实验和生物信息学议定书光周期滞育的亚洲虎蚊的RNA序列分析，白纹伊蚊
November 30th, 2014
RNA-Seq 分析对于鉴定非模式生物中适应性状的分子基础变得越来越重要。在这里，描述了一种鉴定滞育和非滞育白纹伊蚊之间差异表达基因的方案，从蚊子饲养到 RNA-Seq 数据的 RNA 测序和生物信息学分析。
以下实验的总体目标是确定光周期性滞育反应的转录成分。在非模型蚊子 80 年代的肘部象中，这是通过首先通过不同的光周期处理产生滞育和非滞育卵的生物复制样本来实现的。第二步，从每个重复中提取 RNA，用于高通量 RNA 测序。
然后对 RNA 序列进行计算处理，将它们组装成 congs 并对其进行注释。最终，响应滞育诱导与非滞育诱导光周期的基因表达变异可以从 Reeds MAP 推断到 RNA 组装。与现有方法（例如微射线分析）相比，该技术的主要优点是不需要先前的遗传资源（例如基因组序列或微阵列）来获得响应滞育条件的基因表达的全局估计。
该方法可以帮助回答生态基因组学领域的关键问题，例如 DPO 的转录基础是什么或非模式生物中的其他关键生态适应。通常，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为很难获得足够数量的滞育和非 DPO 卵，并且下游生物信息学分析可能具有挑战性。当我们注意到高通量 DNA 测序技术变得越来越便宜，并在开始程序之前提供了在非模式生物中获得全基因组表达谱的简便方法时，我们首先想到了这种方法。
设置两个光周期柜，在 21 摄氏度下可编程照明，以实现最佳滞育表达和大约 80% 的相对湿度 将一个柜子编程为非滞育诱导光周期，具有 16 个 8 光暗周期，另一个用于滞育诱导 8 个 16 光暗周期，同时开灯，使两个柜子同步光周期之间的昼夜节律。接下来，将适量鸡蛋的蛋纸浸入 500 毫升去离子水中，并加入 1 毫升磨碎的狗粮和盐水虾粮浆。用网眼盖住容器，在网眼周围放置一根橡皮筋以将其固定到位。
然后将鸡蛋在 16 个浅色深色长日照相期柜中孵化约 24 小时。第二天，将每组约 30 只孵化的幼虫转移到装有 90 毫升去离子水的 10 x 10 x 2 厘米培养皿中。每 48 到 72 小时，将幼虫转移到干净的培养皿中，每次转移时用新鲜的饲料浆喂养它们。
大约六天后，在每次光期处理时，用湿滤纸在三到四个成年笼的底部铺上一层，并用足够的去离子水润湿滤纸，以增加笼子内的局部湿度，同时避免积水。记下照片周期、复制编号笼开始日期以及与实验相关的其他信息，并在笼子的侧面使用永久性标记。然后每隔一天，持续 10 天，将 puy 转移到小杯清水中，每 25 毫升水不超过 50 puy 放入适当的成虫笼中进行实验，并将有机葡萄干放在笼子的顶部网眼上，为出现的成虫提供糖 为了刺激卵子位置 第一次吸血后 4 到 5 天， 将深色 50 毫升杯子装满，内衬有纹理的未漂白纸巾，一半蘸去离子水，然后将一个杯子放入每个笼子中以收集和储存鸡蛋。
用新纸替换每个笼子中的蛋纸，将最近取出的纸放入培养皿中，并将它们存放在八个 16 浅色深色短日照相期柜中，以避免对鸡蛋储存产生混淆影响。采集后约 48 小时，将蛋纸在露天晾干，使其柔软且摸起来略微潮湿，但不要太湿以至于蛋纸因水而变黑或刺激孵化。要测量滞育事件，请记录每张蛋纸上的鸡蛋数量。
然后将单个纸张完全浸入装有约 80 毫升去离子水的 90 毫升培养皿中。为了刺激它们孵化，加入大约 0.25 毫升的食品浆液，然后在 24 小时后，将培养皿转移到黑色表面上。现在在一侧放置一个光源，幼虫将远离光线，从而可以清楚地统计星形幼虫中首先出现的个体。
计数后使用移液器取出每只幼虫，以防止重新计数个体。然后将蛋纸放入新的培养皿中红干。一周后，在对第二批孵化的幼蛋进行计数后，将蛋纸和剩余的未孵化蛋放入新的 90 毫升培养皿中，加入大约 80 毫升新鲜漂白溶液，注意将试纸完全浸没在漂白溶液中。
将文件放在通风橱下过夜，然后第二天用光学显微镜统计未孵化的鸡蛋数量。如果鸡蛋是胚胎化的，它会呈现出灰白色，眼睛在背侧表现为两个相对的小黑点。首先，用 RNA 去污溶液仔细清洁工作台，以去除任何残留的核酸酶并避免 RNA 降解。
接下来，使用骆驼毛刷刷至少 400 个含有发育中胚胎的蚊卵。玻璃研磨机的兴趣点。在通风橱中，加入 1 毫升三醇，将鸡蛋研磨至完全粉碎，然后在三醇中进行 RNA 提取，然后根据制造商的说明进行异丙醇沉淀。
现在，根据制造商的说明，在 50 μL 反应中，每 10 μg RNA 使用最多 1 μL 的 D ns，在 37 摄氏度下持续 30 分钟。接下来，在室温下将反应物放入 5 μL 悬浮 DNA 灭活试剂中孵育 5 分钟。在孵育期间轻轻涡旋悬浮液 3 次。
然后将 RNA 提取物以 10， 000 倍 G 和 Eloqua（含有上清液的 RNA）离心 1.5 分钟，放入新试管中进行测序。最后，有关如何处理所得的下一代测序数据（从读取、制备、组装和注释到差异表达分析）的详细信息，请参阅随附的文本。在第一张图中，两个代表性 RNA 样品的荧光测定显示两个条带约为 2000 个核苷酸。
昆虫 28 s 核糖体 RNA 由两条多核苷酸链组成，这些链由氢键连接在一起，这些氢键很容易被短暂加热或破坏氢键的试剂破坏。所得两种组分的大小与第二个 RNA 样品中的 18 s 核糖体 RNA 大致相同，在该代表性实验中可以观察到高水平的降解。对白纹蚊子的代表性群体进行光周期性处理，导致短日照蚊子的高滞育事件和长日照饲蚊子的低滞育事件。
例如，尽管重复之间存在一些差异，但短第二天组表现出比其他重复更低的滞育事件。数字归一化读数的 Trinity 组装产生 76， 377 个重叠群，平均 conig 长度为 1020 3.1，最大 Conti 长度为 20， 892。请注意，Conti 长度的分布严重偏向于较短的重叠群。
这是典型的 Denovo 转录组组装。在最后一张图中，在卵子位置后 11 天和 21 天在滞育诱导条件下饲养的胚胎的类似工作流程的差异表达分析揭示了这两个时间段之间的 3， 128 个差异表达基因。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在组织生成神圣信息学分析后的六到八个月内完成。
在尝试此过程时，请务必记住，在进入下一步之前，应验证每个步骤的成功。例如，在按照此程序测试 RNA 完整性之前，确认实验条件已经产生了 DPA 和非滞育卵。可以执行其他方法，例如定量 R-T-P-C-R 或比较基因组学分析，以回答有关目标基因的组织或发育特异性表达和/或分子进化过程的其他问题。
不要忘记，使用三醇可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用手套、实验室外套和通风橱。
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概述
本研究提出了一种鉴定白纹伊蚊在停滞和非停滞状态下差异表达基因的协议。该方法包括在不同光周期下养殖蚊子，然后进行RNA提取和高通量测序以分析基因表达变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 生态学
背景
- 停滞是许多生物的关键适应性特征。
- 白纹伊蚊是一种具有重大生态影响的非模式生物。
- RNA-Seq是在没有先前遗传资源的情况下研究基因表达的强大工具。
- 理解基因表达对环境线索的反应可以为生态和进化研究提供信息。
研究目的
- 识别光周期停滞反应的转录组成分。
- 比较停滞和非停滞状态之间的基因表达。
- 增进对非模式生物适应性特征的理解。
使用的方法
- 生物学复制的停滞和非停滞卵样本被制备。
- 从每个重复样本中提取RNA用于测序。
- 进行了高通量RNA测序。
- 使用计算处理来组装和注释RNA序列。
主要结果
- 在不同光周期下发现了基因表达的变化。
- 研究证明了RNA-Seq在非模式生物中的有效性。
- 获得了关于停滞背后的分子机制的见解。
- 结果可能为其他物种适应性特征的未来研究提供信息。
结论
- RNA-Seq是研究非模式生物基因表达的有价值方法。
