Name: 单一平面照明模块和一个宽场显微镜微毛细管法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习单层平面照明显微技术用于三维细胞球体成像，结合微流控系统实现荧光染料和药物的精准施加。该方法可适配倒置显微镜，为细胞生物学和神经科学研究提供高分辨率成像解决方案。

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本项目由巴登-符腾堡州以及欧洲联盟欧洲区域发展基金资助。作者感谢Rainer Wittig（ILM Ulm）提供U251-MG-L106-Grx1-roGFP2细胞系，并感谢Claudia Hintze提供的娴熟技术协助。

1. 细胞球体培养与孵育
<ol>
	<li>实验1：用化疗药物孵育细胞球体
	<ol>
		<li>通过将0.45 g琼脂糖加入30 ml培养基中，制备1.5%的琼脂糖溶液（足以用于6块板）。</li>
		<li>将步骤1.1.1中的混合物加热至至少80 °C，同时间歇搅拌。</li>
		<li>将步骤1.1.2中加热后的混合物每孔50 µl加入96孔板的各孔中，使其在1–2小时内凝固。将板子密封后置于冰箱中5 °C保存，直至使用。</li>
		<li>在已制备的96孔板各孔中接种约150个MCF-7乳腺癌细胞，使用含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与Ham’s F-12培养基混合液。</li>
		<li>在5% CO2、37 °C的培养箱中培养5–7天，使细胞球体生长至直径约200–300 µm。</li>
		<li>在5% CO2、37 °C的培养箱中，用浓度为2 µM至8 µM（溶于培养基）的蒽环类抗生素盐酸多柔比星处理细胞球体，孵育6小时。</li>
		<li>显微观察前，用培养基或Earle's平衡盐溶液（EBSS）洗涤细胞球体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验2：表达氧化还原传感器的球体中的氧化过程
	<ol>
		<li>在96孔板经琼脂糖凝胶包被的孔中（步骤1.1.1–1.1.3所述方法），接种约400个稳定转染了谷胱甘肽敏感型绿色荧光氧化还原传感器Grx1-roGFP2的U251-MG-L106胶质母细胞瘤细胞，使用含10% FCS、1%青霉素/链霉素及潮霉素B（150 µg/ml）的DMEM培养基。</li>
		<li>在5% CO2、37 °C的培养箱中培养5–7天，使球体生长至直径约200–300 µm。</li>
		<li>将10 µl过氧化氢溶液（purum p.a.，≥ 30%）加入990 µl双蒸水中，配制100 mM的储备液，并在12小时内使用。</li>
		<li>实验前，用EBSS将步骤1.2.3中的储备液稀释至50 µM。</li>
		<li>通过微流控系统在测量过程中用含50 µM过氧化氢的EBSS孵育细胞球体，以实现氧化还原传感器的氧化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验3：球体内细胞坏死的诱导与标记
	<ol>
		<li>在96孔板经琼脂糖凝胶包被的孔中（步骤1.1.1–1.1.3所述方法），接种约400个细胞（e.g., U251-MG-L106-Grx1-roGFP2胶质母细胞瘤细胞），使用含10% FCS、1%青霉素/链霉素及潮霉素B（150 mg/ml）的DMEM培养基。</li>
		<li>在5% CO2、37 °C的培养箱中培养5–7天，使球体生长至直径约200–300 µm。</li>
		<li>用浓度为1 µM的线粒体电子传递抑制剂鱼藤酮处理细胞球体3小时，以诱导细胞坏死；同时加入绿色细胞毒性染料共孵育3小时（浓度为1 µl染料加入1 ml培养基），以标记坏死细胞。</li>
		<li>显微观察前，用培养基或EBSS洗涤细胞球体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光片调整
注意：为了获得最佳效果，必须确保光片的束腰位于物镜的焦平面内。束腰位置的校准只能通过观察相对于毛细管垂直方向的光片来完成（见步骤 2.5 - 2.8）。
<ol>
	<li>使用倒置显微镜，并将SPIM激发模块（如参考文献16所述）安装至定位平台的基板上（见图1A）。</li>
	<li>在显微镜上配备10X/0.3或20X/0.5的物镜，以及检测光路中适当的长通滤光片（例如，λ ≥ 515 nm）。</li>
	<li>将积分相机安装至显微镜的检测端口。</li>
	<li>使用激发波长优选为470 nm的激光器或激光二极管产生的平行准直光束，并将其导入SPIM模块。</li>
	<li>将柱面透镜旋转90度，使光片转为垂直方向，以便对光片的束腰进行轴向调节。</li>
	<li>将含有荧光染料液体的毛细管置于样品 holder 中。</li>
	<li>将带有毛细管的样品 holder 安装至显微镜的定位平台上，并调整毛细管位置，使其居中，且光片的束腰处于焦点位置。</li>
