Name: 从血液高效的iPS细胞生成使用附加体和HDAC抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用附加体载体和组蛋白去乙酰化酶抑制剂从外周血高效生成无整合诱导多能干细胞的方法。该技术通过核转染将重编程基因导入红细胞前体细胞，避免病毒载体带来的插入突变风险，适用于再生医学研究。

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作者希望感谢以下机构对本研究提供的资助：美国国立卫生研究院（NIH）提供的资助项目编号 K08DK082783（AR）、P30DK56465（BTS）、U01HL099993（BTS）、T32HL00715036（SKS）和 K12HL0806406（SKS）；以及 JP McCarthy 基金会（AR）。

由Fred Hutchinson癌症研究中心和儿童医院机构审查委员会批准的书面知情同意书&#34;费城儿童医院的患者在采集外周血样本前均获得了知情同意。所有实验均遵守机构指南。包括小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）制备和畸胎瘤形成在内的所有动物实验均经机构动物护理与使用委员会批准。
1. 使用Ficoll分离PBMCs并扩增成红细胞——第0天
<ol>
	<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将外周血按1:1比例稀释。在15 ml圆底聚苯乙烯管中，小心地将7 ml稀释后的血液叠加于3 ml室温的Ficoll-Hypaque液面上。</li>
	<li>以400 × g离心30分钟。</li>
	<li>单个核细胞（PBMCs）将沉降至血浆与Ficoll-Hypaque之间的界面处，表现为一层浑浊的白色层。使用无菌移液管收集PBMCs至一个15 ml锥形管中，并用DPBS定容至10 ml。</li>
	<li>使用血细胞计数板对PBMCs进行计数。</li>
	<li>将2 × 106个PBMCs移入另一个15 ml锥形管中，以300 × g离心5分钟。将剩余细胞离心后，以2 × 106 PBMCs/ml的浓度悬浮于90%胎牛血清（FBS）/10%二甲基亚砜（DMSO）中并冻存。</li>
	<li>配制扩增培养基：QBSF-60无血清培养基（避光保存）+ 青霉素/链霉素（1%）+ 抗坏血酸（50 ng/ml）+ 干细胞因子（SCF，50 ng/ml）+ 白细胞介素3（IL-3，10 ng/ml）+ 促红细胞生成素（EPO，2 U/ml）+ 胰岛素样生长因子1（IGF-1，40 ng/ml）+ 地塞米松（1 μM；避光保存；每次更换培养基时使用新解冻的分装）。</li>
	<li>将2 × 106个PBMCs重悬于2 ml新鲜配制的扩增培养基中，加入12孔组织培养板的一个孔内，置于37 °C、湿度饱和、含5% O2、5% CO2和90% N2的培养箱中孵育。</li>
	<li>第3天和第6天更换培养基。
	<ol>
		<li>收集细胞，并用2 ml QBSF-60洗涤孔壁，以回收残留细胞。</li>
		<li>将细胞悬液以300 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于2 ml新鲜扩增培养基中，放回原12孔板的同一孔中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过核转染重编程细胞 – 第9天
<ol>
	<li>用移液器将重编程质粒加入无菌的 1.5 ml 离心管中（表 1）。</li>
	<li>将核转染溶液与补充剂（厂家提供）混合，用移液器转移至无菌的 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>将 2 ml 扩增培养基加入 12 孔板的一个孔中，并置于加湿的 37 °C 培养箱（5% O2、5% CO2 和 90% N2）中预平衡，以备后续加细胞。</li>
	<li>收集培养的细胞，并用 2 ml QBSF-60 冲洗孔板以收集残留细胞。</li>
	<li>在 300 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用 5 ml DPBS 重悬细胞，于 300 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞。</li>
	<li>吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 100 μl 核转染溶液加补充剂中，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将细胞悬液用移液器转移至含有重编程质粒的离心管中，轻轻吹打一次，再将样品移入核转染杯底部。</li>
	<li>将核转染杯放入核转染仪中，运行程序 T-019。</li>
	<li>将 100 μl 预热的扩增培养基（来自步骤 2.3 中的平衡板）转移至核转染杯中。</li>
