Name: 实验和生物信息学议定书光周期滞育的亚洲虎蚊的RNA序列分析，白纹伊蚊 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 了解白纹伊蚊光周期滞育的转录组分析方法。本研究利用RNA测序技术识别滞育与非滞育状态下的差异表达基因，为理解非模式生物的生态适应机制提供重要分子基础。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目5R21AI081041-02和乔治城大学支持。

1. 两种幼虫的培育 A. albopictus 从幼年到成年
<ol>
	<li>将两个光周期培养箱的可编程光照设置为 21 °C，以实现最佳的滞育表达16 相对湿度约为80%。
	<ol>
		<li>将一个培养柜设定为16小时光照：8小时黑暗的光周期（非诱导滞育的光周期）；将第二个培养柜设定为8小时光照：16小时黑暗的光周期（诱导滞育的光周期）13.</li>
		<li>在同一时间启动两个培养柜的“开灯”程序，以同步不同光周期之间的昼夜节律时间。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算实验所需的卵量，每个笼子准备300-500个卵。为进行RNA制备，至少需要三个重复的滞育组笼子和三个重复的非滞育组笼子。总计需 约 每次实验产卵 1,800–3,000 枚。
	<ol>
		<li>将卵纸浸入水中以孵化卵 约 500 ml 去离子 H2O.</li>
		<li>添加 约 1 ml 食物浆液，由磨碎的狗粮和卤虫组成，制备方法同前文所述24用网罩盖住容器，并用橡皮筋固定网罩。</li>
		<li>放入LD光周期培养柜中 约 24 小时</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将孵化的幼虫转移至盛有10 x 10 x 2 cm的培养皿中 约 90 ml 去离子 H2O.
	<ol>
		<li>维持 约 每皿30只幼虫。每48–72小时将幼虫转移至洁净的培养皿，例如每周一、周三、周五（M-W-F）进行转移。24.</li>
		<li>喂养 约 每周一、三、五按先前所述方法给予1 ml由狗粮粉和卤虫溶于去离子水制成的食物悬液24.&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每种光周期处理设置三到四个成虫饲养笼，每个饲养笼构成一个生物学重复。
	<ol>
		<li>从9.5 L桶的相对两侧，分别切出一个10 cm × 14 cm的开口和一个直径15 cm的圆孔。将前者用网眼布覆盖。截取约一英尺长的矫形袜套，将一端粘合固定在另一孔的内侧周围。</li>
		<li>将丝袜的脚部末端剪下并打结封口——仅在需要进入笼子内部时打开。对于笼盖，将内部全部剪除，仅保留边缘部分，并用网眼材料替换原有的塑料内层24.</li>
		<li>用永久性记号笔在笼子侧面注明光周期、重复数、笼内起始日期以及实验相关的其他信息。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在成虫饲养笼底部铺上湿润的滤纸。用足量的去离子水润湿滤纸。2O 以增加笼内局部湿度，但应避免积水，以免刺激蚊虫在滤纸上产卵24每天检查滤纸是否干燥，必要时重新润湿。</li>
	<li>为获得构建RNA文库所需的足够卵量，每个9.5 L的笼子中至少应放入100只雌蚊，且每笼蚊虫数量不得超过500只。</li>
	<li>收集蛹（周一、三、五），放入盛有洁净 H 的小杯中2每25 ml H中蛹的密度不超过50只2O. 将蛹杯转移至成虫饲养笼中，将饲养笼置于相应的光周期培养柜中—— A. albopictus 蛹具有光敏感性15.</li>
	<li>确保每天 H2杯中的水应保持清洁透明，并清除死亡的蛹，因为死亡蛹体的积聚可能导致大规模死亡。移除 H2所有蛹羽化后取出杯子。</li>
	<li>将有机葡萄干放置在笼子的上层网筛上，以为羽化的成虫提供糖分。定期检查葡萄干，并每3-5天更换一次，以防止霉菌积聚。</li>
</ol>
2. 成虫的饲养以促进交配与产卵
<ol>
	<li>按照上述方法（第1.5和1.9节），通过在笼底铺上湿润的滤纸以维持高湿度（约80%），并提供无霉变的葡萄干供取食。</li>
</ol>
3. 血液喂养
<ol>
	<li>在羽化后2至6天内准备对雌蚊进行血液饲喂，以确保在产卵开始前，雌蚊已暴露于至少8个明确的短日照条件下，从而获得近100%的滞育卵14。</li>