	<li>通过调节柱面透镜自身的轴向位置来调整束腰。调节完成后将透镜转回原位。</li>
</ol>
3. 细胞球体应用与显微镜信号同步
<ol>
	<li>将细胞球状体单独或成组地置于内截面为 600 µm × 600 µm、壁厚为 120 µm 的矩形硼硅酸盐玻璃毛细管16中。以下两种细胞球状体加载方法已被证实有效。
	<ol>
		<li>用拇指和中指夹住空毛细管使其竖直，并用食指封住上端开口。将下端开口靠近液体（EBSS 或培养基）中的细胞球状体，然后松开上端的食指。毛细作用会立即将含有细胞球状体的液体吸入毛细管内。通过调整毛细管的竖直方向，利用重力调节细胞球状体在毛细管内的位置。</li>
		<li>或者，可通过移液方式将细胞球状体加入毛细管。注意移液枪头的开口一方面应足够大以容纳球状体，另一方面其尺寸应小于或等于毛细管的内径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有细胞球状体的毛细管放入显微镜专用样品 holder 中。</li>
	<li>将装有毛细管的样品 holder 固定在显微镜的定位台上，并调整细胞球状体的位置，使其居中且处于焦平面。</li>
	<li>通过调节反射镜和柱面透镜的位置（见图 1B中的调节螺钉），使照明光路中的光片与检测光路中物镜的焦平面匹配。</li>
	<li>根据样品和物镜周围介质的折射率以及物镜的数值孔径，调节微米螺钉（见图 1B），以补偿“鱼缸效应”。 
	注意：样品与物镜周围介质的折射率不同，会导致物镜移动距离与焦平面移动距离不一致。由于光片随物镜转盘移动，因此需通过杠杆臂结构（见图 1B）补偿光片移动（对应物镜移动）与焦平面移动之间的偏差。微米螺钉用于调节上下销钉之间的距离，从而根据物镜的数值孔径和介质折射率调整光片的位移量。</li>
</ol>
<img alt="光镊装置示意图，显示激光激发和显微镜组件。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. (A) 单平面照明显微模块安装在倒置显微镜定位台基板上的实物图；(B) 单平面照明显微模块与显微镜进样同步设置，用于补偿焦平面与照明平面之间的升降错位（鱼缸效应）。Δzo 表示物镜的位移，Δzf 表示焦平面和光片的位移。插图显示含毛细血管类球体的横截面。左侧：内径为 600 µm（壁厚 120 µm）的矩形毛细管；右侧：用于旋转的装置。一个内径为 400 µm、外径为 550 µm 的圆形内毛细管在外部矩形毛细管内旋转，两毛细管之间的间隙填充浸没液。
4. 动态液体环境中的测量
注意：之前的方案用于在测量前对细胞球体进行静态孵育，此时细胞球体已预先孵育，并通过简单的重力作用固定在毛细管中。无需进一步固定。然而，对于需要在流动介质中进行的测量，若希望实现动态孵育，从而构建动态环境以测定摄取动力学，则可采用本子方案。步骤 4.5–4.9 至关重要，用以避免气泡进入样品。
<ol>
	<li>用胎牛血清（FCS）填充毛细管，持续 30 分钟，以促进后续细胞球体与毛细管内壁玻璃表面的黏附。</li>
	<li>让耗尽后的毛细管中残留的 FCS 涂层至少干燥 12 小时。</li>
	<li>按照步骤 3.2 所述方法，将细胞球体引入已涂覆 FCS 的毛细管中。</li>
	<li>将毛细管置于 5% CO2 和 37 °C 的培养箱中额外孵育 2–4 小时，以促进球体细胞的黏附。</li>
	<li>搭建微流控系统的进流部分（见图 2）。使用蠕动泵将含有荧光染料、药物或试剂的培养基注入进流管路（内径：0.89 mm）中。</li>
	<li>将微流控系统的进流部分连接至气泡捕获装置（见图 2）。</li>
	<li>首先将毛细管无气泡地夹紧至进流管路，然后将毛细管的另一端夹紧至排水管路。</li>
	<li>调节水浴的液体温度至所需值（例如，37 °C）。</li>
	<li>调节蠕动泵至所需的泵速（例如，流速：9 µl/min；毛细管内泵速：25 mm/min）。</li>
	<li>将泵出的液体收集至接收容器中（开环装置），或回输至原始容器（闭环装置），或直接回输至蠕动泵的管路中（紧密闭环装置）。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞仪装置、微毛细管系统、光片照明、细胞分析示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 微流控装置（开环和紧密闭环）；插图：利用基于光片的荧光显微镜结合倒置显微镜对微毛细管内的类球体进行照明。
5. 数据采集与分析
<ol>
	<li>设置激光功率和图像采集的积分时间。</li>
	<li>注意，步骤 5.1 中设定的参数不应超过原代细胞约 50–100 J/cm2 或经荧光染料孵育或转染荧光蛋白编码质粒的细胞约 10–20 J/cm2 的光剂量值，以避免光毒性（详见参考文献 12）。</li>
	<li>将 z 轴层厚（z-stack）的步进设为 ∆z = 5–10 µm，由于光片厚度约为 10 µm，该设置有利于三维数据分析。</li>
	<li>通过在细胞球体内部改变焦平面，采集单张图像或 z 轴层厚图像序列。</li>
</ol>

