Name: 在一个三维胶原蛋白矩阵分析细胞迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习三维胶原蛋白基质中的细胞迁移分析方法，利用延时视频显微镜和计算机辅助追踪技术记录癌细胞、白细胞及干细胞的迁移行为。该技术有助于揭示调控细胞运动的信号通路，为开发抑制肿瘤转移的新型治疗策略提供重要依据。

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本工作由德国慕尼黑 Fritz-Bender 基金会资助

1. 迁移室的制备
<ol>
	<li>制备石蜡/凡士林（1:1）混合物并加热至完全融化。使用毛笔涂抹2-3次&#160;在载玻片中央按比例涂布一层石蜡/凡士林（1:1）混合物 图示&#160;1B-1D. 
	注意：我们使用的是普通载玻片（76 × 26 × 1.0–1.5 mm（宽×长×高））</li>
	<li>迅速将熔化的石蜡/凡士林混合物涂抹于载玻片上，以免在绘制过程中凝固。确保石蜡/凡士林层的长度约为2-2.5 cm，宽度为0.3-0.5 cm，厚度约为0.1-0.15 cm。</li>
	<li>加入盖玻片，并用两到三层石蜡/凡士林混合物密封图1E，图1F）。进行常规细胞迁移实验时，使用4-8个迁移小室。将迁移小室垂直放置于支架中。</li>
</ol>
2. 胶原悬浮细胞混合物的制备
<ol>
	<li>收获（例如，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化并计数目标细胞。将细胞重悬于含胎牛血清（FCS）、抗生素及推荐添加剂的完全培养基中。准备4-8&#160;1.5 ml 离心管和含有 4-6 x 10⁶ 细胞的 20 µl 细胞悬液4 细胞（细胞总数取决于待分析的细胞类型），用完全培养基补至50 µl。 
	注意：其他化合物（例如生长因子、趋化因子、抑制剂 等等。将适量的细胞悬液加入上述溶液中。使用适当的母液，使细胞悬液的终体积不超过 50 µl。</li>
	<li>为四次细胞迁移实验准备总共452 µl的终浓度胶原蛋白悬浮液。取50 µl 10x MEM（pH 5.1–5.5）和27 µl 7.5%碳酸氢钠溶液（pH 9.0–9.5）加入1.5 ml反应管中，充分混匀，观察溶液颜色由黄橙色变为深紫色（pH 9.0–9.5）。随后加入375 µl液态胶原蛋白悬浮液至上述10x MEM/碳酸氢钠溶液中，充分混匀。最终胶原蛋白悬浮液的pH应约为7.5（以淡紫色为指示）。 
	注意：检测7.5%碳酸氢钠溶液的pH值。若pH值约为7.5，将碳酸氢钠溶液敞盖置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）2) 用 CO 饱和2 并提高pH值（约9.0 - 9.5）。胶原悬浮液-细胞混合物的pH值对胶原网络的稳定性至关重要；若pH过低，胶原晶格将在细胞迁移实验过程中发生坍塌。 
	注意：本实验方案使用牛跟腱来源的液态胶原蛋白（pH 1.9–2.2，胶原蛋白浓度为2.9–3.3 mg/ml，其中95%为I型胶原蛋白，5%为IV型胶原蛋白）。有关使用其他来源（如猪或大鼠）I型胶原蛋白制备胶原蛋白凝胶的更多实验方案示例，见于 32,33不要改变所用溶液的体积，否则会改变胶原基质最终浓度（1.67 mg/ml）。胶原浓度的升高或降低会影响胶原纤维的密度及其平均间距，进而影响细胞的迁移行为。34.</li>
	<li>将100 µl终浓度胶原悬浮液加入50 µl细胞悬浮液中，充分混匀。终浓度胶原悬浮液（胶原蛋白浓度为1.67 mg/ml）略具黏性。为准确转移100 µl，应在移液前将终浓度胶原溶液上下吹打一次后再加入细胞悬浮液中。 
	注意：一旦胶原悬浮细胞混合物与10倍浓缩的MEM/碳酸氢钠溶液混合且pH值升至7.5，胶原纤维即刻开始聚合。</li>
	<li>将最终的胶原悬浮液细胞混合物从反应管转移至迁移室中。轻轻敲击迁移室，使胶原悬浮液细胞混合物均匀分布在迁移室底部。图1H）。将迁移小室垂直放入支架中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育约30分钟2以促进胶原纤维的聚合。</li>
