从血液高效的iPS细胞生成使用附加体和HDAC抑制剂
2014年10月28日
在这里，我们描述了一种协议，用于使用基于附加体重编程的策略和组蛋白脱乙酰酶抑制剂的外周血产生的诱导的人多能干细胞。
以下实验的总体目标是从少量外周血中产生自由整合诱导多能干细胞。这是通过在确定的生长因子中培养分离的外周血单核细胞来实现的，以产生对重编程非常敏感的红细胞祖细胞群。作为第二步，携带重编程基因的非整合游离质粒通过核影响引入成红细胞以启动重编程过程。
接下来，将受细胞核影响的细胞接种到一层辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上，以允许继续重编程，最终成功。可以根据其形态学特征、碱性磷酸酶活性、多能性标志物的阳性免疫化学和内源性多能性基因的表达来识别重编程诱导多能干细胞集落。与基于病毒的重编程等现有方法相比，该技术的主要优点是该协议可确保一致地生成无整合的 IPSC 今天演示该程序的是 Jesse、我自己和 Gretchen Johnson。
实验室技术人员首先在 DPBS 中以 1：1 的比例稀释外周血。然后在 15 毫升圆底聚苯乙烯管中，小心地将 7 毫升稀释的血液分层到 3 毫升室温 fi for hi pack 上。在 400 GS 和室温下分离样品 30 分钟后，PBMC 将沉淀在血浆和 fial 高填料之间的浑浊白色界面层中。
使用无菌移液管，将 P BMC 转移到 15 毫升锥形管中，并使用新鲜 DPBS 将体积增加到 10 毫升。然后，在计数细胞后，将 2 乘以 10 的浓度转移到 6 个 P BMC 中，放入新的 15 毫升锥形管中，并旋转剩余的细胞，将沉淀的细胞以 2 乘以 10 的浓度冷冻至每毫升 6 PBMC，溶于 90% 含 10% 二甲基亚砜的胎牛血清中。然后，在旋转搁置的 P BMC 后，我们将沉淀悬浮在两毫升新鲜制备的扩增培养基中，并将它们接种到 12 孔组织培养板的一个孔中，将细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中孵育，气氛为 5%氧气、5% 二氧化碳和 90% 氮气。
然后在第 3 天和第 6 天，通过从孔中收集细胞来更换培养基。用 2 毫升 QBSF 60 洗涤孔以收集任何剩余的细胞，通过离心沉淀细胞，然后将沉淀悬浮在 2 毫升新鲜扩增培养基中。然后将细胞放回相同的 12 孔板中并继续孵育第 9 天，将重编程质粒移液到表中所示的无菌 1.5 毫升 einor管中。
接下来，将 nucleo 情感溶液与制造商提供的补充剂混合，并将混合物转移到无菌的 1.5 毫升倒置 DPH 管中。然后将 2 mL 扩增培养基分配到新的 12 孔板的一个孔中，并在加湿的 37 摄氏度培养箱中平衡培养基，直到细胞准备好。收集细胞，如刚才所示充分洗涤细胞培养物，并在 5 ml DPBS 中洗涤细胞。
然后复苏，将细胞沉淀悬浮在 100 微升 Nucle 情感溶液和补充剂中，注意避免产生气泡，并将细胞悬液转移到含有重编程质粒的试管中。通过上下吹打一次来混合细胞，然后将整个溶液转移到 nucle affection vete 的底部。然后将 vete 放入 Nucle 情感机并运行程序 T 0 1 9。
现在向细胞核感染容器中加入 100 μL EQUILIBRATED 扩增培养基，并立即收集整个样品，避免任何白色漂浮的死细胞碎片，并将其沉积到预热培养基的孔中。然后在第 10 天或第 11 天将细胞放回加湿培养箱中。在六孔组织培养板的每个孔中涂上明胶和一毫升 0.1% 明胶的 HBSS 溶液，然后将板放入加湿培养箱中或在孵育过程中至少五分钟将一小瓶解冻，两次乘以 10 次到六个 3000 摄氏度辐照的小鼠、胚胎、成纤维细胞或 MES 中放入 10 毫升预热的冰毒培养基中， 然后在细胞旋转时离心细胞。
从六孔板中吸出明胶溶液，然后将 MES 重悬于 12 毫升新鲜冰毒培养基中。立即将 2 毫升 OFM 分配到明胶包被的每个孔中。六。孔板并将板放回加湿培养箱中，直至第 12 天。
第 12 天，将孔中受细胞核影响的细胞收集到一个 15 mL 锥形管中，按照证明收集任何剩余细胞的方式洗涤孔。离心细胞后，我们将沉淀悬浮在 12 mL 新鲜制备的重编程培养基中，并将 2 mL 细胞分配到饲养层细胞的每个孔中。接下来，在六孔板中，在 75 GS 和室温下离心板 30 分钟，然后将板放回加湿培养箱中，每隔一天更换一次培养基，持续一到两周。
一旦出现可诱导型多能细胞集落，在细胞核感染后 3 天开始用新鲜制备的含有组蛋白脱乙酰酶抑制剂的人胚胎干细胞培养基喂养细胞，在接种前，细胞核受影响的细胞到可诱导的甲基上。成功的 NU 核感染的效率应通过荧光显微镜估计，例如，对于 EGFP，这里显示的是一个典型的细胞核感染实验，其中大约 5% 到 10% 的总细胞群表达 EGFP 重编程的诱导多能干细胞集落将在 NU 核感染后大约两周开始出现。菌落通常是圆形的，边界清晰，可以通过其特征性的人胚胎干细胞形态来识别，包括具有高核质比的紧密堆积的小细胞和已完全表征的代表性细胞系的可见核仁。
所有碱性磷酸酶活性检测呈阳性，表达标准多能性标志物，并在掌握后重新激活内源性多能性基因。如果执行得当，这种技术可以在 4 周内始终生成无集成的 IPSC。按照此程序，可以进行分化研究以回答有关任何组织类型的问题。
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概述
本文介绍了一种从外周血生成无整合人类诱导多能干细胞 (iPSCs) 的方案。该方法结合了基于外源体的重编程策略以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，以提高重编程效率。
主要研究组成
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 再生医学
背景
- 诱导多能干细胞 (iPSCs) 对于研究和治疗应用具有重要价值。
- 生成 iPSCs 的传统方法通常涉及整合载体，这可能会带来插入性诱变风险。
- 本方案旨在通过使用非整合外源质体提供更安全的替代方案。
- 外周血是 iPSC 生成的可及来源。
研究目的
- 开发一种从外周血生成 iPSCs 的可靠方法。
- 消除与病毒方法相关的基因组整合风险。
- 使用定义的生长因子和抑制剂来提高重编程效率。
使用的方法
- 外周血单核细胞的分离。
- 在定义的生长因子中培养细胞，以获得红细胞前体。
- 通过核移植引入非整合外源质体。
- 将核移植细胞接种到辐射过的胚胎小鼠成纤维细胞上进行重编程。
主要结果
- 通过形态学特征识别出成功的 iPSC 菌落的生成。
- 重编程细胞中检测到碱性磷酸酶活性呈阳性。
- 通过免疫化学证实了多能性标记物的表达。
- 重编程细胞中表达内源性多能性基因。
结论
- 本方案提供了一种生成无整合 iPSCs 的一致方法。
- 将外周血用作起始材料对于临床应用具有优势。
- 该方法最大限度地减少了与基于病毒的重编程技术相关的风险。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
This protocol enables integration-free iPSC generation from minimally invasive peripheral blood samples, addressing a key bottleneck in autologous cell therapy development. By combining episomal reprogramming with HDAC inhibitor-mediated epigenetic enhancement, the method improves reprogramming efficiency and reduces genomic safety concerns. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines by providing a scalable, non-viral source of pluripotent cells for disease modeling and screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using genetically unaltered human iPSCs derived from patient blood.