	<li>准备Hemotek膜饲系统。将饲喂单元插入电源。使用调节螺丝将每个单元的温度调节至37 °C。在校准过程中，使用电子温度计和探头测量饲喂单元的温度。</li>
	<li>准备饲血储液器。将一块胶原蛋白饲喂膜拉伸覆盖在储液器的开口上，并用O型圈固定。小心拉紧四角以去除褶皱，然后用剪刀修剪多余的膜。 
	注：胶原膜可能不适用于所有蚊种，若研究对象非白纹伊蚊（A. albopictus），可能需要尝试多种膜类型以确定最佳选择。对于致倦库蚊（Culex pipiens），Parafilm膜效果良好。
	<ol>
		<li>若血液为冷冻保存，使用前需在室温下解冻至少1小时。</li>
		<li>手持储液器，使膜面朝下且无支撑，加样口朝上。使用移液管或注射器向储液器中加入约3 ml含柠檬酸钠作为抗凝剂的鸡全血。用塑料塞密封加样口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将储液器旋紧在饲喂器底部传热板上的螺柱上，将其固定到饲喂器上。将饲喂器翻转，放置在笼子顶部，膜面朝下，使蚊虫可通过笼网进行吸血。将饲喂器保留在笼子上约45分钟，以最大程度促进吸血。</li>
</ol>
4. 诱导产卵
<ol>
	<li>末次吸血后第4至5天，为每个笼子配备一个深色50 ml杯子，杯内衬以未漂白的种子发芽纸（产卵纸）或有纹理的未漂白纸巾，并加入去离子水至半满9。若笼内蚊虫数量超过250只，则使用两个杯子。 
	注意：对于小型笼子或单只雌蚊使用的玻璃小瓶，产卵容器中加入“干草浸液”可能因微生物菌群的气味而提高产卵率25。</li>
</ol>
5. 收集与保存卵子
<ol>
	<li>在吸血后4-5天内开始收集卵，因为产卵量通常在吸血后约5天达到高峰，随后在接下来的一周内逐渐下降。</li>
	<li>根据实验需求调整卵收集频率。常规情况下，按照周一、周三、周五的周期收集卵纸。从每个笼子中取出卵纸，并更换新的卵纸。将刚取出的卵纸放入培养皿中，置于SD光周期培养柜中储存，以避免卵储存条件对实验结果产生干扰。</li>
	<li>让卵纸在产卵后保持湿润2天，以促进浆膜角质层的形成，从而增强卵的抗干燥能力26.</li>
	<li>收集后约48小时，在空气中干燥卵。将纸干燥至柔软且触感微湿，但不可过湿，以免纸张因水分过多而变深色2O 或刺激卵的孵化。 
	注意：一张6.5英寸×4英寸的纸张大约需要3.5小时才能干燥。干燥蛋纸时需谨慎，避免过度干燥，否则会导致卵脱水。27.</li>
	<li>从长日照和短日照光周期条件下保留额外的卵，用于评估滞育发生率并解析光周期效应（参见第6节“滞育测定”）。</li>
	<li>长期储存时，将卵纸置于培养皿中，于21 °C、相对湿度约80%的条件下保存。将培养皿放入密封储物盒（如Tupperware容器）中，并在盒内放置装有水的烧瓶以维持局部湿度，因为在21 °C条件下胚胎发育需要4至5天。</li>
</ol>
6. 测定滞育发生率
<ol>
	<li>使用额外保留的胚胎（参见第4节“刺激排卵”），其年龄为7–20天，用于量化滞育反应。</li>
	<li>记录每张产卵纸上存在的卵的数量。</li>
	<li>通过将单张产卵纸完全浸入含有约80 ml去离子H2O的90 ml培养皿中，以刺激卵孵化。加入约0.25 ml食物浆液。</li>
	<li>24小时后，统计孵化的一龄幼虫数量。将培养皿置于黑色背景上以清晰观察幼虫，并在培养皿一侧放置光源。幼虫会向远离光源的方向移动，从而便于准确计数个体幼虫。计数时使用移液器移除已计数的幼虫，防止重复计数。</li>
	<li>将产卵纸转移至新的培养皿中并重新干燥。约1周后再次按上述方法重新孵化卵，并统计孵化数量。</li>
	<li>将剩余未孵化卵的产卵纸放入新的90 ml培养皿中，加入约80 ml漂白液28。确保产卵纸完全浸没于漂白液中，并在通风橱中过夜放置，以避免氯气味扩散。 
	注意：漂白液可在4 °C下保存约1周，否则应现配现用。</li>
	<li>使用光学显微镜检查卵，因漂白处理可清除卵壳，便于观察已胚胎化但未孵化的卵。若卵已胚胎化，则呈乳白色，背侧可见两个相对的小黑点，即为眼点。统计未孵化但已胚胎化的卵数量13。</li>
	<li>按以下公式计算滞育发生率：% 滞育 =（未孵化但已胚胎化的卵数）/（已孵化卵数 + 未孵化但已胚胎化的卵数）× 100 13。</li>
</ol>
7. 从卵/围蛹幼虫中提取RNA