	<li>注意，聚合的胶原晶格呈轻微浑浊，但仍为淡紫色。用完全培养基或含有目标补充物的完全培养基填充迁移室，并用石蜡/凡士林混合物密封迁移室。图1I，图1J).</li>
</ol>
3. 细胞迁移的记录与分析
本部分介绍了通过延时视频显微镜记录细胞迁移，以及通过手动细胞追踪分析细胞迁移的方法。
<ol>
	<li>打开显微镜和显微镜载物台加热器，将温度调节至37 °C。使用10倍物镜&#160;目标：将迁移室置于显微镜下，调焦至视野中约50个或更多细胞。</li>
	<li>使用多摄像头视频监控软件以延时模式记录细胞迁移。将细胞迁移视频以适当格式保存。 例如，“*.avi”或“*.mov”。将细胞迁移视频文件链接至包含支持信息（如细胞类型和实验条件）的数据库。 
	注意：我们以1:80的时间推移因子对淋巴细胞和造血干细胞（HSPCs）进行长达2小时的记录，即时间推移中的0.75秒相当于实际时间的1分钟。肿瘤细胞为移动缓慢的细胞，因此以1:1,800的时间推移因子至少记录16小时（时间推移中的0.5秒相当于实际时间的15分钟）。</li>
	<li>使用合适的细胞追踪软件（如 ImageJ 软件插件）分析细胞迁移视频（相关概述见于 18）。为了进行无偏分析，至关重要的是在不知晓细胞是否具有迁移活性的情况下随机选择细胞。 
	注意：我们使用自行开发的软件应用程序，通过鼠标光标精确跟随运动中的细胞（光标定位在细胞核上），手动追踪每次实验中至少30个细胞的运动路径。在追踪过程中，所追踪细胞的xy坐标会根据所使用的时间推移模式自动记录。对于淋巴细胞/造血干细胞（HSPCs），每0.75秒记录一次xy坐标（相当于实时1分钟）；而对于肿瘤细胞，则每0.5秒记录一次xy坐标（相当于实时15分钟）。</li>
	<li>为典型的细胞迁移实验，每细胞确定共计60个xy坐标。这相当于淋巴细胞/造血干细胞（HSPCs）的实时1小时，或肿瘤细胞的实时15小时。其中，“,”表示细胞在两个时间点之间未发生移动，而“数值”则表示细胞在两个时间点之间移动的距离，单位为“像素”。&#160;时间点（图2A). 
	注意：人工细胞追踪需要经验。特别是迁移速度较快的细胞较难追踪，且每种细胞类型均表现出独特的迁移行为，这种行为可能由添加的因子所触发。在追踪过程中若发生细胞分裂，应随机选择一个子代细胞继续追踪。在追踪期间迁出视野或死亡的细胞不应忽略，而应纳入分析。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用合适的软件应用程序分析细胞追踪数据， 例如，一个电子表格程序。
	<ol>
		<li>通过复制细胞追踪的原始数据来分析细胞追踪数据（图2A)，输入至自行设计的电子表格模板中。将代表细胞迁移总距离的“数值”之和乘以校正系数，以将“像素”转换为“µm”。</li>
		<li>确定两个细胞迁移参数：运动活性（等同于迁移速率）和主动运动时间图2C、2D).</li>
		<li>将迁移距离小于 25 µm（用于减少假阳性细胞数量的阈值）的细胞识别为非移动细胞，并将这些细胞的“数值”替换为“,”。 
		注意：“运动活性”（或迁移率）参数表示在两个时间点之间发生移动的被追踪细胞群体中细胞所占的百分比图 2D）。“数值”定义为移动的细胞，而“，”定义为不移动的细胞。“主动运动时间”（time active）参数表示细胞在观察时间段内发生迁移的时间占总时间的百分比。图 2C）。“数值”表示细胞已发生移动，而“，”表示细胞未发生移动。该参数进一步用于确定未发生移动的细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算统计学显著性并展示细胞迁移数据。
	<ol>
		<li>使用 Mann-Whitney 检验计算细胞平均运动活性（迁移率）的统计学显著性&#160;U&#160;测试。考虑 p 值 &#60; 0.05 作为显著性水平。</li>
		<li>以 xy 图、箱形图或柱状图显示细胞的平均运动活性。以柱状图或直方图显示基于单个细胞的数据，例如活动运动时间或速度。 
		注意：如果所选的电子表格软件应用程序不包含箱线图或直方图工具，则应进行在线搜索以查找合适的教程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