	<li>立即收集全部样品，并加入预热的扩增培养基孔中。避免收集白色漂浮的死细胞碎片。</li>
	<li>将培养板置于加湿的 37 °C 培养箱（5% O2、5% CO2 和 90% N2）中进行培养。</li>
</ol>
3. 铺板饲养细胞——第10或11天
<ol>
	<li>第10天，接种饲养细胞。
	<ol>
		<li>用明胶包被一块6孔组织培养板。
		<ol>
			<li>将1 m&#160;含有0.1%明胶的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）加入该培养板的每孔中。</li>
			<li>将培养板置于湿润的37 °C培养箱中，孵育至少5分钟。</li>
			<li>使用前立即吸除培养板中的明胶溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将一管经3,000 cGy辐照处理的含2 × 106个鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的冻存细胞解冻，加入10 ml预热的MEF培养基（DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）+ 10%胎牛血清 + 1%青霉素/链霉素）中。</li>
		<li>以300 × g离心5分钟，吸除上清液。将细胞重悬于12 ml MEF培养基中，每孔加入2 ml至明胶包被的6孔板中。将培养板置于湿润的37 °C培养箱（5% O2、5% CO2和90% N2）中，培养至第12天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在饲养细胞上接种细胞并更换培养基——第12天
<ol>
	<li>将电转染后的细胞收集至一个15 ml锥形管中，并用2 ml QBSF-60冲洗孔内残留细胞。在300 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>配制重编程培养基：Iscove改良的DMEM培养基（IMDM）+ 胎牛血清（FBS，10%）+ 无动物来源L-谷氨酰胺（1 mM）+ 非必需氨基酸（NEAA，1%）+ 青霉素/链霉素（1%）+ β-巯基乙醇（0.1 mM）+ 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，每次换液时新鲜添加，10 ng/ml）+ 抗坏血酸（每次换液时新鲜添加，50 μg/ml）。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于12 ml重编程培养基中。将细胞悬液每孔2 ml接种至6孔板中的饲养层细胞（如第3节所述制备）。在室温下以50&#160;× g离心30分钟。</li>
	<li>将培养板置于加湿的37 °C培养箱中（5% O2、5% CO2 和90% N2）进行培养。每隔一天更换一次重编程培养基，直至出现iPSC克隆（约1–2周）。</li>
	<li>配制hESC培养基：DMEM/F12（1:1）+ Knockout血清替代物（20%）+ 青霉素/链霉素（1%）+ NEAA（1%）+ 无动物来源L-谷氨酰胺（1 mM）+ 丙酮酸钠（1%）+ 碳酸氢钠（0.12%）+ β-巯基乙醇（0.1 mM）+ bFGF（每次换液时新鲜添加，10 ng/ml）。</li>
	<li>配制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂：丁酸钠（每次换液时新鲜添加，100 μM）、辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA，每次换液时新鲜添加，200 nM）。一旦出现iPSC克隆，开始使用含HDAC抑制剂的hESC培养基喂养细胞，每天更换培养基。 
	注意：丁酸钠为小分子化合物，易吸附于塑料管壁，因此应将其储存于硼硅酸盐玻璃管中，并置于4 °C保存。</li>
</ol>
5. 分离iPSC克隆
<ol>
	<li>当iPSC集落足够大可进行分离时（20-25个细胞），用P20移液器挑取。</li>
	<li>制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂：丁酸钠（换液时新鲜添加，100 μM）、SAHA（换液时新鲜添加，200 nM）</li>
	<li>将分离的克隆接种至含有 hESC 培养基 + HDAC 抑制剂 + 克隆辅助剂的 35 mm 培养皿中的 iMEFs 上 &amp;#38; 恢复补充剂</li>
	<li>挑取克隆的次日，将培养基更换为hESC培养基加HDAC抑制剂。</li>
	<li>每天更换培养基，直至iPSC集落准备好进行传代。</li>
	<li>传代2-3次后，当克隆稳定时，从培养基中去除HDAC抑制剂。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

