宽场显微镜的单平面照明模块与微毛细管方法

本实验的总体目标是利用倒置显微镜的光片激发模块进行单平面照明显微成像，并将其应用于三维细胞球体的观察。首先使用移液器将细胞球体从微孔板的一个孔转移至另一个孔中，经洗涤后进行孵育。随后将该S型细胞球体引入矩形毛细管中。

第二步是将片层光照明模块安装到倒置显微镜载物台的基板上。接下来，将含有类固醇的毛细管放入显微镜专用的样品 holder 中。最后一步是调整检测光路中片层光与显微镜物镜焦平面的匹配。

最终，可通过在细胞球体内部调节焦平面来进行三维荧光测量，从而获取有关药物摄取或S球体结构的单幅图像或Z轴堆叠（Z-stacks）信息。该技术相较于现有的光片显微镜主要优势在于成本低廉且高度灵活，因其由一个可适配于现有显微镜的模块构成，为研究提供了极大的自由度。该技术的应用前景涵盖用于治疗和诊断的药物及试剂的研究，尤其重要的是，微流控系统的可适配性使得在流动条件下对快速过程进行研究成为可能。

现在，这种激发方法结合任何检测技术均可在低光照剂量下提供对活细胞类固醇的深入观察。该方法也可应用于其他活体系统，如斑马鱼、斑马鱼胚胎以及光学透明的 CLE 组织样本。首先，在 96 孔板的每个孔中加入 50 微升加热后的 1.5% 琼脂糖培养基，静置使其凝固一至两小时。

然后，在已准备好的96孔板中，每孔接种约150个MCF-7乳腺癌细胞，在5%二氧化碳、37°C的培养箱中培养5至7天，直至细胞集落直径达到约200至300微米。接着，将细胞与浓度为2 µM至8 µM的蒽环类抗生素盐酸多柔比星在培养基中共同孵育6小时。孵育结束后，在显微镜观察前，用培养基或Earl's平衡盐溶液洗涤细胞。

使用倒置显微镜，并将单平面照明显微镜（SPM）激发模块安装到定位平台的基板上。在显微镜上配备10倍或20倍放大倍数的物镜，以及在显微镜检测光路中配备适当的长通滤光片。然后将积分相机安装到显微镜的检测端口。

使用激发波长优选为 470 纳米的激光器或激光二极管产生的平行准直光束，并将其照射至自旋模块。接着，将柱面透镜旋转 90 度，使光片转为垂直位置，以便对光片的束腰进行轴向调节。将含有荧光染料液体的毛细管放置于样品 holder 中。

将带有毛细管的样品架安装到显微镜的定位台上。调整毛细管的位置，使其居中，并使光片的束腰处于焦点位置。通过调节柱面透镜自身的轴向位置来调整光束束腰。

调节后将镜头复位。将细胞类固醇单独或分组置于内径截面为600 × 600微米、壁厚为120微米的矩形硼硅酸盐玻璃毛细管中。操作时，用拇指和中指垂直夹持空毛细管，并用食指封住其上端开口。

将毛细管下端开口移至细胞球体附近，在其周围的液体中释放上端开口处含有类固醇的液体。液体将立即通过毛细作用被吸入。通过重力调节S型球体在充满液体的毛细管内的位置。

或者，可通过移液将类固醇加入毛细管中。注意移液枪头开口的尺寸应一方面足够大，以容纳S类球体的大小，另一方面应小于或等于毛细管的内径。随后，将含有S类球体的毛细管放入显微镜专用的样品 holder 中。

将带有毛细管的样品架安装到显微镜的定位台上，并调整细胞类固醇的位置，使其居中并聚焦。通过调节反射镜和柱面透镜的位置，使照明光路中的光片与检测光路中物镜的焦平面匹配。用胎牛血清（FCS）填充毛细管，持续30分钟，以促进后续细胞类固醇在毛细管内壁玻璃表面的黏附。

在将细胞类固醇加入FCS包被的毛细管后，让毛细管中残留的FCS包被物干燥至少12小时。与之前相同，将毛细管置于培养箱中额外孵育2至4小时，以促进类固醇的细胞黏附。接下来，搭建微流控系统的flx部分，包括设置一个气泡捕获装置。

使用蠕动泵将含有荧光染料药物或试剂的培养基注入流出管路的 flx 中。首先将无气泡毛细管夹紧至流出管路，然后将毛细管另一端夹紧至排水管路。调节水浴的液体温度至所需数值。

然后调节蠕动泵至所需的泵速。使用开环装置将泵出的液体收集到接收容器中，用于数据采集和分析。设置激光功率和图像采集的积分时间。

将ZS堆栈的步进值设置在5至10微米之间，这有利于三维数据分析。由于光片厚度约为10微米，可通过在细胞类固醇内调节焦平面来获取单张图像或Zacks的测量结果。图中显示的是一个mc七细胞类固醇在8微摩尔多柔比星中孵育6小时后进行的Zack扫描结果。

这些图像详细展示了阿霉素的细胞摄取、分布及其降解情况。在类固醇外层细胞中，呈红色荧光的阿霉素主要定位于细胞核；而在类球体的内部区域，由降解产物产生的绿色荧光在细胞膜中占主导地位。通过SPM选择单层细胞，展示了化疗药物阿霉素在天然MC7人乳腺癌细胞中的摄取情况。

在流动系统中加入两微摩尔的阿霉素培养基后，阿霉素及其降解产物的红色和绿色荧光持续增强。一旦掌握操作要点，从安装光片消除模块到记录三维样品的荧光图像仅需几分钟。在测量和流动条件下，最重要的是确保样品牢固贴附在毛细管内壁表面，并避免气泡进入样品区域，以免导致样品从毛细管上脱落。

观看本视频后，您应该能够很好地理解光片照明显微镜，以及该多功能模块如何适配多种显微镜使用。