迁移能力是肿瘤细胞的显著特征之一4。若肿瘤细胞无法从原发灶脱离并穿过周围结缔组织迁移，则无法形成继发性病灶，而继发性病灶几乎是所有癌症患者死亡的主要原因。正因如此，目前许多研究聚焦于癌细胞的迁移过程。这些研究的目标是鉴定能够有效阻断肿瘤细胞迁移的新型靶分子和靶通路，从而抑制或延缓转移灶的形成。此类研究的一个实例是β-受体阻滞剂，已有研究表明其可在体外和体内抑制乳腺癌细胞的转移扩散in vitro 和 in vivo36，并且与三阴性乳腺癌患者无复发生存期的改善相关37。我们近期的研究表明，由人乳腺上皮细胞系与人乳腺癌细胞系自发融合形成的杂交细胞（而非亲本细胞）在趋化因子CCL21刺激下表现出增强的迁移活性26。CCL21已被证实与包括乳腺癌在内的多种癌症类型的淋巴结转移形成相关38，提示细胞融合可能是肿瘤（杂交）细胞获得转移特性的机制之一39,40。
三维胶原基质迁移实验相较于Boyden小室/Transwell实验...

与细胞融合（综述见&#160;1,2）类似，细胞迁移是另一种参与多种生理过程的生物学现象，包括胚胎发育、伤口愈合和免疫反应（综述见&#160;3）。然而，迁移能力也是肿瘤细胞发生转移的前提条件（综述见&#160;3,4）。
细胞迁移是一个复杂且尚未完全阐明的过程，由多种配体（例如，细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、细胞外基质成分）与受体（例如，受体酪氨酸激酶、趋化因子受体、整合素）相互作用所启动的多条信号转导通路共同调控5，最终导致肌动蛋白细胞骨架的重组，同时伴随黏着斑复合物的解聚与再组装以及整合素介导的信号传导6。
为了分析细胞迁移，有多种方法 体外 和 体内 细胞迁移实验在过去几十年中不断发展，包括Boyden小室/Transwell实验7划痕实验/伤口愈合实验8-10三维（3D）胶原基质迁移实验11 以及活体成像/显微镜技术（综述见&#160;12）。每种细胞迁移实验方法都有其优缺点， 例如，涉及成本、设备需求、操作难易度或所获数据的可靠性。
Boyden小室/Transwell实验和划痕实验/伤口愈合实验均为简便、低成本且成熟的细胞迁移检测方法 体外7-10在Boyden小室/Transwell实验中，将细胞接种于含有孔隙（直径约8 µm）的插入式培养小室上层，即所谓的上室7可选地，可将插入物包被细胞外基质成分， 例如，纤连蛋白，胶原蛋白， 等等。，以模拟更接近生理的环境。同样，内皮细胞可在插入物表面培养，从而模拟内皮细胞屏障13在设定的时间段内穿过孔道进入含有培养基及补充物（如生长因子和趋化因子）的下室的细胞，被用作定量细胞迁移（或外渗）的检测指标。