采用本方案成功生成iPSC时，需注意以下几个关键事项。在红细胞母细胞扩增阶段，必须严格遵守培养基更换时间表，因为偏离该流程可能导致目标前体细胞群体刺激不足，从而降低iPSC的生成效率。每次更换培养基时，必须使用新配制的含新鲜地塞米松的扩增培养基；QBSF-60基础培养基和地塞米松在储存期间应避光保存。在核转染过程中，使用DPBS洗涤至关重要，目的是去除细胞悬液中可能引起核转染仪电流电弧的过量溶质，否则会导致大量细胞死亡。核转染后约10天，应每天观察培养板中iPSC克隆的出现情况。一旦出现多个小型克隆，应将重编程培养基更换为hESC培养基（含HDAC抑制剂），因为长期暴露于血清中可能诱发自发性分化。
根据实验室的配置和可用资源，可对本方案进行适当调整。我们倾向于采用低 O₂2 培养箱，因为低氧条件已被证明可提高诱导多能干细胞（iPSC）的生成效率13；然而，我们在使用含5% CO的常氧条件下，已成功从外周血中生成iPSCs2因此，标准的加湿CO₂2 也可使用培养箱。本方案中使用的小鼠胚胎成纤维细胞...

iPSC 来源于体细胞组织，通过异位表达一组最少数量的多能性基因获得。该技术最初通过逆转录病毒将人成纤维细胞转导 OCT4, SOX2, KLF4, 和 cMYC在多能性状态下高表达的基因1这些瞬时表达的“重编程因子”会改变靶细胞的表观遗传景观和基因表达谱，使其类似于人类胚胎干细胞2一旦生成，诱导多能干细胞（iPSCs）理论上可分化为任何类型的组织，用于进一步研究。因此，它们在再生医学、疾病建模和基因治疗应用中具有广阔前景。然而，使用整合型病毒对基因组进行干扰可能改变内源性基因表达、影响细胞表型，并最终导致科学结果出现偏差。此外，病毒的随机整合可能引发有害的细胞效应，包括恶性转化的风险。3 或癌基因转染基因的重新表达4未来的临床应用将需要非整合型iPSC的生成。
附加体（episomes）是一类染色体外的环状DNA分子，可作为一种生成成本较低且无整合的诱导多能干细胞（iPSCs）的策略5。如表1所示，所用的附加体载体共同表达重编程因子OCT4, SOX2, KLF4, MYCL和LIN28A。pCXLE_hOCT3/4-shp53-F质粒还包含一段p53的短发夹RNA（shRNA），用于暂时抑制TP53基因表达，从而增强细胞重编程效率6。复制缺陷型的pCXWB-EBNA1载体通过短暂提高EBNA1的表达水平，促进重编程因子的扩增并提高重编程效率7。pCXLE_EGFP质粒可加入电转染混合物中，用于评估转染效率或进行细胞分选。除pCXWB-EBNA1外，本实验方案所用的附加体质粒均含有EB病毒（Epstein-Barr virus）的病毒复制起始位点及EBNA1基因，这些元件介导附加体在宿主细胞分裂过程中的复制与分配8。随着iPSC的连续扩增，这些附加体会自发丢失7。通过亚克隆并鉴定已丢失附加体载体的iPSC系（可通过eGFP表达的缺失推断），可获得完全无外源基因整合的iPSC，为未来的临床应用奠定基础。
诱导多能干细胞（iPSC）生成过程 inherently 伴随着谱系特异性基因的抑制以及多能性相关基因的重新激活。基因表达的调控在细胞核内多个层次上进行，包括对 DNA 和染色质的修饰，以允许转录因子、调控性 DNA 元件以及 RNA 聚合酶接近靶基因。通过全局性染色质修饰重塑表观遗传景观，是多能性遗传程序重新表达的关键环节。其中一种重要的染色质修饰是在特定赖氨酸残基上对组蛋白进行乙酰化，该修饰可降低组蛋白-DNA 螺旋的张力，从而开放靶基因的可及性。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是一类小分子化合物，已被证实可增强 iPSC 重编程效率以及人胚胎干细胞（hESC）的自我更新能力9,10，可能是由于支持乙酰化状态所致11. 下述方案改编自先前使用整合型慢病毒的研究文献12，提供了一种利用附加体和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC抑制剂）从外周血中优化诱导多能干细胞（iPSC）生成的逐步方法。此处使用的HDAC抑制剂浓度为Ware等人所述浓度的一半。 等9，且通常可使完全重编程的iPSC克隆数量相比标准的附加体质粒重编程方案（不含HDAC抑制剂）提高2倍。该重编程效率与我们使用慢病毒方法所观察到的效率相当。采用本方案，我们已成功高效地从年龄高达87岁的个体中获得了iPSC。

