Name: 在小鸡视网膜有效的基因转移的原代细胞培养研究：前OVO电穿孔法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解利用离体电穿孔技术在小鸡胚胎视网膜原代细胞培养中实现高效基因转移的方法。该技术可显著提高转染效率，为研究光感受器生物学和视网膜细胞功能遗传学提供重要工具。

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我们感谢 David O'Brien 在数据分析方面提供的支持，以及 Canto-Soler 实验室全体成员的宝贵讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 EY004859 和 EY022631（MVCS）、核心基金 EY1765，以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, Inc.）提供的无限制部门资助的支持。

本研究中描述的所有操作均按照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会推荐的指南进行。
1. 提前准备：仪器、试剂和培养皿的准备
<ol>
	<li>卵的准备：将受精的白来航鸡卵置于37.5 °C、相对湿度60%的条件下，在卵孵化箱中孵育5天。 
	注意：使用具有摇动功能的孵化箱可能有助于标准化和同步胚胎发育，但摇动对于本实验方案的结果并非必需。</li>
	<li>质粒准备：
	<ol>
		<li>根据需要设计用于基因过表达或下调的质粒构建体（例如通过RNAi技术1,34）。在构建体中尽可能包含报告基因（如EGFP、RFP或LacZ）。 
		注意：某些常用启动子（如CMV）可能随时间发生沉默。CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子）是一种极佳的替代选择，可实现目的基因的高效长期表达35-37。</li>
		<li>将质粒溶解于无菌PBS中，配制成浓度为1.5 µg/µl的溶液。可选：&#160;可提前配制质粒溶液并冻存，待使用时取出。 &#160; 
		注意：提高质粒浓度并不会显著提升转染效率，而降低质粒浓度则会降低转染效率1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极制备：
	<ol>
		<li>阳极使用带粗金尖的电极（参见特定材料/设备表）。用70%乙醇擦拭清洁。 
		注意：建议对金尖电极进行绝缘处理，仅暴露约0.5 mm，以尽量减少电流泄漏。绝缘材料信息见特定材料表。</li>
		<li>用2.5 mm见方的盒式灯丝（通常用于微电极拉制仪）、宽4.5 mm制作阴极。借助镊子将方盒展开并拉直成一条长丝。然后在解剖显微镜下，以直尺为引导，将灯丝弯成一个“U”形，底部长3 mm，一侧高2 mm，另一侧为灯丝剩余长度（图1，C - D）。用镊子夹住电极，浸入96%乙醇中，火焰灭菌。然后用小鳄鱼夹将导线连接至电极较长的一臂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔腔室的搭建：
	<ol>
		<li>通过剪下无菌1.5 ml微量离心管的管盖，并将其平整面朝下用胶带固定于100 mm培养皿上，制备电穿孔腔室（图1E）。 
		注意：其他形式的、大小相似的孔状容器也可使用；但微量离心管管盖易于获取且可高压灭菌。腔室必须足够大以容纳鸡眼和阴极电极，但不宜过大，以免浪费质粒溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ex&#160;ovo 电穿孔操作步骤
<ol>
	<li>仪器准备：
	<ol>
		<li>将显微解剖工具（2 把用于打开蛋壳和挖出胚胎的大弯 Moloney 镊子，2 把用于去除视网膜色素上皮（RPE）的细尖弯 Dumont 镊子，1 把用于去除晶状体和玻璃体的 Bonn 有齿镊子）的尖端浸入 96% 乙醇中消毒，然后进行火焰灼烧灭菌。使用浸有 70% 乙醇的擦拭巾清洁解剖显微镜。将一瓶无钙镁 Hank's 平衡盐溶液（CMF-HBSS）置于 37 °C 水浴中预热。用预热的 CMF-HBSS 将 100 mm 无菌培养皿填充至 3/4 满。</li>
		<li>将电穿孔腔置于另一台洁净的解剖显微镜下，并加入 120 µl 质粒溶液。将电极连接至电穿孔仪，确保自制电极连接负极，金尖电极连接正极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎收集：
	<ol>
		<li>用浸有 70% 乙醇的擦拭巾擦拭蛋壳表面以清洁鸡蛋。在后续操作中始终保持无菌操作，避免将污染物带入培养体系。使用大弯 Moloney 镊子轻轻敲击蛋的圆端（气室上方），在蛋壳上小心开孔，然后夹住并移除蛋壳碎片。</li>
		<li>用另一把镊子去除膜结构，并小心地将胚胎挖出（注意不要损伤胚胎），放入盛有 CMF-HBSS 的培养皿中。 
		注意：根据 2.4.4 步骤中指定的数量，收集足够数量的视杯用于电穿孔。</li>
		<li>关键步骤：根据 Hamburger 和 Hamilton38 标准对胚胎进行分期。 
		注意：为获得最佳效率，胚胎应处于第 27 期（图 2A）。</li>
		<li>使用 Moloney 镊子通过断头法处死胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取视杯：
	<ol>
		<li>使用细尖 Dumont 镊子小心摘除眼球，并转移至新的 CMF-HBSS 培养皿中。</li>
		<li>从每只眼球的后部（靠近视神经头处）开始，使用两把细尖 Dumont 镊子，将每把镊子的一个尖端插入神经视网膜与 RPE 之间，小心剥离 RPE，注意不要损伤神经视网膜（图 2B）。 
		注意：溶液中缺乏 Ca2+ 和 Mg2+ 有助于 RPE 更容易与神经视网膜分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔：
	<ol>
		<li>设置电穿孔仪参数，输出 5 次方波脉冲，每次 15 伏特，持续 50 毫秒，间隔 950 毫秒。将“U”形负极电极放入电穿孔腔（装有 120 µl 含质粒溶液的微量离心管盖）中。</li>
		<li>使用弯头 Dumont 镊子将一个视杯转移至电穿孔腔（通过舀取方式，不要按压），将其置于“U”形电极内，使视网膜后部朝向电极底部，晶状体朝上（图 2D）。</li>
		<li>将阳极放置在眼球前部、靠近晶状体的位置，并使用电穿孔仪脚踏开关施加电脉冲。</li>
		<li>将完成电穿孔的视杯转移至盛有 CMF-HBSS 的新培养皿中，并对剩余的每个视杯重复电穿孔操作。 
		注意：使用同一份质粒溶液最多可对 6 个视杯进行电穿孔，而转染效率无明显下降。</li>
		<li>用 Bonn 有齿镊子夹住每个电穿孔后视杯的&#160;晶状体&#160;和玻璃体，同时用弯头 Dumont 镊子背面固定眼球，轻轻通过瞳孔开口将其拉出。</li>
		<li>按照标准流程进行电穿孔后视网膜细胞的解离与培养。 
		注意：有关鸡胚视网膜细胞解离与培养的详细方案，请参见 Vergara 和 Canto-Soler, 2012, 补充文件 421。在本方案中，细胞以低密度接种于多聚鸟氨酸包被的 6 孔板或 35 mm 培养皿中（每 35 mm 直径孔或皿接种 6 × 105 个细胞）。培养基为含青霉素/谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FCS）和 100 µg/ml 亚油酸-BSA 的 Medium 199。培养物置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中维持。采用此方法，通常每个第 27 期电穿孔眼球可获得 5–6 × 106 个细胞。 
		注意：理想情况下，从胚胎收集到细胞接种之间的时间不应超过 3 小时&#160;，以确保良好的细胞存活率并最小化应激反应。通常在培养 4 天后进行观察和进一步分析，因为此时细胞已实现良好的形态学和分子水平分化，且存活率仍然较高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells%3A+a+novel%2C+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li>
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<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。