注意：在层流罩中使用 Trizol。

<ol>
	<li>使用骆驼毛刷将处于不同发育时间点的、含有发育中胚胎或围蛹期幼虫的蚊卵从产卵纸上刷至玻璃研磨器中。在Trizol中研磨（每50–100 mg组织使用1 ml&#160;&#160;Trizol），直至完全粉碎。每个文库至少使用400个卵，以获得足够的RNA。
	<ol>
		<li>或者，将卵在液氮中快速冷冻，并在-80 °C下保存于微量离心管中，最长可保存一个月，之后再在Trizol中进行研磨。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书，使用Trizol进行RNA提取，并通过异丙醇沉淀法沉淀RNA。</li>
	<li>使用RNase去污染溶液或其他试剂处理实验台面，以去除任何残留的核酸酶，防止RNA降解。
	<ol>
		<li>用DNase处理提取的RNA。根据制造商说明书，将RNA样品与DNase在37 °C孵育30分钟。每50 µl反应体系中，最多使用1 µl DNase处理10 µg RNA。若单次反应中RNA量超过10 µg，应增加DNase用量。</li>
		<li>加入5 µl悬浮的DNase失活试剂以终止DNase活性。室温孵育5分钟，在孵育期间轻轻涡旋混合三次。</li>
		<li>以10,000 × g离心1.5分钟。将含有处理后RNA样品的上清液转移至新的离心管中，用于后续步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光定量法评估总RNA样品的质量。将样品送至具备相应仪器的专业机构进行检测。该机构将通过芯片凝胶电泳分析样品中RNA组分的大小，并利用芯片内含的荧光染料进行可视化检测。结果将以电泳图谱形式返回。
	<ol>
		<li>通过观察电泳图谱中18S与5S核糖体RNA峰之间是否存在降解产物所形成的峰，判断总RNA样品的完整性（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA 测序
<ol>
	<li>将质量足够高（图1A）且数量充足（通常每文库 &#62;3 μg）的总RNA样品送至商业测序中心，按照标准流程构建富集的双端mRNA文库并进行mRNA测序。</li>
	<li>若单个实验使用多个测序通道，应将单个文库分配至两个通道进行测序，以校正测序过程中不同通道间的技术差异。</li>
</ol>
9. Illumina 测序读段清洗
注意： 图2 总结了本实验方案的生物信息学部分。有关本方案生物信息学部分所使用全部程序和资源的完整列表，请参见表1。此外，补充文件1包含了以下每个生物信息学实验步骤的命令行示例。
<ol>
	<li>使用 ssaha229（表 1）比对 NCBI UniVec Core 数据库（表 1）、A. albopictus rRNA 序列（GenBank #L22060.1）以及测序接头序列，筛选出相似度 ≥95% 的匹配项（具体命令行示例见补充文件 1）。利用 Perl 或其他类似脚本工具（例如修改所提供的 Perl 脚本，见补充文件 2）去除存在匹配的成对读段。</li>
	<li>使用 SolexaQA 软件包30（表 1；补充文件 1）对剩余读段进行清洗：采用 DynamicTrim.pl 的默认参数，切除 Phred 质量分数低于 20 的区域。
	<ol>
		<li>同时对正向和反向读段使用 LengthSort.pl 去除长度短于 25 bp 的读段。使用 FastQC（表 1）评估清洗后 fastq 文件的质量——特别是确认每个碱基的序列质量及每条序列的质量评分均高于 20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 数字化归一化
<ol>
	<li>使用 khmer 工具31（表 1；补充文件 1）对清洗后的测序读段执行一轮数字标准化，具体使用 normalize-by-median.py（k-mer 长度设为 20，覆盖度阈值设为 20，x = 1e10）。</li>
	<li>或者，如果拥有高内存的计算机（数百 GB），可使用 Trinity 的 normalize_by_kmer_coverage.pl 脚本（表 1）。</li>
</ol>
11. 从头合成 转录组组装
<ol>
	<li>根据组装规模，获取具有最多 256 Gb 内存和 24 个中央处理器的计算机或计算机集群的使用权限.</li>
