一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

以下实验的总体目标是鉴定光周期滞育反应的转录组分。在一种非模式蚊虫八十年代肘突库蚊（Aedes atropalpus）中，首先通过不同的光周期处理，制备出生物学重复的滞育与非滞育卵样本；随后，从每个重复样本中提取RNA，用于高通量RNA测序。

随后通过计算方法对RNA序列进行处理，将其拼接成contig并进行注释。最终可通过RNA序列比对到转录组的结果推断出在诱导滞育与非诱导滞育光周期条件下基因表达的差异。该技术相较于现有方法（如微阵列分析）的主要优势在于，无需依赖先有的遗传资源（如基因组序列或微阵列），即可获得在滞育条件下基因表达的全局性估计。

该方法有助于回答生态基因组学领域的一些关键问题，例如非模式生物中滞育期（DPOs）或其他重要生态适应性的转录基础是什么。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为获取足量的滞育与非滞育期卵较为困难，且后续的生物信息学分析具有挑战性。在开始实验之前，我们首次提出该方法的设想，是由于注意到高通量DNA测序技术正变得越来越经济，并为获取非模式生物的全基因组表达谱提供了一种切实可行的方法。

设置两个带有可编程照明的光周期培养箱，温度为21摄氏度，以实现最佳的滞育表达，并保持约80%的相对湿度。将其中一个培养箱设定为非滞育诱导光周期，光照周期为16小时光照/8小时黑暗；另一个设定为滞育诱导光周期，光照周期为8小时光照/16小时黑暗。两个培养箱的光照开启时间应保持一致，以同步光周期之间的昼夜节律。接下来，将适量卵的卵纸浸入500毫升去离子水中，并加入1毫升研磨的狗粮和卤虫饲料混合液。用纱布覆盖容器，并用橡皮筋固定纱布，以保持其位置。

然后将卵置于16小时光照、8小时黑暗的长日照光周期培养柜中孵育约24小时。次日，将每组约30只孵化的幼虫转移至分别盛有90毫升去离子水的10厘米×10厘米×2厘米的培养皿中。每隔48至72小时，将幼虫转移至新的洁净培养皿，并在每次转移时喂食新鲜的食物悬液。

大约六天后，为每种光周期处理的三到四个成虫饲养笼底部铺上湿润的滤纸，并用去离子水润湿滤纸，加水量以能提高笼内局部湿度但不产生积水为宜。用永久性记号笔在饲养笼侧面注明光周期条件、重复编号、笼起始日期及其他与实验相关的必要信息。随后在10天内每隔一天将蛹转移至小杯洁净水中，每25毫升水中的蛹数不超过50只，并将这些小杯放入对应实验组的成虫饲养笼中。同时，在饲养笼顶部的网盖上放置有机葡萄干，为羽化的成虫提供糖分。为了促进雌虫产卵，在首次吸血后四到五天，取深色的50毫升离心管，内衬一张有纹理的未漂白纸巾，加入去离子水至半满，每个饲养笼中放入一个这样的杯子，用于收集和保存卵。

更换每个笼子中的卵纸，并将刚取出的卵纸放入培养皿中，储存在八个16小时光照、8小时黑暗的短日照光周期柜中，以避免对卵的储存产生干扰影响。收集卵纸约48小时后，在空气中将卵纸自然晾干，使其变得柔软且触感微湿，但不可过湿，以免纸张因水分过多而变深或诱发孵化。为测定滞育发生率，记录每张卵纸上的卵数。

然后将单个滤纸完全浸入含有约 80 毫升去离子水的 90 毫升培养皿中。为促进其孵化，加入约 0.25 毫升的食物悬液，24 小时后，将培养皿置于黑色表面上。接着在培养皿一侧放置光源，幼虫会远离光线，从而可清晰地计数各个初孵幼虫。

计数后使用移液器将每条幼虫移除，以防止重复计数。然后将卵纸放入新的培养皿中重新晾干。一周后对第二批孵化的幼虫进行计数后，将带有剩余未孵化卵的卵纸放入新的90毫升培养皿中，加入约80毫升新鲜漂白液，注意确保卵纸完全浸没于漂白液中。

将载玻片置于通风橱中过夜，次日使用光学显微镜统计未孵化虫卵的数量。若虫卵已形成胚胎，其颜色呈乳白色，背侧可见两个相对的小黑点，即为发育中的眼点。实验开始前，需用RNA去污染溶液仔细清洁实验台面，以清除残留的核酸酶，防止RNA降解。

接下来，使用骆驼毛刷将至少400枚含有发育中胚胎的蚊卵在相应发育时期转移至玻璃研磨器中。在通风橱内，加入1毫升Trizol，研磨卵直至完全粉碎，然后按照试剂盒说明书进行Trizol法RNA提取，并用异丙醇沉淀RNA。

根据制造商说明书，在 50 微升反应体系中，使用最多 1 微升的 D ns 处理最多 10 微克的 RNA，在 37 摄氏度下反应 30 分钟。接下来，将反应物加入 5 微升悬浮的 DNA 失活试剂中，在室温下孵育 5 分钟。孵育期间，轻轻涡旋振荡悬浮液三次。

然后将RNA提取物在10,000 × g条件下离心1.5分钟，将含有RNA的上清液转移至新的离心管中用于测序。最后，请参阅配套文本，了解如何对获得的下一代测序数据进行处理，包括测序读长、文库制备、序列拼接、注释以及差异表达分析。在第一张图中，两个代表性RNA样本的荧光定量结果显示在约2000个核苷酸处出现两条条带。

昆虫的28S核糖体RNA由两条通过氢键结合的多核苷酸链组成，这些氢键容易被短暂加热或破坏氢键的试剂所打断。由此产生的两个组分大小与18S核糖体RNA相近，在第二个RNA样本中可观察到明显的降解现象。对一组合代表性白纹伊蚊（albopictus mosquitoes）进行光周期处理后，结果显示：在短日照条件下饲养的蚊虫滞育率较高，而在长日照条件下饲养的蚊虫滞育率较低。

尽管重复实验之间存在一些差异，例如短日照处理的第二天组表现出的滞育率低于其他重复组。对数字化标准化的测序读段进行 Trinity 组装，共获得 76,377 条 contig，平均 contig 长度为 1020.3 bp，最长 contig 长度为 20,892 bp。需要注意的是，contig 长度的分布明显偏向较短的 contig。

这在从头转录组组装中较为典型。在最终的图表中，对在滞育诱导条件下培养的胚胎（卵产后11天和21天）进行差异表达分析，结果显示这两个时间点之间共有3,128个差异表达基因。一旦掌握该技术，若操作得当，从组织获取到生物信息学分析完成，整个流程可在六至八个月内完成。

在进行该实验操作时，必须牢记：在进入下一步之前，应逐一确认每个步骤是否成功完成。例如，在按照本方案检测 RNA 完整性之前，需先确认实验条件已成功产生滞育型胚胎（DPA）和非滞育型卵。此外，还可采用其他方法，如定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）或比较基因组学分析，以进一步探究目的基因在特定组织或发育阶段的表达特征，以及分子进化过程中的相关问题。

请注意，操作三元醇可能具有极高危险性，进行本实验操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套、实验服，并在通风橱中进行。