- Operational Value: Supports biological de-risking through integration-free reprogramming, minimizing confounding genetic alterations in target validation studies.
- Predictive Value: Enhances confidence in phenotypic screening outcomes by providing epigenetically reset cells with stable pluripotency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, transgene-free iPSC lines suitable for reproducible assay development and compound screening.
- Operational Value: Enables scalable expansion of patient-derived cells for high-throughput screening platforms after initial nucleofection and selection.
- Assay Readiness: Generates cells with defined morphology and pluripotency marker expression, facilitating consistent downstream differentiation and functional readouts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by providing patient-matched iPSCs that retain donor genetic background without vector integration.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in disease-relevant human cellular systems prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through reliable modeling of drug effects in epigenetically normalized human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from patient sample acquisition to lead identification through the generation of integration-free iPSCs for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using patient-derived iPSCs that avoid insertional mutagenesis artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready cells with consistent pluripotency and differentiation capacity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of reprogramming efficiency via alkaline phosphatase activity, pluripotency marker expression, and colony morphology.
- Translational Research: Facilitates continuity to preclinical work by providing genetically stable human cells for target validation and safety profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-viral reprogramming workflow applicable across multiple donor samples and disease indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through integration-free, epigenetically enhanced iPSC generation reducing mechanistic ambiguity in disease modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined nucleofection parameters, feeder-independent expansion, and HDAC inhibitor timing.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk associated with genomic instability in virally reprogrammed cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates using validated, patient-derived cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection techniques, and episomal vector handling.
- Depends on access to nucleofection equipment, irradiated feeder cells, and GMP-compatible HDAC inhibitors for translational use.
- Necessitates standardization across teams for consistent reprogramming efficiency and quality control of iPSC lines.
- Involves adaptation considerations when extending to alternative blood-derived progenitors or disease-specific cell states.
- Practical limitations include variability in PBMC yield from donor samples and the extended timeline required for colony selection and expansion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Ficoll Separation of PBMCs and Expansion of Erythroblasts Days 0-6
3:17
Reprogramming Cells by Nulceofection Day 9
4:51
Plating Feeder Cells Day 10-11
5:47
Plating Cells on Feeder Cells and Changing Medium Day 12
6:41
Results: Representative Nucleofected and Inducible Pluripotent Stem (iPS) Cells
7:46
Conclusion