该实验方案成功最关键的一步是选择合适发育阶段的胚胎。在以往的文献中，此类培养所用的胚胎发育阶段通常以孵化天数或胚胎天数（ED）来界定，因此通常认为使用ED 5至ED 6的胚胎可获得相当的结果。然而我们发现，在27期（ED 5）时，转染效率约为总细胞群体的22%，如上所述；若使用28期胚胎（ED 5.5），效率则下降至16%；在29期时（ED 6）进一步降至12%1。其他关键步骤包括在整个过程中维持无菌条件；掌握必要的手工操作技巧，以避免在解剖和电穿孔过程中损伤视网膜；以及避免从胚胎采集到细胞铺板之间出现过长时间间隔。
为确保较高的转染效率，另一个重要的考虑因素是含有质粒的溶液浓度：推荐的1.5 µg/µl是我们测试中不会导致效率下降的最低浓度。考虑到视杯是浸泡在该溶液中的，这一浓度意味着需要使用较大量的质粒材料。使用能够容纳眼球的最小规格容器（例如微量离心管管盖）可减轻这一问题。此外，多个眼球可使用同一份溶液进行电穿孔；我们发现，在同一份质粒溶液中连续对多达6个视杯进行电穿孔时，转染效率并未下降，可能还可处理更多样本，但此后效率的变化尚无法确认。
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利用鸡胚视网膜的离体细胞培养已被广泛用于研究感光细胞生物学的多个方面，包括其存活2-9、分化10-12、神经突生长13等。该培养体系由 Ruben Adler 及其合作者于20世纪80年代建立，并由其团队及其他研究组进一步优化14-20，其优势源于鸡作为动物模型的内在特性21。鸡眼即使在胚胎期也具有较大的体积，可为培养提供充足的组织材料。此外，当使用胚胎第5至6天（ED 5 - 6）的视网膜进行培养时，其祖细胞中有55 - 80%会分化为感光细胞14,15,18,22,23；而该动物视网膜中约86%的感光细胞为视锥细胞24，因此这类培养体系特别适用于针对视锥细胞的研究。
我们近期开发并表征了一种简单的方法，可实现这些培养物中细胞的高效质粒转染，从而通过促进基因错表达研究，拓宽了该体系的应用范围1。该技术的开发源于科学文献中缺乏能够提供可接受转染效率、以用于在细胞自主性层面研究基因功能的方法。部分原因在于原代神经元培养物 notoriously 难以转染25,26。此前可用于此目的的一些最常用技术包括化学转染方法，如脂质体转染或磷酸钙介导转染，其转染效率仅为3–5%左右，且可能产生显著的细胞毒性27–32。尽管使用带有酶报告系统的质粒可通过信号放大来克服转染效率低的问题，但这类方法无法区分细胞特异性的效应，其结果基于少数细胞群体，可能无法代表整体情况。另一种在鸡胚中广泛使用的方法——RCAS病毒感染——仅适用于增殖细胞，因此不适用于本原代视网膜培养体系33。
在本实验方案中，于第27发育阶段（胚胎第5天，ED 5）摘除鸡胚眼球，去除视网膜色素上皮（RPE），将视网膜杯状结构置于含有质粒溶液的电穿孔 chamber 中，使用自制电极进行电穿孔处理，随后采用标准技术进行视网膜细胞的解离与培养21。经过对该流程的优化，我们能够持续获得约22%的总体细胞转染效率，光感受器细胞群体中的转染效率可达25%，同时不影响细胞培养物的存活与分化特性1。本文提供了该操作的详细步骤，以确保该技术的成功实施与可重复性。

