人类多能干细胞的高效分化为心肌细胞，并鉴定流式细胞仪

该程序的总体目标是从多能干细胞中产生高质量的心肌细胞培养物，并使用流式细胞术适当表征最终产物。为了实现这一点，生成了未分化多能干细胞的高质量单层培养物。然后通过使用小分子调节 wind 途径来诱导心肌生成。

接下来，使用专门针对每种抗体优化的条件对心肌细胞进行固定、渗透和染色。最后，通过流式细胞术分析细胞。最终，可以获得结果，显示培养物对心脏标志物 TNNI 3 和 IRX 4 高度阳性，并显示出类似心室的动作电位。

与现有方法（如员工和辫子体）相比，该技术的主要优点是实施相对简单且具有成本效益。此外，该技术产生的细胞培养物每个心肌肌钙蛋白 I 都高度阳性，如果没有其他方案观察到的内部潜在变化和效率，该方法的视觉演示至关重要，因为分化前细胞质量将显着影响分化效率。此外，抗体染色前的固定和渗透性不当将导致流式细胞术结果不理想，证明该程序将是我实验室的研究生 Shabo Bachar。

以下程序最具挑战性的方面是在分化之前保持高质量的未分化多能干细胞。使用生长特性不佳的细胞将显着影响分化效率。从在 6 个 HESC 合格的基质包被培养皿中生长的成熟 HPC 开始此过程。

在显微镜下检查细胞，以确保它们表现出均匀的形态。如果细胞表现出如图所示的神经上皮或成纤维细胞样形态，则不应使用它们。确保细胞在以 75 万个/孔传代时稳健增殖，大约每三天以 75% 汇合度传代，在分化开始前至少五次将解离的细胞传代至单细胞水平。

细胞首先吸出 E 8 生长培养基，然后用 4 毫升 PBS 预热至室温洗涤细胞两次。接下来，向每个孔中加入 1 毫升室温细胞分离溶液，并保持孔不受干扰，直到细胞边界开始变圆。这通常需要 3 到 7 分钟，可以通过肉眼观察并使用显微镜确认。

接下来，使用带球的棉塞玻璃移液器将细胞移出并转移到含有 1 毫升 DM EMF 12 培养基的 15 毫升锥形管中。这将使细胞分离溶液失活。取出 10 微升等分试样的细胞溶液，并在微量离心管中与 10 微升三安蓝混合。

对细胞进行计数，然后收集它们，将 15 毫升锥形管以 130 GS 离心 5 分钟。在室温下，离心过程中使用自动血细胞仪对细胞进行计数。预计未来存活率为 70% 至 80%。

所有细胞数基于总细胞计数，而不是活细胞计数。离心后吸出培养基，将细胞沉淀重悬于 D-M-E-M-F 12 中，终浓度为 0.75 乘以 10 至 6 个细胞/500 微升，向 6 孔板的每个孔中加入 0.5 毫升细胞悬液，其中每个孔含有 2 毫升 E 8 培养基。使用岩石抑制剂，轻轻地从前到后和左右摇动板，以将细胞均匀地分散在孔中。

将细胞放回 5% 二氧化碳和 37 摄氏度的培养箱中。包装后 24 小时。开始每天更换培养基，每孔 2 毫升 E 8，不含岩石抑制剂。

优化接种密度，在分化开始前实现 100% 汇合。在第 0 天，细胞 100% 汇合，形态紧凑，细胞碎片最少。通过将 E 8 培养基替换为 2 mL 分化培养基来开始分化过程。中等。

第一，向每个中加入 1.2 微升 CHIR。在第 1 天和第 2 天，通常会观察到 40% 到 50% 的细胞死亡。然而，附着的细胞将保持紧凑的形态。

在此期间，培养基变为橙色和浑浊。如果观察到粉红色培养基表明细胞死亡过多，则用 triam blue 确认细胞活力，如果细胞死亡超过 70%，则停止使用。否则，在第 1 天，重复用 2 mL 新鲜分化物替换培养基的过程。中等。第一，向每个孔中加入 1.2 μL CHIR，并在第 2 天至第 3 天更换为新鲜的分化培养基。

