-10组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank"> 请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种高效且可靠的方法，通过电穿孔技术将siRNA或质粒DNA转染至人THP-1巨噬细胞，可在实现高转染效率的同时，保持细胞的高活力以及巨噬细胞完整的分化与极化能力。

高效转染人THP-1巨噬细胞的核转染方法

巨噬细胞作为先天免疫反应的关键参与者，是组织稳态或多种病理学研究的关注焦点。

本实验的总体目标是实现对人源 THP-1 巨噬细胞的稳定转染，同时保持高细胞存活率且不引起细胞活化。该目标首先通过将 THP-1 单核细胞预诱导分化 48 小时来实现。实验的第二步是收集未成熟的 THP-1 巨噬细胞。第三步是使用龙沙公司的核转染技术，将细胞转染小干扰RNA或质粒DNA。最后的步骤是重新接种细胞并进一步诱导其分化。最终，可通过定量实时PCR、Western blot等方法验证基因敲低或过表达是否成功。与脂质体转染等其他转染方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够同时实现高转染效率和高细胞存活率，并且不会改变巨噬细胞的功能和行为。然而，该技术不适用于高通量应用，因为在本实验方案中，每次只能进行一次转染操作。在转染前24小时，将THP-1细胞培养于含10% FCS以及1%青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，随后对细胞进行传代并更换新鲜培养基。第二天。将1000万至1500万个细胞接种于一个75平方厘米的组织培养瓶中，进行细胞预分化。在补充型RPMI培养基中加入以下成分：1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、10纳克/毫升PMA和50微摩尔β-巯基乙醇。48小时后，吸去培养基，加入6毫升已预热至37摄氏度的阿曲波胺（Accutane），以使细胞脱落。孵育30分钟。准备足够的转染培养基和常规培养基，用于细胞核转染后的培养。30分钟后，检查细胞是否已脱落并呈圆形。如果仍有部分细胞附着，可使用微量移液器轻轻吹打培养瓶或进行轻柔振荡以使细胞脱落。切勿使用细胞刮。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟，用抽吸法去除上清液，并重新悬浮细胞沉淀。在 1 毫升预热至 37 摄氏度的 RPMI 培养基中，计数细胞，并立即分装成含有 200 万至 250 万个细胞的微量离心管 aliquot，用于瞬时转染。本实验方案的快速执行至关重要。为避免细胞活力下降，务必提前准备好所有材料。首先，在室温下以 250 × g 离心所有转染 aliquot 10 分钟；在离心过程中，将每管核酸转染试剂加入 0.5 微克质粒 DNA 或 1 微克 siRNA。使用高浓度稀释液，使其占据最小的试剂体积。现在仅从一份细胞等分试样中吸走上清液。将细胞重悬于100 µL核转染溶液中。切勿让细胞在溶液中暴露超过15分钟。将细胞转移至Q vet中，并通过轻柔敲击混匀。然后使用型号为Two B Nucleo Factor的仪器，选择程序Y 0 0 1对细胞进行转染。用一次性移液管将电穿孔后的细胞转移至反应管中，并立即向细胞中加入0.5 mL预热的转染培养基。现在依次对每一份细胞样品重复此过程，直到所有样品均完成转染。核转染完成后，将每份转染后的细胞转移至六孔板中的一个孔，每孔加入2.5毫升预热的转染培养基。使用微量移液器充分混匀每个孔中的液体。在将所有接种好的培养板孵育四小时后，在显微镜下检查细胞状态。四小时后，大多数细胞应已贴附于培养板上（如有需要，最多如此）。再孵育一小时将提供足够的 sahe，一次操作一个孔。吸去贴壁细胞中的转染培养基，并加入等体积的温热培养基。此步骤中需小心，避免细胞脱落。现在，根据需要孵育细胞。必要时，每 48 小时更换一次培养基，并规划处理时间，使处理在转染的 DNA 或 RNA 达到最大效应时结束。用效应物处理细胞时，使用不含 PMA 和β-巯基乙醇的无血清培养基。注意不要让细胞在无血清条件下孵育超过24小时。本实验采用该方案对THP-1巨噬细胞进行RNA转染，并根据流式细胞术测量结果评估细胞形态学变化。在转染组和对照组培养物中，细胞的凋亡和坏死率均较低。然而，仔细计数后发现，转染样本中的凋亡和坏死程度略高。这可能是因为转染的THP-1巨噬细胞比未转染（UNT）细胞更难从培养板上脱离所致。总体而言，通过流式细胞术分析，转染效率超过90%。通过荧光显微镜观察荧光标记的S-I-R-N-A，也证实了转染效率。通过IL10RB表达的基因敲低实验验证了转染的功能性。使用短干扰RNA，一旦掌握该技术，若操作得当，转染可在一至一个半小时内完成。在进行该操作时，需注意培养基对实验效果具有显著影响，这一点在文本方案中有详细说明。

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