<ol><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1990).</li>
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<li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027(2010).</li>
<li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li>
<li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518(2012).</li>
<li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li>
<li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li>
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<li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).</li>
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<li>Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文描述了一种优化用于三维细胞系统的光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）装置， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。三个典型应用包括：（1）细胞抑制性药物的摄取及其部分转化为降解产物（该降解产物对化疗效果的贡献仍有待评估）；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器检测添加氧化剂后的氧化还原状态；（3）抑制线粒体呼吸链后诱导并标记细胞坏死。
与现有系统相比，该SPIM模块的主要优势（例如， 与参考文献7、8、9、14、15中报道的方法相比，其优势在于可轻松适配任何倒置宽场显微镜，且样品位于小型测量腔室（微毛细管）中，进行各类实验时仅需少量荧光染料、药物制剂或药品，从而显著降低实验成本。 例如， 用于药物测试。如果采用本文报道的微流控系统，这一原则同样适用。然而需要指出的是，尽管在开环系统中，较低的流速有利于降低药物筛选的成本，但在当前实验条件下，即使流速高达1,440 µl/min（对应流速高达4,000 mm/min），类球体仍能稳定附着于毛细管内壁而不发生脱落。对于紧密的闭环系统，无论泵速如何，至少需要200–300 µl的总液...

除了已确立的方法（共聚焦或多光子激光扫描显微镜1-4、结构化照明显微镜5,6）外，光片显微技术或单平面照明显微镜（SPIM）已被证明是一种有价值的三维成像方法7,8,9。其中特别值得关注的是其在三维细胞培养中的应用，例如，多细胞肿瘤球体（MCTS），后者在药物发现研究中正被越来越多地使用10,11。此外，当需要在长期暴露或重复测量过程中保持低光照剂量以维持样本活性时，SPIM 是首选方法，因为在检测样本的每一个焦平面时，仅有该平面被光照照射。这与其他显微技术形成对比：在那些技术中，每次检测一个焦平面时整个样本都会被照亮，因此在记录多个焦平面时，累积的光照剂量可能对样本造成损伤12。
光片显微镜或SPIM基于使用柱面透镜或扫描激发激光束，从与观察路径垂直的方向对样品进行照明（综述见参考文献8）。这通常需要特殊的样品腔室。13,14 或基质， 例如， 琼脂糖7,15，可在特殊且昂贵的显微镜上实现。作为这些系统的替代方案，已开发出一种结构相对简单的SPIM照明装置，并适配于常规倒置显微镜。16 （参见 图1）。它由一束激光扩束至直径为8&#160;毫米，并通过一个柱面透镜（焦距：50）聚焦&#160;毫米，数值孔径：0.08）聚焦为厚度6–10 µm的光片，景深约为100 µm。样品置于显微物镜前方内径为600–900 µm的矩形毛细管中，用于荧光检测。目前，这些主要特征已通过采用先进的微毛细管技术进一步完善和优化，包括样品的固定与旋转、照明光片（轴向）与用于荧光检测的物镜的同步调节（由于位移的光路长度相同，需对机械进给进行校正），以及集成微流控系统以施加荧光染料、药物制剂或药品，从而显著减少所需试剂用量和成本。