	<li>使用 Trinity32 (表1；补充文件1）将数字化归一化的测序读段集组装成重叠群。为减少内存使用，请使用--min_kmer_cov 2参数。</li>
</ol>
12. 组装评估
<ol>
	<li>在 Trinity 重叠群输出结果上运行 Assemblathon2 项目中的 assemblathon_stats.pl 脚本33 。该脚本可执行与评估组装质量相关的基本计算，例如支架数量、N50、组装组成等（表 1；补充文件 1）。</li>
</ol>
13. 组装转录组的注释
<ol>
	<li>对组装序列与参考蛋白序列集进行 Blastx 分析（表 1）；对于蚊类，可选用 Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens 和 Aedes aegypti 作为参考。具体操作为：首先将参考蛋白的 fasta 文件格式化为 Blast 数据库，然后执行 blastx 分析（补充文件 1）。</li>
</ol>
14. 使用 RSEM 将测序读段比对到基因组组装结果34（表 1）
<ol>
	<li>创建一个“转录本-基因对应表”文件，其中第一列为参考基因ID，第二列为contig ID。在电子表格编辑软件中，将Blastx输出结果的第一列和第二列互换位置，并将这两列保存为.txt文件。使用LineBreak程序将生成的.txt文件中的换行符转换为Unix格式。</li>
	<li>利用RSEM软件包中提供的rsem-prepare-reference脚本（补充文件1），基于转录组fasta文件创建参考数据集。</li>
	<li>使用RSEM软件包中提供的rsem-calculate-expression命令（补充文件1），对每个文库分别计算表达量。测序读段使用读段清洗步骤（步骤9.2）所得的成对fastq文件。
	<ol>
		<li>若同一生物学重复的RNA被分配至两个测序通道，应将两个fastq文件同时纳入表达量计算，以生成单个结果文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用RSEM软件包中提供的脚本rsem-generate-data-matrix（补充文件1），将每个文库的表达量结果转换为其他程序易于处理的矩阵格式。</li>
</ol>
15. 差异表达分析
<ol>
	<li>安装 R 和 EdgeR（表 1）。</li>
	<li>使用 read.delim 加载步骤 14.3 的 RSEM 结果（补充文件 1）。如有需要，将计数结果四舍五入至最接近的整数。 
	注意：EdgeR 用户指南建议将数据集限制在表达水平足够高、可检测到显著差异的基因范围内。</li>
	<li>为将数据格式化用于 EdgeR 分析，需从加载的数据文件（补充文件 1）生成 DGEList 对象，随后使用 TMM 标准化方法对数据进行标准化（补充文件 1）。接着估算数据的共同离散度和基因特异性离散度（tagwise dispersion）（补充文件 1）。</li>
	<li>通过 Benjamini-Hochberg 校正后的 p 值 &#60;0.05 筛选差异表达基因（补充文件 1）。绘制 log-fold-change 与表达丰度之间的分布图（补充文件 1）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了由于光周期诱导的白纹伊蚊（A. albopictus）滞育而导致差异表达基因的研究方法。该方案的意义在于，它独特地结合了蚊虫饲养与生物信息学技术，使得分子生理学研究项目的各个实验环节均可为初学者所掌握——特别是针对光周期滞育反应的研究人员。据我们所知，现有方法在蚊虫饲养方案的细节方面并未提供足够详尽的信息——而这些细节往往是识别饲养过程中错误所必需的；同时，也未对饲养阶段的实验设计提供指导，以支持后续成功的生物信息学分析。本文所述方法已针对白纹伊蚊（A. albopictus）进行了优化，尤其是饲养方法，通常从一个实验室世代到下一个世代需要六周时间。然而，在未来应用中，只需进行适度调整，该方法也可适用于其他表现出光周期滞育的蚊种23。此外，该实验设计通式及生物信息学分析流程也可推广应用于其他多型现象的研究。
在饲养过程中，应考虑若干未在方案中详细说明的要点 A. albopictus 幼虫。首先， A. albopictus 可在先前文献所述的多种自然和人工容器生境中发现<su...

