用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

本实验的总体目标是实现高效质粒转染视网膜细胞，从而在原代视网膜培养物中开展功能性遗传学研究。该目标通过首先在汉堡-汉密尔顿系统第27期收集鸡胚来实现。准确的分期对于获得最佳转染效率至关重要。

第二步是解剖胚胎眼球并去除视网膜色素上皮，以暴露神经视网膜。接着，将视网膜杯置于充满质粒溶液的腔室中，然后在优化条件下使用自行制备的简易电极进行电穿孔处理。

最后的步骤是去除玻璃体和晶状体，并将神经视网膜解离为单细胞，用于低密度原代培养。最终，可通过报告基因表达或免疫组织化学方法观察转染的细胞，通过检测下游基因的表达水平或细胞表型变化来评估基因操作的有效性。该技术相较于现有方法（如脂质体转染或化学转染）的主要优势在于，其可将视网膜细胞的转染效率提高五倍，达到总细胞群体的22%至25%。

该方法有助于解答感光细胞生物学领域的关键问题，因为它能够在原代视网膜培养物中高效地操控基因表达，达到可产生具有生物学意义见解的水平。该技术的意义不仅限于基础研究，还可轻松适应高通量技术，用于药物开发。首先将受精的白来航鸡鸡蛋置于蛋类孵化箱中，在37.5摄氏度和60%相对湿度条件下孵育五天。

实验前，取一个通常用于微电极拉制的方框状细丝。用镊子拆开方框，将细丝拉直成一条长条。然后以尺子为引导，将细丝弯折成一个方形U形，底边长3毫米，一侧高2毫米，另一侧为细丝剩余长度。用镊子夹住电极，将其浸入96%乙醇中，随后短暂灼烧电极以达到消毒目的。

然后，将带有小型鳄鱼夹的电极导线连接到电极的长臂上。接着，用70%乙醇擦拭并清洁带有粗大金质尖端的电极。随后，使用灭菌剪刀剪去无菌1.5毫升微量离心管的管盖，将其切口朝下平整地固定在100毫米的培养皿上，制备电穿孔腔室。

接下来，将显微解剖工具的尖端浸入96%乙醇中，然后短暂灼烧，以进行灭菌。同时，使用70%乙醇擦拭解剖显微镜以清洁。将一瓶无钙无镁的Hanks平衡盐溶液置于37°C水浴中预热。

待其变暖后，用它将一个100毫米的无菌培养皿填充至四分之三满。接着将电穿孔室置于洁净的解剖显微镜下。然后将电极连接至电穿孔仪，确保自制电极连接至仪器的负极，而金尖电极连接至正极。

用70%乙醇擦拭卵壳外部以清洁卵。在整个后续操作过程中需保持谨慎并维持无菌状态。为避免使用大型弯曲的马洛尼镊子时将污染带入培养物中，应小心操作：将卵的圆端直接对准气室上方，轻轻敲击以在卵壳上开一个小孔。

用另一把镊子取出所有的卵壳碎片。去除膜结构，并通过小心地将胚胎从卵中舀出进行收集。将胚胎放入含有预热的无钙无镁Hanks平衡盐溶液的培养皿中。

当收集到足够数量的胚胎后，需确保所有胚胎均处于正确的发育阶段。根据哈姆布格尔-汉密尔顿（Hamburger-Hamilton）分期系统，为达到最佳实验效果，胚胎应处于第27期。使用马洛尼镊子通过断头法处死胚胎，随后用杜蒙镊子小心摘除眼球并去核。

将眼球转移至一个新的培养皿中，皿内含有无钙无镁的HBSS。从每个眼球靠近视神经乳头的后部开始，将一对 Dumont 镊子的两个尖端插入神经视网膜与视网膜色素上皮层之间。从眼球后部向前部操作，使用镊子小心剥离并移除视网膜色素上皮层。

注意避免损伤神经视网膜。设置电穿孔仪以输出五个15伏特的方波脉冲，每个脉冲持续50毫秒，间隔950毫秒。接着，向电穿孔腔内加入120微升质粒溶液，其浓度为1.5微克/微升，溶于PBS中。

然后将U形负极电极放入微型离心管盖电穿孔室中。使用一对弯头杜蒙镊子，将一个视杯转移至电穿孔室，并将其置于U形电极内。

将视网膜放置，使其后部朝向电极的底部，晶状体朝上。接着，将阳极置于紧邻晶状体的眼球前部位置。然后使用电刺激仪的脚踏开关输送五次电脉冲。

完成电穿孔后，将电穿孔处理的视杯转移至一个新的含有无钙、无镁 HBSS 的培养皿中。对每个额外的视杯重复电穿孔操作。同一质粒溶液最多可用于六个体视杯的电穿孔，而不会显著降低转染效率。

接下来，使用带齿镊子轻轻去除每个电穿孔样品的晶状体和玻璃体，同时用弯头杜蒙镊子的背面固定眼球。一旦去除完毕，即采用标准技术对电穿孔的视网膜细胞进行分离和培养。此处显示的视网膜细胞已通过表达GFP的质粒进行电穿孔处理，并经过分离后培养四天。荧光显微图像显示了DAPI染色的细胞核以及表达GFP的视网膜细胞。

采用抗视蛋白抗体染色以鉴定感光细胞。本方案中所述参数已优化，与四天后总体细胞群相比，平均转染效率可达22%。在培养过程中，若仅考虑感光细胞群，该效率可进一步提升至平均25%。此效率在技术熟练后可达到。

如果操作得当，从胚胎收集到电转染的整个过程在六只眼的情况下可在30分钟内完成。在进行该操作时，需注意胚胎收集后至细胞解离与接种之间的时间间隔不应超过三小时，以获得高质量的细胞培养。该技术可用于基因过表达或基因沉默研究，例如利用RNAi系统。

此外，通过该程序转染的视网膜可用于视网膜器官型培养。