<table><tbody><tr><td>ECM 830 电穿孔仪</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode，L形，5 mm金尖电极</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 型号 512</td><td>用作阳极的金尖电极</td></tr><tr><td>聚酰亚胺管</td><td>Vention Medical</td><td>定制</td><td>内径：0.5 mm；壁厚：0.15 - 0.2 mm。用于绝缘金尖电极</td></tr><tr><td>2.5 mm方形盒丝，4.5 mm宽</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>用于制作阴极电极</td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁，无酚红</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>带齿；轻微弯曲；4.5&quot; 长度</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>型号 #5，45度角；0.10 × 0.06 mm 尖端尺寸；109 mm 长度</td></tr><tr><td>Bonn 显微镊，1×2 齿</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>打结平台；1×2 齿，0.12 mm 齿长；3.75&quot; 长度；0.3 mm 尖端宽度</td></tr></tbody></table>

用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

源自鸡胚视网膜的富集视锥光感受器的培养体系已成为全球研究视网膜神经元（尤其是光感受器）生物学的研究人员不可或缺的工具。该系统的应用不仅限于基础研究，还可轻松适应高通量技术，用于药物开发。然而，在这些培养体系中对视网膜光感受器进行遗传操作一直极具挑战性，这严重限制了该系统的应用价值。我们近期开发并验证了一种ex&#160;ovo质粒电穿孔技术，与目前其他可用方案相比，该技术可将此类培养中视网膜细胞的转染效率提高五倍1。该方法在鸡胚发育第27期摘除眼球，去除视网膜色素上皮（RPE），将视网膜杯置于含有质粒的溶液中，并使用简易自制电极进行电穿孔。随后将视网膜组织解离并按标准流程进行培养。该技术可用于基因过表达研究，也可用于基因表达的下调，例如通过质粒介导的RNA干扰（RNAi）技术，通常可在25%的光感受器细胞群体中实现转基因表达。本出版物采用视频形式，将使该技术更易于被相关领域研究人员获取，从而推动在原代视网膜培养体系中开展基因功能研究。我们还对本实验流程中关键步骤进行了详细说明，以确保实验成功及结果可重复。