下一代测序（NGS）技术的快速发展为研究多种非模式生物中遗传上复杂的生态适应现象的分子基础提供了令人振奋的机遇1–3。这一方法具有极强的推动力，因为它为具有特别有趣和/或已有详尽描述的生态学或进化历史的生物，以及具有实际意义的生物（如农业害虫和疾病传播媒介）的群体基因组学和功能基因组学研究奠定了基础。因此，NGS 技术正推动生态学领域的快速发展，并有望解决诸如理解生物对当前快速气候变化的响应机制4、入侵物种的扩散5以及宿主-病原体相互作用6,7等重要问题。
下一代测序（NGS）技术在生态学和进化生物学基础与应用研究中具有巨大潜力，部分原因在于这些方法能够以适中的成本应用于任何生物体，且成本水平在大多数研究实验室可承受范围内。此外，这些方法能够提供全基因组范围的信息，而无需预先具备 先验的 基因资源，例如微阵列芯片或完整基因组序列。然而，为了最大化高通量测序（NGS）实验的产出效率，必须仔细考虑实验设计，包括RNA取样的发育时期和组织特异性等问题。此外，分析这些实验所产生的海量数据（通常多达数亿条DNA序列读段）所需的技术技能一直是一个特殊挑战，并限制了NGS技术的广泛应用。
近年来，关于入侵性且具有重要医学意义的蚊子Aedes albopictus滞育转录基础的RNA-Seq研究，为在非模式生物中成功应用高通量测序技术（NGS）研究复杂生态适应的分子机制提供了一个有价值的实验方案范例8–10。A. albopictus是一种原产于亚洲的高度入侵性物种，近年来已扩散至北美洲、南美洲、欧洲和非洲11,12。与许多温带昆虫类似，A. albopictus的温带种群通过进入一种称为光周期滞育的休眠状态来度过冬季。在A. albopictus中，蛹期和成虫期雌蚊暴露于短日照（秋季）条件下，会产下滞育卵，其胚胎发育虽已完成，但卵壳内的预幼虫阶段会进入发育停滞状态，导致卵对孵化刺激不敏感15–17。与非滞育卵相比，滞育卵具有更强的抗干燥能力5,18，且总脂质含量更高19。因此，A. albopictus的光周期滞育是一种母体控制的适应性表型可塑性，对于在温带环境中度过严冬至关重要。尽管光周期滞育在多种昆虫中的生态意义已被广泛认识20,21，但这一关键适应性状的分子基础在任何昆虫中均尚未被充分阐明22。在A. albopictus这类于预幼虫阶段发生胚胎滞育的生物中，一个尤为引人关注的科学难题是：母体接收到的光周期信号如何传递给后代，并在胚胎发育过程中持续存在，最终导致预幼虫阶段的发育停滞。
本方案描述了为阐明光周期性滞育的转录组分而开展的高通量测序实验（转录组测序）所涉及的蚊虫饲养、实验设计及生物信息学分析方法 A. albopictus该方案可用于滞育的进一步研究 A. albopictus，可适用于研究其他经历卵滞育的近缘伊蚊物种中的滞育现象23并且对于利用高通量测序技术研究任何昆虫中复杂适应性状的转录基础也具有普遍意义。