第一，在第 3 天到第 4 天，细胞将恢复，密度将在第 4 天增加。用新鲜的分化物替换每个孔中的培养基。中等 1 号和 1 微升 IWR 1。

在第 5 天到第 6 天，细胞死亡最少，第 5 天可能开始出现致密的斑块，用新鲜分化替换培养基。1 号培养基，并在第 6 天到第 7 天向每个孔中加入 1 微升 IWR 1，用新鲜分化替换培养基。中等第一。

到第 7 天到第 8 天，实现了汇合的单层，其紧凑的形态散布着致密的斑块。到第 8 天，细胞将开始自发收缩，第一次收缩通常会在密集的斑块中可见。第 8 天，用新鲜分化物替换培养基。中等。

第二，继续用第二分化培养基替换，在培养期间每隔一天更换一次。到第 10 天时，观察到更强烈的收缩，并将在随后的几天内继续传播到整个培养物中。该视频显示了第 30 天的细胞，此处显示了第 55 天的细胞。

要收集细胞用于流式细胞术，请如前所述进行细胞解离收集和计数。请注意，此时细胞不需要保持无菌。在轻轻涡旋细胞沉淀的同时，向细胞沉淀中滴加 100 μL 固定溶液。

然后将试管在冰上孵育 15 分钟。加入 3 毫升细胞洗涤液，离心后离心收集细胞，涡旋时吸出溶液。像以前一样，向细胞沉淀中滴加 100 微升可渗透溶液。

然后将试管在冰上孵育 30 分钟。加入 3 mL 细胞洗涤液。通过离心收集细胞并吸出溶液。

渗透后重复总共两次洗涤。按照随附文件所述，使用 P 1000 移液器在 400 μL 细胞维持溶液中对细胞进行抗体染色，并通过上下移液将其解聚。接下来，用 50 μL 细胞维持溶液预润湿圆底管上的细胞过滤器盖。

将管子放在冰上。细胞过滤器盖可防止细胞聚集体堵塞流式细胞仪。接下来，将细胞溶液转移到细胞过滤器盖上，让细胞悬液在重力作用下排出。

在工作台上轻轻敲击试管底部，以便将细胞收集到试管中。尽快将试管放回冰上。用 250 μL 细胞维持液冲洗过滤器，以确保细胞的最大回收率。

将细胞保持在冰上并保护它们避光，直到通过流式细胞术分析它们以确定产生的心肌细胞的质量。使用该方案，细胞分化 10 天，并用针对 TNNI 3 a、泛心肌细胞标志物、TNNT 2 a 横纹肌标志物和 IRX 4 A 室性心肌细胞标志物的抗体染色。请注意，针对每种抗体的固定和渗透条件进行了优化，以达到阳性细胞的最大百分比。

直方图显示，99% 的门控细胞 TNNI 3 阳性，96% 的 IRX four 阳性。此外，这些细胞对心脏分化的其他标志物高度阳性，包括 TNNT 2、MLC 2 V 和 MLC 2。请注意，关于心肌细胞纯度和细胞身份的断言基于 TNNI 3 和 IRX 4。

染色 MC two V 和 MC two A 在发育过程中不受腔室限制，TNNT 2 也存在于骨骼肌中。此处显示的动作电位是在分化第 46 天使用全细胞膜片钳从单个自发收缩的心肌细胞中记录的。动作电位曲线表明获得了心室样心肌细胞。

还观察到一小部分节点状剖面。观看此视频后，您应该对如何从多能干细胞生成高质量的心肌细胞培养物以及如何通过流式细胞术对其进行表征有很好的了解。通常，刚接触这种方法的个体会遇到困难，因为在分化开始之前将干细胞维持为高质量的单层细胞会遇到共同的挑战。

不要忘记，使用固定剂可能是危险的和私人的。执行此程序时应始终佩戴防护设备，例如实验室外套或手套。