<table><tbody><tr><td>微量滴定板</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>用于细胞球体培养</td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>用于细胞球体培养</td></tr><tr><td>MCF-7 细胞系</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 细胞系</td><td></td><td></td><td>细胞系</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>培养基</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>培养基</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>细胞培养添加剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>PAA Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P02-015</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>细胞培养添加剂</td></tr><tr><td>阿霉素</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>荧光染料（注意：急性毒性）</td></tr><tr><td>绿色细胞毒性染料</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox — 荧光细胞毒性染料</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>细胞抑制剂（注意：急性毒性）</td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>氧化反应试剂（注意：急性毒性）</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>VitroCom&amp;nbsp;</td><td>8260-050</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD相机</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD相机</td></tr><tr><td>AxioVision 数据采集软件</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>激光二极管</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>需与驱动器 PDL800-B 配合使用</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>已重新校准，将最低泵速降低至原来的1/10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

宽场显微镜的单平面照明模块与微毛细管方法

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

一种用于光片显微镜或单平面照明显微镜（SPIM）的模块，可轻松适配倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化， 例如， 多细胞肿瘤球体（MCTS）。该SPIM激发模块对光线进行整形和偏转，使样品被垂直于显微镜检测光路的光片照射。该系统的特点包括：采用矩形毛细管固定样品（在高级版本中还可通过微毛细管装置实现样品旋转），同步调节照明光片与用于荧光检测的物镜，以及集成微流控系统以微量施加荧光染料、药物或药剂。本文提供了该系统的操作方案，并报告了一些技术细节。代表性结果包括：（1）测定细胞抑制剂阿霉素（doxorubicin）的摄取及其部分转化为降解产物的过程；（2）通过基因编码的谷胱甘肽传感器在添加氧化剂后进行氧化还原状态检测；（3）抑制线粒体呼吸链后引发并标记细胞坏死。文中还讨论了该SPIM模块相较于现有系统的差异与优势。

实验1：细胞球体与化疗药物共孵育
先前孵育的MCF-7细胞球体的z轴层扫图像（8 µM 阿霉素，6 小时）如图所示 图3. 它提供了关于阿霉素细胞摄取和分布的详细信息17 及其降解产物18,19在类球体的外层细胞中，红色荧光的阿霉素主要定位于细胞核内，而在类球体内部区域，细胞膜中则以降解产物发出的绿色荧光为主19.
<img alt="生物组织切片荧光成像的共聚焦显微镜z轴层扫与三维重建。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig3highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 使用单平面照明...

本文描述了一种单平面 illumination 显微镜（SPIM）模块，可轻松适配于倒置宽场显微镜，并针对三维细胞培养进行了优化。样品置于矩形毛细管内，通过微流控系统可将荧光染料、药物制剂或药物以微量施加至样品。