<table><tbody><tr><td>培养箱 - 型号 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>可控环境室</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>由 Thermax Scientific Products 根据定制规格建造的步入式可控环境室，是培养箱的更大替代方案。http://thermmax.com/</td></tr><tr><td>冷荧光灯泡</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>培养皿 100 mm × 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>滤纸 20.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L 桶</td><td>Plastican</td><td>Bway Products</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>实用织物-白色蚊帐布</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>弹力袜</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>产品编号 081420</td></tr><tr><td>有机葡萄干</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>产卵杯（棕色）</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>该产品实际为一种琥珀色 125 ml 瓶子，需将瓶口部分切除后使用。</td></tr><tr><td>再生纸巾</td><td>Seventh Generation</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>模块化方形特百惠套装</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>玻璃研磨器</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>这些 Tenbroeck 组织研磨器用于破碎卵并释放 RNA 到 TRI 试剂中。</td></tr><tr><td>TRI 试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>每 50–100 mg 组织加入 1 ml TRI 试剂。注意 &amp;#8212; 该试剂有毒。</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>该试剂盒比传统的 DNase 处理后接苯酚/氯仿纯化方法产量更高，且使用更简便。</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>广泛应用于工作台表面及可能接触 RNA 样品的任何设备。该溶液呈弱碱性/腐蚀性，可能引起刺激，吞咽后有害。</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>每块芯片最多可加载 12 个 RNA 样品。</td></tr><tr><td>Hemotek 膜饲喂装置</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>5W1</td><td>该系统&amp;nbsp;提供 5 个可同时使用的饲喂站。包括 PS5 电源单元和电源线；5 个 FUI 饲喂器 + 食物储液罐和 O 形圈；塑料塞、Hemotek 胶原蛋白饲喂膜；温度设定工具；以及塞子取出工具。公司邮寄地址为：Hemotek Ltd；Unit 5 Union Court；Alan Ramsbottom Way；Great Harwood；Lancashire, UK；BB6 7FD；电话：+44 1254 889 307。</td></tr><tr><td>数字温度计及探头</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3 温度计和 KFU 探头。用于设定每个 FUI 饲喂单元的温度。</td></tr><tr><td>鸡全血，非无菌，含柠檬酸钠</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>500 ml 血液分装为 20 ml 等份，于 -80 &amp;#176;C 冻存，最长可保存 1 年。使用前在室温下解冻至少 1 小时。</td></tr></tbody></table>

一种用于亚洲虎蚊aedes albopictus光周期滞育研究的rna-seq实验与生物信息学分析方案

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

光周期滞育是一种重要的适应性机制，它使个体通过一系列生理变化（尤其是发育停滞和代谢降低）来逃避严酷的季节性环境。通过RNA-Seq进行全基因表达谱分析，可深入揭示光周期滞育的转录调控机制。亚洲虎蚊Aedes albopictus是研究滞育转录基础的理想模式生物，因其易于饲养、滞育可高效诱导，并具有丰富的基因组资源。本文稿提供了一个通用的实验流程，用于鉴定A. albopictus中由滞育诱导引起的转录差异。文中详细记录了蚊虫的饲养技术、诱导滞育与非滞育发育所需的条件、种群滞育率的估算方法，以及蚊虫RNA的提取与完整性评估。从Illumina测序仪获取的RNA-Seq数据处理流程最终生成一组差异表达基因列表。代表性结果表明，该方案可有效识别因光周期差异而在A. albopictus中转录水平上差异调控的基因。通过适度调整，该流程可便捷地应用于其他蚊类中滞育或其他重要生活史特征的转录基础研究。

两种代表性RNA样品的荧光测定结果显示，在约2,000 nt处出现两条条带（图1A、B）。昆虫28S核糖体RNA由两条通过氢键连接的多核苷酸链组成，这些氢键易被短暂加热或破坏氢键的试剂所打断35。由此产生的两个组分大小均与18S核糖体RNA相近。第二种RNA样品显示出高度降解（图1B）。
对一组代表性的白纹伊蚊（A. albopictus）进行光周期处理后，短日照条件下饲养的蚊虫滞育率较高，而长日照条件下饲养的蚊虫滞育率较低，尽管不同重复组之间存在一定的变异（表2）。例如，重复组SD2的滞育率（80%）低于其他重复组（87.18%–97.67%）。该重复组的样本量也最小，因此建议为滞育率测定保留足够数量的卵（&#62;150枚），以获得准确的结果。
对成年雌性 A. albopictus 的一个代表性文库进行测序后读段清洗，去除了大量读段（读段总数从 83,853,32...

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes albopictus）之间差异表达基因的实验方案。