本文介绍了一种将质粒转染至去核鸡视网膜杯中，随后进行解离细胞培养的简单方案。转染通过电穿孔实现，使用易于自制的定制电极（图1 - 2）。本方案所述参数已优化，可实现20%至27%之间的转染效率（平均为22%）（图3D）。请注意，由于上述原因，这些结果是在培养4天后进行定量的。在此背景下，转染效率是指在总细胞群体中表达外源基因的细胞所占的百分比。若仅考虑感光细胞群体，转染效率可提高至平均25%（图3D）。这一特性非常重要，因为此类培养体系主要用于感光细胞的研究。
使用该技术进行电穿孔的细胞培养物在微分干涉差（DIC）照明下的形态、细胞存活特性以及分子标志物（如视宁蛋白（光感受器的常用标志物）和Pax61）的表达方面，与其未经电穿孔的对照组细胞无法区分。
<img alt="微电极制备、组装方法；显微镜、精密焊接设备。" src="/...

鸡胚视网膜细胞培养是研究光感受器生物学的重要工具。我们开发了一种基于高效基因转导技术的方法 ex&#160;ovo 在培养前对视网膜进行质粒电穿孔转染。该技术显著提高了现有方案的转染效率，使该系统的遗传操作成为可能。

从鸡胚视网膜获得的富含视锥光感受器的培养物已成为全球研究...的科研人员不可或缺的工具

本实验的总体目标是实现高效质粒转染视网膜细胞，从而在原代视网膜培养物中开展功能性遗传学研究。该目标通过首先在汉堡-汉密尔顿系统第27期收集鸡胚来实现。准确的分期对于获得最佳转染效率至关重要。第二步是解剖胚胎眼球并去除视网膜色素上皮，以暴露神经视网膜。接着，将视网膜杯置于充满质粒溶液的腔室中，然后在优化条件下使用自行制备的简易电极进行电穿孔处理。最后的步骤是去除玻璃体和晶状体，并将神经视网膜解离为单细胞，用于低密度原代培养。最终，可通过报告基因表达或免疫组织化学方法观察转染的细胞，通过检测下游基因的表达水平或细胞表型变化来评估基因操作的有效性。该技术相较于现有方法（如脂质体转染或化学转染）的主要优势在于，其可将视网膜细胞的转染效率提高五倍，达到总细胞群体的22%至25%。该方法有助于解答感光细胞生物学领域的关键问题，因为它能够在原代视网膜培养物中高效地操控基因表达，达到可产生具有生物学意义见解的水平。该技术的意义不仅限于基础研究，还可轻松适应高通量技术，用于药物开发。首先将受精的白来航鸡鸡蛋置于蛋类孵化箱中，在37.5摄氏度和60%相对湿度条件下孵育五天。实验前，取一个通常用于微电极拉制的方框状细丝。用镊子拆开方框，将细丝拉直成一条长条。然后以尺子为引导，将细丝弯折成一个方形U形，底边长3毫米，一侧高2毫米，另一侧为细丝剩余长度。用镊子夹住电极，将其浸入96%乙醇中，随后短暂灼烧电极以达到消毒目的。然后，将带有小型鳄鱼夹的电极导线连接到电极的长臂上。接着，用70%乙醇擦拭并清洁带有粗大金质尖端的电极。随后，使用灭菌剪刀剪去无菌1.5毫升微量离心管的管盖，将其切口朝下平整地固定在100毫米的培养皿上，制备电穿孔腔室。接下来，将显微解剖工具的尖端浸入96%乙醇中，然后短暂灼烧，以进行灭菌。同时，使用70%乙醇擦拭解剖显微镜以清洁。将一瓶无钙无镁的Hanks平衡盐溶液置于37°C水浴中预热。待其变暖后，用它将一个100毫米的无菌培养皿填充至四分之三满。接着将电穿孔室置于洁净的解剖显微镜下。然后将电极连接至电穿孔仪，确保自制电极连接至仪器的负极，而金尖电极连接至正极。用70%乙醇擦拭卵壳外部以清洁卵。在整个后续操作过程中需保持谨慎并维持无菌状态。为避免使用大型弯曲的马洛尼镊子时将污染带入培养物中，应小心操作：将卵的圆端直接对准气室上方，轻轻敲击以在卵壳上开一个小孔。用另一把镊子取出所有的卵壳碎片。去除膜结构，并通过小心地将胚胎从卵中舀出进行收集。将胚胎放入含有预热的无钙无镁Hanks平衡盐溶液的培养皿中。当收集到足够数量的胚胎后，需确保所有胚胎均处于正确的发育阶段。根据哈姆布格尔-汉密尔顿（Hamburger-Hamilton）分期系统，为达到最佳实验效果，胚胎应处于第27期。使用马洛尼镊子通过断头法处死胚胎，随后用杜蒙镊子小心摘除眼球并去核。将眼球转移至一个新的培养皿中，皿内含有无钙无镁的HBSS。从每个眼球靠近视神经乳头的后部开始，将一对 Dumont 镊子的两个尖端插入神经视网膜与视网膜色素上皮层之间。从眼球后部向前部操作，使用镊子小心剥离并移除视网膜色素上皮层。注意避免损伤神经视网膜。设置电穿孔仪以输出五个15伏特的方波脉冲，每个脉冲持续50毫秒，间隔950毫秒。接着，向电穿孔腔内加入120微升质粒溶液，其浓度为1.5微克/微升，溶于PBS中。然后将U形负极电极放入微型离心管盖电穿孔室中。使用一对弯头杜蒙镊子，将一个视杯转移至电穿孔室，并将其置于U形电极内。将视网膜放置，使其后部朝向电极的底部，晶状体朝上。接着，将阳极置于紧邻晶状体的眼球前部位置。然后使用电刺激仪的脚踏开关输送五次电脉冲。完成电穿孔后，将电穿孔处理的视杯转移至一个新的含有无钙、无镁 HBSS 的培养皿中。对每个额外的视杯重复电穿孔操作。同一质粒溶液最多可用于六个体视杯的电穿孔，而不会显著降低转染效率。接下来，使用带齿镊子轻轻去除每个电穿孔样品的晶状体和玻璃体，同时用弯头杜蒙镊子的背面固定眼球。一旦去除完毕，即采用标准技术对电穿孔的视网膜细胞进行分离和培养。此处显示的视网膜细胞已通过表达GFP的质粒进行电穿孔处理，并经过分离后培养四天。荧光显微图像显示了DAPI染色的细胞核以及表达GFP的视网膜细胞。采用抗视蛋白抗体染色以鉴定感光细胞。本方案中所述参数已优化，与四天后总体细胞群相比，平均转染效率可达22%。在培养过程中，若仅考虑感光细胞群，该效率可进一步提升至平均25%。此效率在技术熟练后可达到。如果操作得当，从胚胎收集到电转染的整个过程在六只眼的情况下可在30分钟内完成。在进行该操作时，需注意胚胎收集后至细胞解离与接种之间的时间间隔不应超过三小时，以获得高质量的细胞培养。该技术可用于基因过表达或基因沉默研究，例如利用RNAi系统。此外，通过该程序转染的视网膜可用于视网膜器官型培养。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在小鸡视网膜有效的基因转移的原代细胞培养研究：前OVO电穿孔法

