三维胶原基质中细胞迁移的分析
2014年10月5日
细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。
本实验的总体目标是分析细胞在三维环境中的迁移行为。首先，将目标细胞嵌入三维胶原凝胶基质中。然后，利用延时视频显微技术记录细胞的运动过程，接着通过计算机辅助的细胞轨迹追踪技术确定迁移参数，并使用电子表格软件对细胞追踪数据进行分析。
最终，该方法可用于研究在癌症背景下调控癌细胞或正常细胞（如白细胞、淋巴细胞和干细胞）迁移的因素及信号转导通路。因此，了解细胞迁移、调控因子及其相关信号转导通路可能有助于开发新的治疗策略，以抑制肿瘤细胞的迁移和转移扩散。对于迁移小室，需迅速在载玻片中部用熔化的石蜡与凡士林混合物刷上两层，加入盖玻片，再用两层石蜡与凡士林混合物进行密封。
然后将迁移小室垂直放入装有1.5毫升反应管的支架中。向胶原悬浮液中加入20微升细胞悬液。取50微升10倍浓缩MEM培养基与27微升7.5%碳酸氢钠溶液，充分混匀。
然后加入375 µL液体胶原悬浮液，充分混匀，直至呈现浅紫色，表明pH为7.5。现在将100 µL终末胶原悬浮液加入50 µL细胞悬浮液中，边加边充分混匀，并注意观察胶原纤维的起始聚合。在pH 7.5条件下，将混合液转移至迁移室中。
轻轻敲击迁移室，使胶原悬浮液细胞混合物均匀分布在迁移室底部。将迁移室垂直放入支架中，孵育30分钟。当聚合的胶原凝胶略显浑浊但仍呈淡紫色时，用适当的培养基填充迁移室，并用石蜡密封迁移室。
石油 jelly 混合物。在迁移室中使用 10 倍放大倍数，将显微镜载物台加热器调节至 37 摄氏度。在视野中聚焦约 50 个或更多细胞。
使用多摄像头视频监控软件，以延时模式记录细胞迁移过程。将细胞迁移视频保存为适当的文件格式。将细胞迁移视频文件与包含细胞类型和实验条件等支持信息的数据库进行关联。
接下来，使用适当的细胞示踪软件对细胞迁移视频进行客观分析。在不知晓细胞总体迁移活性的情况下，随机选择细胞进行分析，在典型的细胞迁移实验中，每细胞获取约60个XY坐标。若发生细胞分裂，则随机选择一个子代细胞进行追踪。
使用适当的软件应用程序（如电子表格程序）分析细胞追踪数据，以计算细胞迁移的总距离。将数值像素值的总和乘以校正因子，转换为微米。将迁移距离小于25微米阈值的细胞定义为非移动细胞，并将这些数值替换为逗号。
接下来，计算运动活性，即在两个时间点之间发生移动的追踪细胞群中细胞所占的百分比。同时，计算活跃运动时间，即细胞迁移时间占整个观察时间段总时间的百分比。然后使用Mann-Whitney U检验计算统计学显著性，并展示细胞迁移数据。
典型的细胞追踪数据文件类似于一个表格，其中每一列代表一个被追踪的细胞。行中包含细胞运动的位置信息。随着时间推移，可通过分析细胞群体的平均运动活性以及活跃运动持续的时间来表征细胞的运动行为。
本示例展示了来自四次独立实验的 120 个细胞的迁移活动。每个菱形表示一个细胞在至少两个时间点之间发生了移动。灰色线条用于区分移动细胞与非移动细胞。
运动活性参数可以以XY图或箱形图的形式展示。为了可视化分析细胞群体的动态变化，直方图能够有效显示这些细胞的活跃时间。对MDA HER2和M-D-A-N-E-O乳腺癌细胞系迁移行为的分析表明，这两种细胞系均表现出相似的自发性运动活性。
活动时间参数显示，与 M-D-A-N-O 乳腺癌细胞相比，M-D-A-H-E-R 细胞中自发运动的细胞数量略高。使用 100 纳克/毫升 EGF 刺激后，通过运动细胞数量和活动运动时间测定，M-D-A-H-E-R2 的迁移活性显著增强。有趣的是，M-D-A-N-E-O 细胞在 EGF 刺激下发生迁移，并表现出活动时间模式的改变；使用磷脂酶 Cγ1 抑制剂 Uc 3 1 22 处理可降低 M-D-A-H-E-R2 和 M-D-A-N 的自发迁移及 EGF 诱导的迁移。
EEO 细胞。对时间活跃参数的分析显示，用 2 µM U 73122 处理 MDAN EEO 细胞后，细胞运动活性显著降低，主要归因于非运动细胞数量的增加。一旦掌握，淋巴细胞和白细胞向三维胶原凝胶的迁移可在约两小时内记录完成，而肿瘤细胞则需过夜记录。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文讨论了在三维胶原基质中细胞迁移的分析方法，这是多种生理和病理过程中的关键环节。该方法可用于研究影响细胞运动的因素，尤其在癌症研究中具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 癌症研究
背景
- 细胞迁移对于伤口愈合和免疫应答至关重要。
- 它在癌症转移中发挥着重要作用。