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

光周期性滞育是一种重要的适应性机制，可使个体通过一系列生理变化来逃避严酷的季节性环境，……

以下实验的总体目标是鉴定光周期滞育反应的转录组分。在一种非模式蚊虫八十年代肘突库蚊（Aedes atropalpus）中，首先通过不同的光周期处理，制备出生物学重复的滞育与非滞育卵样本；随后，从每个重复样本中提取RNA，用于高通量RNA测序。随后通过计算方法对RNA序列进行处理，将其拼接成contig并进行注释。最终可通过RNA序列比对到转录组的结果推断出在诱导滞育与非诱导滞育光周期条件下基因表达的差异。该技术相较于现有方法（如微阵列分析）的主要优势在于，无需依赖先有的遗传资源（如基因组序列或微阵列），即可获得在滞育条件下基因表达的全局性估计。该方法有助于回答生态基因组学领域的一些关键问题，例如非模式生物中滞育期（DPOs）或其他重要生态适应性的转录基础是什么。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为获取足量的滞育与非滞育期卵较为困难，且后续的生物信息学分析具有挑战性。在开始实验之前，我们首次提出该方法的设想，是由于注意到高通量DNA测序技术正变得越来越经济，并为获取非模式生物的全基因组表达谱提供了一种切实可行的方法。设置两个带有可编程照明的光周期培养箱，温度为21摄氏度，以实现最佳的滞育表达，并保持约80%的相对湿度。将其中一个培养箱设定为非滞育诱导光周期，光照周期为16小时光照/8小时黑暗；另一个设定为滞育诱导光周期，光照周期为8小时光照/16小时黑暗。两个培养箱的光照开启时间应保持一致，以同步光周期之间的昼夜节律。接下来，将适量卵的卵纸浸入500毫升去离子水中，并加入1毫升研磨的狗粮和卤虫饲料混合液。用纱布覆盖容器，并用橡皮筋固定纱布，以保持其位置。然后将卵置于16小时光照、8小时黑暗的长日照光周期培养柜中孵育约24小时。次日，将每组约30只孵化的幼虫转移至分别盛有90毫升去离子水的10厘米×10厘米×2厘米的培养皿中。每隔48至72小时，将幼虫转移至新的洁净培养皿，并在每次转移时喂食新鲜的食物悬液。大约六天后，为每种光周期处理的三到四个成虫饲养笼底部铺上湿润的滤纸，并用去离子水润湿滤纸，加水量以能提高笼内局部湿度但不产生积水为宜。用永久性记号笔在饲养笼侧面注明光周期条件、重复编号、笼起始日期及其他与实验相关的必要信息。随后在10天内每隔一天将蛹转移至小杯洁净水中，每25毫升水中的蛹数不超过50只，并将这些小杯放入对应实验组的成虫饲养笼中。同时，在饲养笼顶部的网盖上放置有机葡萄干，为羽化的成虫提供糖分。为了促进雌虫产卵，在首次吸血后四到五天，取深色的50毫升离心管，内衬一张有纹理的未漂白纸巾，加入去离子水至半满，每个饲养笼中放入一个这样的杯子，用于收集和保存卵。更换每个笼子中的卵纸，并将刚取出的卵纸放入培养皿中，储存在八个16小时光照、8小时黑暗的短日照光周期柜中，以避免对卵的储存产生干扰影响。收集卵纸约48小时后，在空气中将卵纸自然晾干，使其变得柔软且触感微湿，但不可过湿，以免纸张因水分过多而变深或诱发孵化。为测定滞育发生率，记录每张卵纸上的卵数。然后将单个滤纸完全浸入含有约 80 毫升去离子水的 90 毫升培养皿中。为促进其孵化，加入约 0.25 毫升的食物悬液，24 小时后，将培养皿置于黑色表面上。接着在培养皿一侧放置光源，幼虫会远离光线，从而可清晰地计数各个初孵幼虫。计数后使用移液器将每条幼虫移除，以防止重复计数。然后将卵纸放入新的培养皿中重新晾干。一周后对第二批孵化的幼虫进行计数后，将带有剩余未孵化卵的卵纸放入新的90毫升培养皿中，加入约80毫升新鲜漂白液，注意确保卵纸完全浸没于漂白液中。将载玻片置于通风橱中过夜，次日使用光学显微镜统计未孵化虫卵的数量。若虫卵已形成胚胎，其颜色呈乳白色，背侧可见两个相对的小黑点，即为发育中的眼点。实验开始前，需用RNA去污染溶液仔细清洁实验台面，以清除残留的核酸酶，防止RNA降解。接下来，使用骆驼毛刷将至少400枚含有发育中胚胎的蚊卵在相应发育时期转移至玻璃研磨器中。在通风橱内，加入1毫升Trizol，研磨卵直至完全粉碎，然后按照试剂盒说明书进行Trizol法RNA提取，并用异丙醇沉淀RNA。根据制造商说明书，在 50 微升反应体系中，使用最多 1 微升的 D ns 处理最多 10 微克的 RNA，在 37 摄氏度下反应 30 分钟。接下来，将反应物加入 5 微升悬浮的 DNA 失活试剂中，在室温下孵育 5 分钟。孵育期间，轻轻涡旋振荡悬浮液三次。然后将RNA提取物在10,000 × g条件下离心1.5分钟，将含有RNA的上清液转移至新的离心管中用于测序。最后，请参阅配套文本，了解如何对获得的下一代测序数据进行处理，包括测序读长、文库制备、序列拼接、注释以及差异表达分析。在第一张图中，两个代表性RNA样本的荧光定量结果显示在约2000个核苷酸处出现两条条带。昆虫的28S核糖体RNA由两条通过氢键结合的多核苷酸链组成，这些氢键容易被短暂加热或破坏氢键的试剂所打断。由此产生的两个组分大小与18S核糖体RNA相近，在第二个RNA样本中可观察到明显的降解现象。对一组合代表性白纹伊蚊（albopictus mosquitoes）进行光周期处理后，结果显示：在短日照条件下饲养的蚊虫滞育率较高，而在长日照条件下饲养的蚊虫滞育率较低。尽管重复实验之间存在一些差异，例如短日照处理的第二天组表现出的滞育率低于其他重复组。对数字化标准化的测序读段进行 Trinity 组装，共获得 76,377 条 contig，平均 contig 长度为 1020.3 bp，最长 contig 长度为 20,892 bp。需要注意的是，contig 长度的分布明显偏向较短的 contig。这在从头转录组组装中较为典型。在最终的图表中，对在滞育诱导条件下培养的胚胎（卵产后11天和21天）进行差异表达分析，结果显示这两个时间点之间共有3,128个差异表达基因。一旦掌握该技术，若操作得当，从组织获取到生物信息学分析完成，整个流程可在六至八个月内完成。在进行该实验操作时，必须牢记：在进入下一步之前，应逐一确认每个步骤是否成功完成。例如，在按照本方案检测 RNA 完整性之前，需先确认实验条件已成功产生滞育型胚胎（DPA）和非滞育型卵。此外，还可采用其他方法，如定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）或比较基因组学分析，以进一步探究目的基因在特定组织或发育阶段的表达特征，以及分子进化过程中的相关问题。请注意，操作三元醇可能具有极高危险性，进行本实验操作时必须采取防护措施，例如佩戴手套、实验服，并在通风橱中进行。