一种用于光片或单平面照明显微镜（SPIM）的模块被描述，该模块可轻松适配于倒置宽场显微镜，并……

本实验的总体目标是利用倒置显微镜的光片激发模块进行单平面照明显微成像，并将其应用于三维细胞球体的观察。首先使用移液器将细胞球体从微孔板的一个孔转移至另一个孔中，经洗涤后进行孵育。随后将该S型细胞球体引入矩形毛细管中。第二步是将片层光照明模块安装到倒置显微镜载物台的基板上。接下来，将含有类固醇的毛细管放入显微镜专用的样品 holder 中。最后一步是调整检测光路中片层光与显微镜物镜焦平面的匹配。最终，可通过在细胞球体内部调节焦平面来进行三维荧光测量，从而获取有关药物摄取或S球体结构的单幅图像或Z轴堆叠（Z-stacks）信息。该技术相较于现有的光片显微镜主要优势在于成本低廉且高度灵活，因其由一个可适配于现有显微镜的模块构成，为研究提供了极大的自由度。该技术的应用前景涵盖用于治疗和诊断的药物及试剂的研究，尤其重要的是，微流控系统的可适配性使得在流动条件下对快速过程进行研究成为可能。现在，这种激发方法结合任何检测技术均可在低光照剂量下提供对活细胞类固醇的深入观察。该方法也可应用于其他活体系统，如斑马鱼、斑马鱼胚胎以及光学透明的 CLE 组织样本。首先，在 96 孔板的每个孔中加入 50 微升加热后的 1.5% 琼脂糖培养基，静置使其凝固一至两小时。然后，在已准备好的96孔板中，每孔接种约150个MCF-7乳腺癌细胞，在5%二氧化碳、37°C的培养箱中培养5至7天，直至细胞集落直径达到约200至300微米。接着，将细胞与浓度为2 µM至8 µM的蒽环类抗生素盐酸多柔比星在培养基中共同孵育6小时。孵育结束后，在显微镜观察前，用培养基或Earl's平衡盐溶液洗涤细胞。使用倒置显微镜，并将单平面照明显微镜（SPM）激发模块安装到定位平台的基板上。在显微镜上配备10倍或20倍放大倍数的物镜，以及在显微镜检测光路中配备适当的长通滤光片。然后将积分相机安装到显微镜的检测端口。使用激发波长优选为 470 纳米的激光器或激光二极管产生的平行准直光束，并将其照射至自旋模块。接着，将柱面透镜旋转 90 度，使光片转为垂直位置，以便对光片的束腰进行轴向调节。将含有荧光染料液体的毛细管放置于样品 holder 中。将带有毛细管的样品架安装到显微镜的定位台上。调整毛细管的位置，使其居中，并使光片的束腰处于焦点位置。通过调节柱面透镜自身的轴向位置来调整光束束腰。调节后将镜头复位。将细胞类固醇单独或分组置于内径截面为600 × 600微米、壁厚为120微米的矩形硼硅酸盐玻璃毛细管中。操作时，用拇指和中指垂直夹持空毛细管，并用食指封住其上端开口。将毛细管下端开口移至细胞球体附近，在其周围的液体中释放上端开口处含有类固醇的液体。液体将立即通过毛细作用被吸入。通过重力调节S型球体在充满液体的毛细管内的位置。或者，可通过移液将类固醇加入毛细管中。注意移液枪头开口的尺寸应一方面足够大，以容纳S类球体的大小，另一方面应小于或等于毛细管的内径。随后，将含有S类球体的毛细管放入显微镜专用的样品 holder 中。将带有毛细管的样品架安装到显微镜的定位台上，并调整细胞类固醇的位置，使其居中并聚焦。通过调节反射镜和柱面透镜的位置，使照明光路中的光片与检测光路中物镜的焦平面匹配。用胎牛血清（FCS）填充毛细管，持续30分钟，以促进后续细胞类固醇在毛细管内壁玻璃表面的黏附。在将细胞类固醇加入FCS包被的毛细管后，让毛细管中残留的FCS包被物干燥至少12小时。与之前相同，将毛细管置于培养箱中额外孵育2至4小时，以促进类固醇的细胞黏附。接下来，搭建微流控系统的flx部分，包括设置一个气泡捕获装置。使用蠕动泵将含有荧光染料药物或试剂的培养基注入流出管路的 flx 中。首先将无气泡毛细管夹紧至流出管路，然后将毛细管另一端夹紧至排水管路。调节水浴的液体温度至所需数值。然后调节蠕动泵至所需的泵速。使用开环装置将泵出的液体收集到接收容器中，用于数据采集和分析。设置激光功率和图像采集的积分时间。将ZS堆栈的步进值设置在5至10微米之间，这有利于三维数据分析。由于光片厚度约为10微米，可通过在细胞类固醇内调节焦平面来获取单张图像或Zacks的测量结果。图中显示的是一个mc七细胞类固醇在8微摩尔多柔比星中孵育6小时后进行的Zack扫描结果。这些图像详细展示了阿霉素的细胞摄取、分布及其降解情况。在类固醇外层细胞中，呈红色荧光的阿霉素主要定位于细胞核；而在类球体的内部区域，由降解产物产生的绿色荧光在细胞膜中占主导地位。通过SPM选择单层细胞，展示了化疗药物阿霉素在天然MC7人乳腺癌细胞中的摄取情况。在流动系统中加入两微摩尔的阿霉素培养基后，阿霉素及其降解产物的红色和绿色荧光持续增强。一旦掌握操作要点，从安装光片消除模块到记录三维样品的荧光图像仅需几分钟。在测量和流动条件下，最重要的是确保样品牢固贴附在毛细管内壁表面，并避免气泡进入样品区域，以免导致样品从毛细管上脱落。观看本视频后，您应该能够很好地理解光片照明显微镜，以及该多功能模块如何适配多种显微镜使用。

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单一平面照明模块和一个宽场显微镜微毛细管法

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