利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

以下实验的总体目标是从少量外周血中生成无整合的诱导性多能干细胞。该目标通过在特定生长因子条件下培养分离的外周血单个核细胞，获得对重编程高度敏感的红系祖细胞群体来实现。第二步，通过核转染将携带重编程基因的非整合型附加体质粒导入成红细胞，以启动重编程过程。

接下来，将转染后的细胞接种到一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，以支持其持续重编程并最终成功。重编程获得的诱导性多能干细胞克隆可根据其形态学特征、碱性磷酸酶活性、多能性标志物的免疫化学染色阳性结果以及内源性多能性基因的表达情况进行鉴定。与现有的病毒介导重编程等方法相比，该技术的主要优势在于本方案能够稳定地生成无整合的诱导性多能干细胞。今天将由 Jesse、我本人以及 Gretchen Johnson 演示该实验流程。

实验人员在实验室中首先将外周血以1:1的比例用DPBS稀释。然后，在一个15毫升的圆底聚苯乙烯试管中，小心地将7毫升稀释后的血液叠加到3毫升室温的Ficoll-Paque上。在400 ×g和室温条件下离心分离30分钟后，PBMC将沉降在血浆与Ficoll-Paque之间的乳白色界面层中。

使用无菌移液管将外周血单个核细胞（P BMCs）转移至一个15毫升锥形管中，并用新鲜的DPBS补足体积至10毫升。细胞计数后，将两份各10的6次方个P BMCs转移至一个新的15毫升锥形管中，其余细胞离心沉淀，将沉淀细胞以每毫升含两乘以10的6次方个外周血单个核细胞（pbmc）的浓度，悬浮于含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜的冻存液中并冻存。随后，对之前保留的P BMCs进行离心沉淀，将沉淀物重悬于2毫升新鲜配制的扩增培养基中，接种至12孔组织培养板的一个孔内，在37摄氏度、湿度饱和的培养箱中孵育，培养箱气体环境为5%氧气、5%二氧化碳和90%氮气。

然后在第3天和第6天，通过收集孔中的细胞更换培养基。用2 mL QBSF 60洗涤孔，以收集残留的细胞，经离心沉淀细胞后，将沉淀重悬于2 mL新鲜扩增培养基中。随后将细胞返回至同一12孔板，继续培养。在第9天，按照表格中所述，将重编程质粒用移液器加入无菌的1.5 mL离心管中。

接下来，将核转染溶液与制造商提供的添加剂混合，并将混合液转移至无菌的1.5毫升离心管中。然后，将2毫升扩增培养基加入一个新的12孔板的其中一个孔中，并在37°C湿化培养箱中平衡培养基，直至细胞准备就绪。收集细胞，按前述方法洗涤细胞培养孔，并用5毫升DPBS洗涤细胞。

然后，将细胞沉淀重悬于 100 µL 核转染溶液（含补充剂）中，注意避免产生气泡，并将细胞悬液转移至含有重编程质粒的离心管中。用移液器轻柔吹打上下混匀一次，将全部溶液转移至核转染杯底部。随后，将转染杯放入核转染仪中，运行程序 T 0 1 9。

现在向核转染小管中加入 100 µL 已平衡的扩增培养基，并立即收集全部样品，避免吸取任何白色漂浮的死细胞碎片，将其接种至预温培养基的孔中。然后在第 10 天或第 11 天将细胞重新放回湿润培养箱中。用 1 mL 含 0.1% 明胶的 HBSS 将六孔组织培养板的每孔包被，然后将板置于湿润培养箱中孵育至少 5 分钟。在孵育期间，将一管解冻的、经两次 3000 厘拉德辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）转移至 10 mL 预温的甲基纤维素培养基中，随后离心细胞，同时让细胞沉淀下来。

吸出六孔板中的明胶溶液，然后将细胞用 12 毫升新鲜的 Meth 培养基重悬。立即将 2 毫升 OFMs 分装至经明胶包被的六孔板各孔中，并将该板放回加湿培养箱中，继续培养至第 12 天。

第12天，将孔中的核受影响细胞收集至一个15毫升锥形管中，并按演示方法洗涤孔板以收集残留的细胞。离心沉淀细胞后，将细胞沉淀重悬于12毫升新鲜配制的重编程培养基中，并将2毫升细胞悬液分装至每孔饲养细胞中。在六孔板中，随后以75 ×g在室温下离心30分钟，然后将板放回湿润培养箱中，每隔一天更换一次培养基，持续一到两周。

一旦诱导性多能干细胞克隆出现，应在核转染后三天并接种前，开始用新配制的含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的人类胚胎干细胞培养基喂养细胞，将核转染后的细胞接种到可诱导的饲养层上。成功的核转染效率应通过荧光显微镜进行评估；例如，EGFP的表达情况如图所示，典型的核转染实验中，约有总细胞群体的5%至10%表达EGFP。重编程后的诱导性多能干细胞克隆通常在核转染后约两周开始出现。这些克隆通常呈圆形，边界清晰，可根据其典型的人类胚胎干细胞形态特征进行识别，包括细胞小、排列紧密、核质比高以及可见的核仁，这些均为已完全鉴定的代表性细胞系的特征。

所有测试均显示碱性磷酸酶活性阳性，表达标准的多能性标志物，并可重新激活内源性多能性基因。一旦掌握，该技术可在四周内稳定生成无整合的诱导多能干细胞（iPSC），前提是操作正确。在此基础上，可进一步开展分化研究，以探讨任何组织类型的相关科学问题。