- 了解迁移机制有助于开发治疗策略。
- 三维胶原基质为研究细胞行为提供了更接近生理条件的环境。
研究目的
- 分析各类细胞在三维环境中的迁移行为。
- 鉴定调控细胞迁移的相关因子及信号通路。
- 增进对肿瘤扩散机制的理解，推动相关治疗策略的开发。
使用的方法
- 将细胞嵌入三维胶原蛋白基质中。
- 利用延时视频显微镜记录细胞运动。
- 通过计算机辅助追踪界定迁移参数。
- 使用电子表格软件分析数据。
主要结果
- 成功追踪细胞在三维基质中的迁移。
- 鉴定影响细胞运动的关键因素。
- 揭示与迁移相关的信号转导通路。
- 对癌症治疗策略的潜在意义。
结论
- 三维胶原蛋白基质可用于研究细胞迁移。
- 了解细胞迁移机制有助于开发新的治疗策略。
- 需要进一步研究以探索特定的调控机制。
常见问题
行业重要性概述
在生理相关性的三维胶原基质中分析细胞迁移，可通过揭示促迁移因子和抑制剂如何调节运动行为，为目标靶点的验证提供可预测的可信度。该方法通过量化与转移潜能和免疫细胞迁移相关的迁移参数，支持在肿瘤学和免疫学研发管线中的机制性风险降低。该技术能够在发现早期将分子扰动与功能性迁移输出相联系，从而实现基于数据的决策，判断项目是否继续推进。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量EGF刺激或PLCγ1抑制如何改变细胞在三维基质中的迁移，来验证治疗假设。
- 操作价值：通过定量追踪总迁移距离和运动活性等迁移参数，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过鉴定在癌细胞模型中显著降低迁移活性的化合物，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：从生理胶原基质中嵌入的细胞产生标准化、可重复的迁移数据。
- 定量输出：生成可测量的参数，包括总迁移距离、运动活性百分比以及主动运动时间。
- 高通量筛选适用性：利用延时显微镜和基于电子表格的分析，支持多条件测试（例如 EGF 刺激、抑制剂处理）。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过分析肿瘤细胞从类球体向胶原基质中的迁移，模拟转移性扩散过程。
- 转化连续性：将发现阶段的迁移研究成果与抗迁移药物的临床前验证相衔接。
- 风险调整的推进：通过展示化合物（如 U73122）对运动活性的剂量依赖性效应，为后续研究进程的决策提供依据。
流程与工作流整合
三维胶原迁移实验适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的发现连续过程，可提供功能性的读数，从而连接生化实验与表型筛选。
- 发现生物学：通过将信号转导调节剂（例如 EGF、PLCγ1 抑制剂）与迁移行为的变化相关联，支持信号通路的阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的定量迁移指标，能够在不同细胞类型中实现可靠的化合物评估。
- 分析：生成可追踪的 XY 坐标和可计算参数（总移动距离、运动活性），以便使用 Mann Whitney U 检验等工具进行统计比较。
- 转化研究：通过模拟细胞从簇状结构中迁移的过程，与临床前研究的连续性保持一致，适用于转移和免疫细胞浸润的研究。
- 企业级复用：作为一个可重复使用的平台，可用于测试淋巴细胞、白细胞、干细胞和肿瘤细胞等多种细胞的迁移反应。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低迁移调控机制的模糊性，提供对靶点调节的预测可信度。
- 操作价值：通过明确定义的参数（例如，25微米阈值用于判定非移动细胞）和延时追踪，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：在开展成本较高的体内研究之前，实现抗迁移候选药物的早期风险排除，从而提高资本使用效率。
- 项目组合影响：通过量化化合物在与疾病相关的三维模型中对细胞迁移的影响，促进基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、胶原基质制备以及延时显微镜设置方面的专业技术。
- 依赖于环境控制仪器（如37°C载物台加热器）和多摄像头视频监控软件。
- 需要在不同团队间对细胞追踪方案进行标准化（例如，盲法选取细胞，每细胞记录60个XY坐标）。
- 需根据不同的细胞类型进行调整（例如，淋巴细胞迁移记录约需2小时，而肿瘤细胞则需过夜）。
- 受限于迁移腔室需手动划定，并使用石蜡-凡士林混合物进行密封。