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生物学

实验和生物信息学议定书光周期滞育的亚洲虎蚊的RNA序列分析，白纹伊蚊

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了Dimopoulos实验室用于将dsRNA注入冈比亚按蚊（Anopheles...

冈比亚按蚊成蚊RNAi实验方案

定量实时PCR（qRT-PCR）是一种有效检测不同昆虫组织和发育阶段mRNA水平的工具。本报告展示了利用qRT-PCR测定入侵性昆虫物种翡翠 ash 蛀虫（emerald ash...

利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

在本实验方案中，我们结合RNAi介导的基因沉默与体内利尿测定法，研究目标基因敲降对蚊虫体液排泄的影响。...

RNAi介导的基因敲低和 体内 成年雌性个体利尿实验 埃及伊蚊 蚊子

通过两种方法估算埃及伊蚊（Aedes...

生理记录与黄热病蚊子Aedes aegypti味觉附器的RNA测序

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles...

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。...

蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

IR-TEx 用于研究冈比亚按蚊（Anopheles...

IR-TEx：一种面向疟疾媒介的开源大数据转录组学数据整合工具 Anopheles gambiae

我们提供了一种详细的电穿孔介导的RNA干扰实验方案，适用于蜻蜓目（Odonata）昆虫，包括使用蓝尾丝蟌（Ischnura senegalensis：Coenagironidae：Zygoptera）和斑翅蜻（Pseudothemis...

基于电穿孔的Odonata目昆虫RNA干扰方法

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes...

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

本实验方案描述了在实验室中饲养卷蛾科害虫的方法。利用两种卷蛾科害虫，建立了区分昆虫性别的步骤以及用于高通量测序的核酸提取方法。...

卷蛾科害虫的规模化饲养与分子研究

了解白纹伊蚊光周期滞育的转录组分析方法。本研究利用RNA测序技术识别滞育与非滞育状态下的差异表达基因，为理解非模式生物的生态适应机制提供重要分子基础。

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

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