在划痕实验/伤口愈合实验中，将细胞接种于培养板中并培养至完全融合10。根据实验设计的不同，培养板可预先包被细胞外基质成分，例如纤连蛋白。通过刮除细胞单层形成划痕/伤口后，划痕/伤口两侧的单个细胞可迁移进入空隙，从而填补/愈合该区域10。通过测定划痕/伤口两侧间距随时间的变化，可作为评估细胞迁移活性的检测指标10。然而，为了区分细胞增殖（也可能导致划痕/伤口的填补/愈合）与细胞迁移，建议将该实验与延时视频显微镜结合单细胞追踪技术联用10。
然而，Boyden小室/Transwell实验和划痕实验（即伤口愈合实验）在模拟生理样细胞环境方面均存在明显不足。在Boyden小室/Transwell实验中，细胞必须穿过塑料膜上的孔隙进行迁移；而在划痕实验/伤口愈合实验中，细胞则被接种于二维预包被的塑料培养板表面。同样，已有充分认识表明，细胞在二维与三维环境中的迁移行为存在显著差异3。例如，成纤维细胞在三维基质中的黏附结构与在二维基质上所表征的局灶性黏附和纤维状黏附在多个方面有所不同，包括α5β1和αvβ3整合素、paxillin、其他细胞骨架组分以及局灶黏附激酶的酪氨酸磷酸化水平14。同样，嵌于三维环境中的细胞也表现出改变的迁移行为15。因此，为了更准确地分析细胞迁移，建议采用一种迁移实验方法，能够测量单个细胞在三维生理或生理样环境中的迁移能力。
活体成像/显微技术是测量细胞在三维生理环境中迁移的金标准。这不仅涉及细胞与细胞外基质之间的相互作用，还包括不同类型细胞之间的相互作用，例如肿瘤细胞在穿出血管过程中与内皮细胞的相互作用16，或淋巴细胞在淋巴结内的迁移过程17。迄今为止，得益于荧光显微技术的进步，如双光子共聚焦激光扫描显微技术、活体荧光染料的应用以及表达荧光蛋白衍生物的转基因小鼠品系，这些研究才成为可能12,16,17。此外，活体成像/显微技术还可与手动或自动的细胞追踪技术相结合18。然而，由于该技术需要使用双光子共聚焦激光扫描显微镜以及实验动物（特别是合适的转基因动物模型），因此活体成像/显微技术是一种成本较高的方法。
为了克服Boyden小室/Transwell实验和划痕实验/伤口愈合实验的局限性，并分析不同类型细胞在三维环境中的迁移行为，开发了3D胶原基质迁移实验11,19因此，迁移的细胞被包埋在一种三维胶原纤维网络中，该环境更类似于 体内 情况。同时，通过延时视频显微技术可测量细胞的真实迁移过程，从而确定多种迁移参数及其在促迁移因子或抑制剂作用下的变化。该技术可用于分析多种细胞类型，包括淋巴细胞和白细胞。11,20造血干细胞/祖细胞21-24和肿瘤细胞5,25-29除了单个细胞外，还可以将细胞簇或球状体包埋于胶原基质中，同时分析单个细胞从细胞簇/球状体迁移至胶原网络的过程。30,31.
本方案介绍了一种简单但功能强大的技术，用于分析不同类型细胞在三维环境中的迁移行为—— 体外 结果接近的实验方法 体内 情况