<table><tbody><tr><td>菲可尔-帕克 PLUS（Ficoll-Paque PLUS）</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>45-001-750</td><td>4 &amp;deg;C 保存。使用前恢复至室温。</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>14190-250</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td> RPMI 1640 培养基</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>11875-093</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>10437028</td><td> -20 &amp;deg;C 保存至使用前。解冻后分装，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>154938</td><td>室温保存。</td></tr><tr><td>无血清 QBSF-60 培养基</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>50-983-234</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>15140122</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>细胞系核转染试剂盒 V（Cell Line Nucleofector Kit V）</td><td>龙沙公司（Lonza）</td><td>VCA-1003</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>2% 明胶溶液</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>G1393</td><td>4 &amp;deg;C 保存，使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中液化。</td></tr><tr><td>汉克氏平衡盐溶液（HBSS）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>14175-103</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>11965-092</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>伊氏改良杜氏培养基（IMDM）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>12440-061</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>25030-081</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA），100X</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>11140-050</td><td>4 &amp;deg;C 保存，避光。</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12 培养基（1:1）</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>SH30023.02</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>无血清替代物（KnockOut Serum Replacement）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>10828-028</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。</td></tr><tr><td>丙酮酸钠，100 mM</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>11360-070</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠，7.5%</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>25080094</td><td>4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>生命技术公司（Life Technologies）</td><td>PHG0263</td><td>用 DPBS 配制成 10 mg/ml 储存液，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>丁酸钠&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>B5887-1G</td><td>用 DPBS 配制成 2000 倍储存液（400 mM），分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>人胚胎干细胞克隆与复苏添加剂（hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement）</td><td>Stemgent 公司</td><td>01-0014-500</td><td> -20 &amp;deg;C 保存至使用前。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>适用于胚胎干细胞的 BD Matrigel</td><td>BD 生物科学公司（BD Biosciences）</td><td>35-4277</td><td>在 4 &amp;deg;C 冰上过夜解冻，使用预冷的移液器吸头分装至预冷的离心管中。 -20 &amp;deg;C 保存至使用前。使用时在 4 &amp;deg;C 解冻并立即使用。</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL 科技公司（STEMCELL Technologies）</td><td>9650</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。</td></tr><tr><td>粉末状抗坏血酸</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>A4403-100MG</td><td>用 DPBS 配制成 5 mg/ml 储存液，无菌过滤后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>重组人干细胞因子（SCF）</td><td>R &amp; D 系统公司（R &amp; D Systems）</td><td>255-SC-010</td><td>用 SFEM 配制成 100 &amp;mu;g/ml 储存液，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>重组人白细胞介素 3（IL-3）</td><td>R &amp; D 系统公司（R &amp; D Systems）</td><td>203-IL-010</td><td>用 SFEM 配制成 100 &amp;mu;g/ml 储存液，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>促红细胞生成素（EPO）</td><td>R &amp; D 系统公司（R &amp; D Systems）</td><td>287-TC-500</td><td>用 SFEM 配制成 1000 U/ml 储存液，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>重组人胰岛素样生长因子 1（IGF-1）</td><td>R &amp; D 系统公司（R &amp; D Systems）</td><td>291-G1-200</td><td>用 SFEM 配制成 100 &amp;mu;g/ml 储存液，分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>M7522</td><td>用 DPBS 配制成 1000 倍储存液（100 mM）。</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）</td><td>D4902-25MG</td><td>用 DPBS 配制成 50 倍储存液（50 &amp;mu;M），无菌过滤后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>SAHA（伏立诺他）</td><td>Cayman 化学公司（Cayman Chemical）</td><td>149647-78-9</td><td>用 DPBS 配制成 2000 倍储存液（400 mM），分装后于 -20 &amp;deg;C 冻存。解冻后 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>Sarstedt 公司</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 离心管</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 组织培养板</td><td>BD 生物科学公司（BD Biosciences）</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 一次性血清移液管</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 一次性血清移液管</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 一次性血清移液管</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l 移液器吸头，带滤芯</td><td>Genesee 公司</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene 公司</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene 公司</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene 公司</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene 公司</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene 公司</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