本文介绍了通过胎内（in utero）和离体（ex...

in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

使用细尖微量移液器，我们将质粒DNA注射到鸡胚体节或神经管的亚区域中。通过调整质粒浓度以获得单个转染细胞。随后，我们让这些细胞发育形成克隆群体。...

鸡胚中的单细胞转染

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in...

在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

一种针对孵化后期（晚于汉伯格和汉密尔顿分期（HH）22期）鸡胚的基因转移方法被描述。该方法克服了传统方法的若干缺点。 在卵内...

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚 体外孵化 电穿孔

本实验方案描述了一种从鸡胚中分离、实验性操作及培养完整视网膜外植体的方法。当需要高成功率、高效性和可重复性以检测用于电穿孔和/或试剂物质的质粒效果时，此类外植体培养具有重要应用价值。 即，...

鸡胚全视网膜外植体用于电穿孔及化学试剂处理

我们介绍了通过电穿孔对切向迁移细胞进行荧光标记的方法，以及在平铺培养物中对标记细胞的运动进行延时成像的方法，以可视化观察发育中鸡胚视顶盖中迁移细胞的行为。...

可视化鸡胚视顶盖发育过程中的切向细胞迁移

我们开发了一种新的功能缺失研究方法，该方法通过利用人工微小RNA序列的导入及其在鸡胚基因组中的整合来实现 在卵内...

利用 Tol2 转座子介导的 人工 microRNA 转基因表达在鸡胚视网膜中进行功能缺失研究

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

了解利用离体电穿孔技术在小鸡胚胎视网膜原代细胞培养中实现高效基因转移的方法。该技术可显著提高转染效率，为研究光感受器生物学和视网膜细胞功能遗传学提供重要工具。

用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种体外培养电穿孔法

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