- 研究结果有助于理解与环境变化相关的适应性特征。
- 这种方法可以应用于面临类似生态挑战的其他物种。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables target validation in non-model organisms by linking environmental cues to transcriptional responses, supporting mechanistic de-risking in early discovery. It provides a scalable approach for phenotypic screening of adaptive traits without requiring prior genomic resources, reducing dependency on model systems. The workflow supports predictive confidence in target identification by isolating photoperiod as an independent variable and measuring gene expression as a quantitative dependent variable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to environmental stimuli for target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying genes differentially expressed in diapause versus non-diapause states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking photoperiodic treatment to measurable transcriptional outputs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems (diapause and non-diapause eggs) for downstream compound screening.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducible high-throughput sequencing.
- Scalability: Enables platform reuse across mosquito species and life history traits with modest protocol adjustments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene expression findings to phenotypic outcomes like developmental arrest and metabolic suppression.
- Mechanistic De-risking: Identifies transcriptional networks underlying diapause, informing biomarker selection for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for differential expression (e.g., 3,128 DEGs across timepoints).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly for targets involved in environmental sensing and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating photoperiod as an independent variable and measuring transcriptional changes as dependent variables.
- Screening: Enables assay readiness through standardized rearing, diapause induction, and RNA quality control steps.
- Analytics: Generates quantitative gene expression measurements (e.g., contig assembly, differential expression) that allow cross-condition comparison.
- Translational Research: Links transcriptional changes to phenotypic diapause outcomes, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other mosquitoes and ecological traits, promoting platform-level investment over single-use assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in environmental response pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through biologically replicated samples and standardized RNA extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening in non-model organisms without prior genome investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing transcriptional evidence for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, photoperiod control, and RNA handling under RNase-free conditions.
- Depends on access to Illumina sequencers and computational infrastructure for de novo transcriptome assembly and annotation.
- Necessitates cross-team standardization between entomology, molecular biology, and bioinformatics groups.
- Requires adaptation of diapause induction conditions (e.g., light:dark cycles, temperature) for different species or strains.
- Practical limitations include the time-intensive nature of diapause induction (6–8 months) and challenges in obtaining sufficient diapause egg yields.