利用附加体和hdac抑制剂从血液中高效生成ips细胞

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

本论文阐述了一种利用附加体型质粒和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，从外周血高效制备无整合的人诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。该方法的优势包括：（1）仅需少量外周血作为起始材料；（2）使用非整合型重编程载体；（3）成本较低，可用于生成无载体残留的iPSCs；（4）仅需一次转染；（5）利用小分子化合物促进表观遗传重编程。简言之，从常规静脉采血样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在特定生长因子条件下培养，以获得高度增殖的红系祖细胞群体，该细胞群体对重编程具有极高的敏感性。通过单次核转染，将表达OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A以及p53短发夹RNA（shRNA）的非整合、非传播型附加体型质粒导入上述成红细胞中。共转染一个表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的附加体，可便于转染细胞的识别。此外，反应体系中还加入一种表达Epstein-Barr病毒核抗原1（EBNA1）的复制缺陷型质粒，以增强附加体蛋白的表达水平。转染后的细胞接种于经辐照处理的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）饲养层上，以继续重编程过程。在核转染约12天后，一旦出现类似iPSC的克隆，即向培养基中添加HDAC抑制剂，以促进表观遗传重塑。我们发现，加入HDAC抑制剂通常可使完全重编程的iPSC克隆数量提高2倍。当iPSC克隆呈现出典型的人胚胎干细胞（hESC）形态时，即可将其轻柔地转移至单独的、涂有iMEFs的组织培养板中，进行后续的生长与扩增。

在进行核转染后三天，以及将核转染的细胞接种到iMEFs之前，应通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况，以评估核转染的成功效率。图1展示了一次典型的核转染实验，其中约有5-10%的细胞群体表达eGFP。
转染后约两周，重编程的诱导多能干细胞（iPSC）克隆将开始出现。这些克隆通常呈圆形，边界清晰，可根据人胚胎干细胞（hESC）的典型形态特征进行识别，包括：（1）细胞体积小、排列紧密，核质比高；（2）可见核仁（图2，明场）。未完全重编程的细胞会退化或形成异质性细胞团，易于与真正的iPSC克隆相区分。
在我们选择进行完全表征的代表性细胞系中，所有细胞系均表达标准的多能性标志物（图2），可重新激活内源性多能性基因（图2），并在注射到NOD-SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。
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本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

本文介绍了一种利用外周血高效制备无整合的人诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案，采用……