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL 倒置显微镜</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台加热器</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 视频摄像机</td><td>JVC, Bad Vilbel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axis 241Q 视频服务器</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac G5 计算机</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多摄像头视频监控软件（Security Spy）</td><td>Bensoftware, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>本地药店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol（液态胶原蛋白）</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, 荷兰</td><td></td><td>含有 2.9 - 3.3 mg/ml 牛胶原蛋白（95% I 型胶原蛋白，5% IV 型胶原蛋白）</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 碳酸氢钠溶液</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>662035</td><td>先溶于 CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;；使用前用 DMSO 重悬</td></tr></tbody></table>

三维胶原基质中细胞迁移的分析

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

迁移能力是多种细胞类型的特征，并在多个生理过程中发挥关键作用，包括&#160;胚胎发育、伤口愈合以及免疫应答。然而，细胞迁移也是癌症中的关键机制，使癌细胞能够从原发肿瘤脱离，进而启动转移性扩散。近年来，已开发出多种细胞迁移检测方法，用于分析不同类型细胞的迁移行为。由于细胞在二维（2D）与三维（3D）环境中的运动行为存在显著差异，因此可认为，对嵌入于3D环境中的细胞迁移进行分析，将获得更具意义的细胞迁移数据。本研究所述的3D胶原基质迁移检测法的优势在于，细胞被嵌入由胶原纤维构成的生理型3D网络中，而胶原纤维是细胞外基质的主要成分。通过延时视频显微镜技术可实时测量细胞迁移，从而确定多种迁移参数，并分析这些参数在促迁移因子或抑制剂作用下的变化。该技术可用于分析多种细胞类型，包括淋巴细胞/白细胞、干细胞和肿瘤细胞。同样，也可将细胞簇或类球体嵌入胶原基质中，同时分析单个细胞从细胞簇/类球体迁移至胶原晶格的过程。我们总结认为，3D胶原基质迁移检测法是一种多功能的方法，可用于在类似生理的3D环境中分析细胞迁移。

结合延时录像显微镜和计算机辅助细胞追踪技术的三维胶原基质迁移实验可用于测定多种细胞迁移参数，包括基于细胞群体的参数（例如，平均运动活性）和基于单个细胞的参数（例如，主动运动时间、速度、迁移距离）。图2展示了所获得的细胞追踪数据集、数据处理及数据呈现的示例。细胞追踪数据文件类似于一个表格（图2A），每一列代表一个被追踪的细胞，每次细胞迁移实验共追踪30个细胞。每一行记录了细胞在两个时间点之间是否发生移动的信息。“数值”之和表示细胞在两个时间点之间移动的距离（单位为“像素”），即该细胞的总迁移距离。该数值需乘以校正因子，将“像素”转换为“µm”。为减少假阳性细胞数量，将迁移距离小于25 µm的细胞定义为非移动细胞。每个细胞的速度（µm/min）通过将“总迁移距离”除以“观察期总时间（min）”计算得出。
为了表征细胞的运动行为，通常使用两个参数：运动活性（图 2D）表示所分析细胞群体的平均运动活性（或迁移速率），而主动运动时间（图2C...