以下实验的总体目标是从少量外周血中生成无整合的诱导性多能干细胞。该目标通过在特定生长因子条件下培养分离的外周血单个核细胞，获得对重编程高度敏感的红系祖细胞群体来实现。第二步，通过核转染将携带重编程基因的非整合型附加体质粒导入成红细胞，以启动重编程过程。接下来，将转染后的细胞接种到一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞上，以支持其持续重编程并最终成功。重编程获得的诱导性多能干细胞克隆可根据其形态学特征、碱性磷酸酶活性、多能性标志物的免疫化学染色阳性结果以及内源性多能性基因的表达情况进行鉴定。与现有的病毒介导重编程等方法相比，该技术的主要优势在于本方案能够稳定地生成无整合的诱导性多能干细胞。今天将由 Jesse、我本人以及 Gretchen Johnson 演示该实验流程。实验人员在实验室中首先将外周血以1:1的比例用DPBS稀释。然后，在一个15毫升的圆底聚苯乙烯试管中，小心地将7毫升稀释后的血液叠加到3毫升室温的Ficoll-Paque上。在400 ×g和室温条件下离心分离30分钟后，PBMC将沉降在血浆与Ficoll-Paque之间的乳白色界面层中。使用无菌移液管将外周血单个核细胞（P BMCs）转移至一个15毫升锥形管中，并用新鲜的DPBS补足体积至10毫升。细胞计数后，将两份各10的6次方个P BMCs转移至一个新的15毫升锥形管中，其余细胞离心沉淀，将沉淀细胞以每毫升含两乘以10的6次方个外周血单个核细胞（pbmc）的浓度，悬浮于含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜的冻存液中并冻存。随后，对之前保留的P BMCs进行离心沉淀，将沉淀物重悬于2毫升新鲜配制的扩增培养基中，接种至12孔组织培养板的一个孔内，在37摄氏度、湿度饱和的培养箱中孵育，培养箱气体环境为5%氧气、5%二氧化碳和90%氮气。然后在第3天和第6天，通过收集孔中的细胞更换培养基。用2 mL QBSF 60洗涤孔，以收集残留的细胞，经离心沉淀细胞后，将沉淀重悬于2 mL新鲜扩增培养基中。随后将细胞返回至同一12孔板，继续培养。在第9天，按照表格中所述，将重编程质粒用移液器加入无菌的1.5 mL离心管中。接下来，将核转染溶液与制造商提供的添加剂混合，并将混合液转移至无菌的1.5毫升离心管中。然后，将2毫升扩增培养基加入一个新的12孔板的其中一个孔中，并在37°C湿化培养箱中平衡培养基，直至细胞准备就绪。收集细胞，按前述方法洗涤细胞培养孔，并用5毫升DPBS洗涤细胞。然后，将细胞沉淀重悬于 100 µL 核转染溶液（含补充剂）中，注意避免产生气泡，并将细胞悬液转移至含有重编程质粒的离心管中。用移液器轻柔吹打上下混匀一次，将全部溶液转移至核转染杯底部。随后，将转染杯放入核转染仪中，运行程序 T 0 1 9。现在向核转染小管中加入 100 µL 已平衡的扩增培养基，并立即收集全部样品，避免吸取任何白色漂浮的死细胞碎片，将其接种至预温培养基的孔中。然后在第 10 天或第 11 天将细胞重新放回湿润培养箱中。用 1 mL 含 0.1% 明胶的 HBSS 将六孔组织培养板的每孔包被，然后将板置于湿润培养箱中孵育至少 5 分钟。在孵育期间，将一管解冻的、经两次 3000 厘拉德辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）转移至 10 mL 预温的甲基纤维素培养基中，随后离心细胞，同时让细胞沉淀下来。吸出六孔板中的明胶溶液，然后将细胞用 12 毫升新鲜的 Meth 培养基重悬。立即将 2 毫升 OFMs 分装至经明胶包被的六孔板各孔中，并将该板放回加湿培养箱中，继续培养至第 12 天。第12天，将孔中的核受影响细胞收集至一个15毫升锥形管中，并按演示方法洗涤孔板以收集残留的细胞。离心沉淀细胞后，将细胞沉淀重悬于12毫升新鲜配制的重编程培养基中，并将2毫升细胞悬液分装至每孔饲养细胞中。在六孔板中，随后以75 ×g在室温下离心30分钟，然后将板放回湿润培养箱中，每隔一天更换一次培养基，持续一到两周。一旦诱导性多能干细胞克隆出现，应在核转染后三天并接种前，开始用新配制的含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的人类胚胎干细胞培养基喂养细胞，将核转染后的细胞接种到可诱导的饲养层上。成功的核转染效率应通过荧光显微镜进行评估；例如，EGFP的表达情况如图所示，典型的核转染实验中，约有总细胞群体的5%至10%表达EGFP。重编程后的诱导性多能干细胞克隆通常在核转染后约两周开始出现。这些克隆通常呈圆形，边界清晰，可根据其典型的人类胚胎干细胞形态特征进行识别，包括细胞小、排列紧密、核质比高以及可见的核仁，这些均为已完全鉴定的代表性细胞系的特征。所有测试均显示碱性磷酸酶活性阳性，表达标准的多能性标志物，并可重新激活内源性多能性基因。一旦掌握，该技术可在四周内稳定生成无整合的诱导多能干细胞（iPSC），前提是操作正确。在此基础上，可进一步开展分化研究，以探讨任何组织类型的相关科学问题。

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科研

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Biology

生物学

从血液高效的iPS细胞生成使用附加体和HDAC抑制剂

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。...

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

本方案通过强制表达转录因子GATA2、GFI1B和FOS，诱导人皮肤成纤维细胞启动造血程序，从而生成造血干细胞和祖细胞。...

通过强制表达转录因子实现人成纤维细胞的造血重编程

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本方案详细介绍了针对患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导多能干细胞（iPSC）建系过程中难以按照制造商说明书进行重编程时的故障排除步骤。该方案主要适用于冻存的血沉棕黄层样本，但也可用于纯化的PBMC细胞的重编程。...

从冻存的血沉棕黄层样本重编程诱导多能干细胞系

学习使用附加体载体和组蛋白去乙酰化酶抑制剂从外周血高效生成无整合诱导多能干细胞的方法。该技术通过核转染将重编程基因导入红细胞前体细胞，避免病毒载体带来的插入突变风险，适用于再生医学研究。

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

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