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。

迁移能力是多种细胞类型的特征，在包括胚胎发育在内的多种生理过程中发挥着关键作用。

本实验的总体目标是分析细胞在三维环境中的迁移行为。首先，将目标细胞嵌入三维胶原凝胶基质中。然后，利用延时视频显微技术记录细胞的运动过程，接着通过计算机辅助的细胞轨迹追踪技术确定迁移参数，并使用电子表格软件对细胞追踪数据进行分析。最终，该方法可用于研究在癌症背景下调控癌细胞或正常细胞（如白细胞、淋巴细胞和干细胞）迁移的因素及信号转导通路。因此，了解细胞迁移、调控因子及其相关信号转导通路可能有助于开发新的治疗策略，以抑制肿瘤细胞的迁移和转移扩散。对于迁移小室，需迅速在载玻片中部用熔化的石蜡与凡士林混合物刷上两层，加入盖玻片，再用两层石蜡与凡士林混合物进行密封。然后将迁移小室垂直放入装有1.5毫升反应管的支架中。向胶原悬浮液中加入20微升细胞悬液。取50微升10倍浓缩MEM培养基与27微升7.5%碳酸氢钠溶液，充分混匀。然后加入375 µL液体胶原悬浮液，充分混匀，直至呈现浅紫色，表明pH为7.5。现在将100 µL终末胶原悬浮液加入50 µL细胞悬浮液中，边加边充分混匀，并注意观察胶原纤维的起始聚合。在pH 7.5条件下，将混合液转移至迁移室中。轻轻敲击迁移室，使胶原悬浮液细胞混合物均匀分布在迁移室底部。将迁移室垂直放入支架中，孵育30分钟。当聚合的胶原凝胶略显浑浊但仍呈淡紫色时，用适当的培养基填充迁移室，并用石蜡密封迁移室。石油 jelly 混合物。在迁移室中使用 10 倍放大倍数，将显微镜载物台加热器调节至 37 摄氏度。在视野中聚焦约 50 个或更多细胞。使用多摄像头视频监控软件，以延时模式记录细胞迁移过程。将细胞迁移视频保存为适当的文件格式。将细胞迁移视频文件与包含细胞类型和实验条件等支持信息的数据库进行关联。接下来，使用适当的细胞示踪软件对细胞迁移视频进行客观分析。在不知晓细胞总体迁移活性的情况下，随机选择细胞进行分析，在典型的细胞迁移实验中，每细胞获取约60个XY坐标。若发生细胞分裂，则随机选择一个子代细胞进行追踪。使用适当的软件应用程序（如电子表格程序）分析细胞追踪数据，以计算细胞迁移的总距离。将数值像素值的总和乘以校正因子，转换为微米。将迁移距离小于25微米阈值的细胞定义为非移动细胞，并将这些数值替换为逗号。接下来，计算运动活性，即在两个时间点之间发生移动的追踪细胞群中细胞所占的百分比。同时，计算活跃运动时间，即细胞迁移时间占整个观察时间段总时间的百分比。然后使用Mann-Whitney U检验计算统计学显著性，并展示细胞迁移数据。典型的细胞追踪数据文件类似于一个表格，其中每一列代表一个被追踪的细胞。行中包含细胞运动的位置信息。随着时间推移，可通过分析细胞群体的平均运动活性以及活跃运动持续的时间来表征细胞的运动行为。本示例展示了来自四次独立实验的 120 个细胞的迁移活动。每个菱形表示一个细胞在至少两个时间点之间发生了移动。灰色线条用于区分移动细胞与非移动细胞。运动活性参数可以以XY图或箱形图的形式展示。为了可视化分析细胞群体的动态变化，直方图能够有效显示这些细胞的活跃时间。对MDA HER2和M-D-A-N-E-O乳腺癌细胞系迁移行为的分析表明，这两种细胞系均表现出相似的自发性运动活性。活动时间参数显示，与 M-D-A-N-O 乳腺癌细胞相比，M-D-A-H-E-R 细胞中自发运动的细胞数量略高。使用 100 纳克/毫升 EGF 刺激后，通过运动细胞数量和活动运动时间测定，M-D-A-H-E-R2 的迁移活性显著增强。有趣的是，M-D-A-N-E-O 细胞在 EGF 刺激下发生迁移，并表现出活动时间模式的改变；使用磷脂酶 Cγ1 抑制剂 Uc 3 1 22 处理可降低 M-D-A-H-E-R2 和 M-D-A-N 的自发迁移及 EGF 诱导的迁移。 EEO 细胞。对时间活跃参数的分析显示，用 2 µM U 73122 处理 MDAN EEO 细胞后，细胞运动活性显著降低，主要归因于非运动细胞数量的增加。一旦掌握，淋巴细胞和白细胞向三维胶原凝胶的迁移可在约两小时内记录完成，而肿瘤细胞则需过夜记录。

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